发酵工程实验五 一级种子的制备
发酵工程第五章发酵工业种子制备
面包酵母时的种子扩大培养的程序
丝状真菌发酵的种子扩大培养
丝状真菌既可以利用孢子，也可以 利用菌丝体作为接种物接种到发酵罐
进行发酵
利用孢子作为接种物
在固化的培养基上产生孢子 “滚瓶”技术应用于产黄青霉的孢子生产 在固体培养基上产生孢子 在谷类的颗粒表面形成大量的孢子 在液体深层培养基中产生孢子 灰黄霉素产生菌展青霉一试验表明在良好的 通气条件下，培养基中含氮是在0.05～0.1％ （w/v）之间时，可以产生大量的孢子
放射形土壤杆菌多糖（ARPS） 发酵过程中不同的接种龄对多糖产量的影响
接种种龄和接种量
接种量：移入的种子液体积和接种后培养液 体的体积的比例
接种量过多，菌丝生长过快、溶氧不足，衰 老细胞增加等，发酵后劲不足
种量过少延长发酵周期，形成异常形态，而 且易造成染菌。
以生产菌种在发酵罐中的繁殖速度为依据 接种量的大小直接影响发酵周期。
链霉素生产中，斜面孢子在6℃冷藏两 个月后的发酵单位比冷藏一个月的降低18％， 比冷藏3个月的降低35％。
培养基
培养种子的目的：
扩大培养，增加细胞数量； 同时也必须培养出强壮、健康、活性
高的细胞。为了使细胞迅速进行分裂 或菌丝快速生长。
种子培养基特点
有较完全和丰富的营养物质，糖分少，需充足 氮源和生长因子，无机氮源比例大； 各种营养物质的浓度不必太高； 供孢子用的种子培养基，可添加易被吸收利 用的碳源和氮源；
丝状真菌的菌丝体作为接种物
不能产生无性孢子的用繁殖体菌丝作 为接种物，如生产赤霉素的菌种—— 藤仓赤霉
问题：难以获得均一的接种物 接种前将菌丝打成碎片，形成大量的
菌丝段，它具有大量的生长点
发酵工业种子的制备.ppt
孢子培养时注意湿度，子斜面使用一般不超过1个月
（三）生产车间种子制备阶段
在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量 的菌丝体。
菌丝体比孢子要有利： 缩短发酵时间 有利于获得好的发酵结果
3、接种量的确定
移入种子的体积 接种量 ＝ —————————
接种后培养液的体积
❖ 接种量过多，菌丝生长过快、溶氧不足，衰老细胞增加等， 发酵后劲不足
❖ 种量过少延长发酵周期，形成异常形态，而且易造成染菌 ❖ 以生产菌种在发酵罐中的繁殖速度为依据 ❖ 接种量的大小直接影响发酵周期
4、种龄
种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子 罐或发酵罐时的培养时间。
三、种子质量的判断方法
❖ 通常检测的培养液中参数
➢ pH是否在种子要求的范围之内 ➢ 糖、氨基氮、磷酸盐的含量 ➢ 菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观 ➢ 有无杂菌污染
❖ 其他参数，如接种前酶活、种子罐的溶氧和尾 气等
四、种子制备技术概要
❖ 步骤：
➢ 斜面培养基中活化； ➢ 扁瓶固体培养基或摇瓶培养基中扩大培养，完成实
谷氨酸：三级发酵 一级种子（摇瓶）→二级种子 （小罐）→发酵
青霉素：三级发酵 一级种子 （小罐）→二级种子（中罐）→发酵
一级种子接入发酵罐发酵称为二级发酵 二级种子接入发酵罐发酵称为三级发酵
。。。。。。。
依次类推 可知发酵的级数=种子级数+1
• 种子罐级数的意义： 种子罐级数越少，越有利于简化工艺和控制，
并可减少移种带来染菌机会。 但也必须考虑尽量延长发酵罐生产产物的时间，
缩短由于种子发芽、生长而占用的非生产时间， 以提高发酵罐的生产率。因此，种子罐级数不宜 过少。
发酵种子制备与发酵机制
湿度
❖ 湿度低，孢子生长快； ❖ 湿度大，孢子生长慢
制备土霉素生产菌种龟裂链霉菌孢子时 发现，在含有少量水分的试管斜面培养基下 部孢子长得较好，而斜面上部由于水分迅速 蒸发呈干瘪状，孢子稀少
通气与搅拌
❖ 足够的通气量，以保证菌种代谢正 常，提高种子的质量
➢ 应考虑与发酵培养基的主要成分相近。
pH
❖ 选择最适种子培养pH的原则是获得 最大比生长速率和适当的菌量
❖ 培养最后一级种子的培养基的pH应 接近于发酵培养基的pH，以便种子 能尽快适应新的环境
种龄与接种量
❖ （一）种龄
➢ 种子罐中培养的菌体从开始移入下一级种 子罐或发酵罐时的培养时间
➢ 种子培养期应取菌种的对数生长期为宜， 菌种过嫩或过老，不但延长发酵周期，而 且会降低产量。
注意事项 ① 适合采用碳源限量而氮源丰富的培
养基 ② 培养温度多为37 ℃ ，少数为28
℃ ，培养时 间细菌菌体为1~2天， 产芽孢的细菌为5~10天
II.种子制备
概念：指将固体培养基上培养出的孢 子或菌体转入到液体培养基种培养， 使其繁殖成大量菌丝或菌体的过程。
摇瓶种子 ＋ 种子罐种子
1. 摇瓶种子制备
一是成本
二是驯化
例：柠檬酸发酵 （黑曲霉）
以蔗糖为原料
成分
斜面
麦芽汁 蔗糖
NH4NO3 K2HPO4 MgSO4.H2O KCl 琼脂
麦汁 2%
种子罐 发酵
2.5-5% 0.225% 0.03% 0.025%
20% 0.11%
0.025% 0.015%
薯干粉
成分
麦芽汁 薯干粉 (NH4)2SO4 琼脂
第五章 发酵工业的种子制备 2
第五章发酵工业的种子制备内容提要•种子制备原理和技术•影响种子质量的因素•种子质量的控制措施•工业微生物培养的类型一、种子扩大培养1、种子扩大培养的任务工业生产规模的增大需要种子就增多种子的扩大培养种子扩大培养的任务，不但要得到纯而壮的培养物，还要获得活力旺盛的、性能稳定、接种数量足够的、纯的培养物。
2、菌种扩大培养的目的为发酵罐的投料提供足够数量的代谢旺盛的种子。
因为发酵时间的长短和接种量的大小有关，接种量大，发酵时间则短。
将较多数量的成熟菌体接入发酵罐中，就有利于缩短发酵时间，提高发酵罐的利用率，并且也有利于减少染菌的机会。
对于不同产品的发酵过程来说，必须根据菌种生长繁殖速度快慢及生产的规模决定种子扩大培养的级数。
对于不同产品的发酵过程来说，必须根据菌种生长繁殖速度快慢来决定种子扩大培养级数。
抗生素生产中，放线菌的细胞生长繁殖速度较慢，常常用三级种子扩大培养，即将种子罐中之菌丝移植到较大的种子罐中扩大培养后，再移入发酵罐中，这种流程称为三级种子四级发酵一般50t发酵罐多采用三级发酵，有的甚至采用四级发酵，如链霉素生产。
有些酶制剂发酵生产也采用三级发酵。
而谷氨酸及其他氨基酸发酵所用的菌种是细菌，生长繁殖速方式很快，所以采用二级发酵。
一级种子二级发酵的流程如下：斜面菌种→一级种子摇床培养→二级种子罐培养→发酵罐二、种子制备原理与技术种子培养：指冷冻干燥管、沙土管中处于休眠状态的工业菌种，接入试管斜面活化后，再经过摇瓶及种子罐逐级扩大培养，而获得一定数量和质量的纯种的过程。
其中的纯培养物就称为种子。
不同的发酵产品和菌种，种子制备的方法与条件不同。
要根据目的菌种的生理特性，选择合适的培养条件来获得优良的种子。
1、优良种子应具备的条件①、菌种细胞的生长活力强，转移至发酵罐后能迅速生长，延迟期短；②、菌种生理状态稳定（如菌丝生长速率、种子培养液的特性等）；③、菌体浓度及总量能满足大容量发酵罐接种量的要求；④、无杂菌污染，保证纯种发酵；⑤、菌种适应性强，能保持稳定的生产能力。
发酵工程 第五章 种子制备
第二节 工业发酵种子的制备
一、实验室种子制备 二、生产车间种子制备
一、实验室种子制备阶段
1. 培养物选择的原则 目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特 点最终的培养物可分为两类：
1.不产孢子和芽孢的微生物 ——获得一定数量和质量的菌体
2.产孢子的 ——获得一定数量和质量的孢子 ——获得一定数量和质量的菌体
双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。
如卡那霉素发酵，双种比单种的产量提高8%。
倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。
如链霉素发酵，倒种法比单种法的产量提高12%。
5、种龄（Cell age）
种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级 种子罐或发酵罐时的培养时间。 种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。 原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相 对较大，但是最终由实验结果定。
三、种子扩大培养的工艺流程
沙土孢子或冷冻干燥孢子→斜面孢子→摇瓶液体培பைடு நூலகம்（茄子瓶斜面培养或固体 培养基培养）→种子罐培养→发酵罐发酵
实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见
设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此形象地将这 些培养过程称为实验室阶段的种子培养。
生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为发酵车
间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。
四、种子扩大培养的方法
1.孢子进罐法：
以孢子形式的种子直接进罐的方法 – 先在固体培养基（固化培养基）上生长繁殖成
大量孢子，将孢子直接接入种子罐扩大培养。 – 优点：一次可以制备较大量的孢子，易于保存。
既可以节省大量的人力、物力和时间，又可减 少杂菌污染的机会。 – 缺点：砂土管或冷冻管的用量大。
发酵工程第五章发酵工业种子制备-文档资料
种子制备原理与技术 影响种子质量的因素
种子质量的控制措施
种子制备的放大原理与技术
种子制备原理与技术
优良种子应具备的条件
生长活力强，延迟期短；
生理状态稳定；
浓度及总量能满足发酵罐接种量的要求； 无杂菌污染，保证纯种发酵； 适应性强，生产能力稳定
种子罐级数的确定
酵母发酵时的种子扩大培养
酿酒酵母的扩大培养
最初采用纯种进行酵母发酵并设计出 酵母繁殖流程，他将每一步的接种量 规定为10％，并控制繁殖条件与酿造 时一致
种子制备过程
实验室种子制备阶段：琼脂斜面至 固体培养基扩大培养（如茄子瓶斜 面培养等或液体摇瓶培养
生产车间种子制备阶段：种子罐扩 大培养
实验室种子制备
无菌方式接保藏的菌种至斜面培养基上，成 熟后挑选正常菌落至试管斜面和摇瓶。 菌种产孢子能力强及孢子发芽、生长繁殖迅 速，可用固体培养基培养孢子
种子液生化分析项目主要有：营养基质的消 耗速度、pH变化、溶氧变化、色泽和气味等
种子制备的放大原理与技术 ຫໍສະໝຸດ 细菌发酵时的种子扩大培养；
细菌发酵过程中种子扩大培养的主要目的是 为了获得大量的活力强的种子 ；
种龄对于生芽孢的种子尤其重要。若接种物 含大量芽孢，将给后续发酵带来较长迟滞期
举 例：
梭状芽孢杆菌发酵丁醇－丙酮时种子扩大培养的程序
种子扩大的级数：制备种子需逐级扩 大培养的次数 级数愈少，愈利于简化工艺及控制， 并可减少种子罐污染杂菌的机会，减 少消毒及值班工作量，减少因种子罐 生长异常而造成的发酵波动。
确定方法
菌种的性质(如菌种传代后的稳定性)
发酵种子制备工艺流程
发酵种子制备工艺流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!发酵种子制备工艺流程。
1. 基质配制。
根据发酵菌株的生长需求，选择合适的基质，如酵母提取物、肉汤等。
发酵工程 5 种子制备
种子扩大培养应根据菌种的生理特性，选
择合适的培养条件来获得代谢旺盛、数量足
够的种子。
优良的种子可以缩短生产周期、稳定产量、 提高发酵效率和设备利用率。
1、菌种的扩大培养的目的
接种量的需要；
菌种的驯化；
缩短发酵时间，提高发酵罐的利用率，以及减
少染菌。
2、作为种子必须具备的条件
1）生命力旺盛，移至发酵罐后能迅速生长，
峰的时间，但接种量过多往往使菌丝生长过快，
培养液粘度增加造成溶解氧供应不足而影响产物
的合成。
6、影响种子质量的因素
1）种子培养基原材料质量：不同产地、不同批 次的麸皮、大（小）米、琼脂等。 2）培养条件：温度、湿度、通气量、搅拌强度、
pH、泡沫等。
3）斜面冷藏时间：斜面冷藏对孢子质量的影响
与孢子成熟程度有关，冷藏时间对孢子的生产
生产过程中通常测定的参数有： 1）检测种子液的pH是否在种子的要求范围内；
2）检测种子液中的糖、氨基氮、磷酸盐的含量；
3）检查种子液中的菌丝形态、菌丝浓度和培养液外
观（色泽、气味、浑浊度、颗粒等）；
4）检查有无杂菌污染；
5）其他参数，如接种前某些酶的活力、种子罐的溶
氧和尾气（CO2、O2）等。
4、种子制备的流程
8、种子异常分析
1）菌种生长发育缓慢或过快
这与孢子质量及种子罐的培养条件有关，一般情
况下，通入种子罐的无菌空气温度低、培养基灭 菌质量差是种子生长、代谢缓慢的主要原因。 2）菌丝结团
菌丝在液体培养条件下成团或菌球。这会影响菌
丝的呼吸及对营养物质的吸收。这与通气搅拌相 关，加入某些表面活性剂如吐温80可促进菌丝 分散。
能力也有影响，通常冷藏时间越长，生产能力 下降越多。
发酵种子制备的工艺流程
发酵种子制备的工艺流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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1. 种子筛选。
挑选饱满、无病害、无杂质的种子。
发酵工程种子制备共38页
种子制备过程
❖ 实验室种子制备阶段：琼脂斜面至 固体培养基扩大培养（如茄子瓶斜 面培养等或液体摇瓶培养
❖ 生产车间种子制备阶段：种子罐扩 大培养
实验室种子制备
❖ 无菌方式接保藏的菌种至斜面培养基上，成 熟后挑选正常菌落至试管斜面和摇瓶。
❖ 菌种产孢子能力强及孢子发芽、生长繁殖迅 速，可用固体培养基培养孢子
本章内容：
种子制备原理与技术 影响种子质量的因素 种子质量的控制措施 种子制备的放大原理与技术
种子制备原理与技术
优良种子应具备的条件 ➢ 生长活力强，延迟期短； ➢ 生理状态稳定； ➢ 浓度及总量能满足发酵罐接种量的要求； ➢ 无杂菌污染，保证纯种发酵； ➢ 适应性强，生产能力稳定
种子罐级数的确定
种子质量的判断方法
❖ 通常检测的培养液中参数 ➢ pH是否在种子要求的范围之内 ➢ 糖、氨基氮、磷酸盐的含量 ➢ 菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观 ➢ 有无尾气等
种子制备
❖ 步骤： ➢ 斜面培养基中活化； ➢ 扁瓶固体培养基或摇瓶培养基中扩大培 养，完成实验室种子制备 ➢ 一级种子罐，制备生产用种子；视情况 确定扩大级数，完成生产车间种子制备； ➢ 种子转种至发酵罐
❖ 提供适宜的生长环境 ❖ 种子无杂菌检查，保证纯种发酵。
种子液生化分析项目主要有：营养基质的消 耗速度、pH变化、溶氧变化、色泽和气味等
种子制备的放大原理与技术
❖ 细菌发酵时的种子扩大培养； ❖ 细菌发酵过程中种子扩大培养的主要目的是
为了获得大量的活力强的种子 ； ❖ 种龄对于生芽孢的种子尤其重要。若接种物
➢ 应考虑与发酵培养基的主要成分相近。
pH
❖ 选择最适种子培养pH的原则是获得 最大比生长速率和适当的菌量
发酵工业种子制备教案
发酵工业种子制备教案标题：发酵工业种子制备教案一、教学目标：1. 了解发酵工业中种子的重要性和作用。
2. 掌握发酵工业种子制备的基本步骤和技术要求。
3. 发展学生科学实验设计和实验操作能力。
二、教学准备：1. 实验室环境和设备：灭菌器、培养基和培养基配制器具、培养皿、移液管、恒温培养箱等。
2. 实验材料：发酵菌株、发酵种子、培养基成分等。
三、教学过程：1. 导入（5分钟）：向学生介绍发酵工业中种子制备的重要性，引发学生的兴趣和探究欲望。
2. 知识讲解（15分钟）：a. 介绍发酵工业种子的定义和作用，让学生了解其在发酵过程中的重要性。
b. 说明种子制备的基本步骤：准备培养基、接种发酵菌株、培养过程中适当控制温度、观察培养结果等。
c. 解释发酵种子的培养基要求，如pH值、碳源、氮源、无机盐等。
3. 实验操作（40分钟）：a. 学生分组，每组分配所需实验材料。
b. 学生按照教师指导，准备培养基，确认培养基是否符合要求。
c. 学生进行发酵菌株的接种操作，注意操作规范和无菌技术要求。
d. 将接种后的培养物放入恒温培养箱，控制适当的温度进行培养。
e. 监测培养物的生长情况，记录观察结果。
f. 学生进行结果分析，讨论实验中可能存在的误差以及改进方法。
4. 实验总结（10分钟）：a. 学生归纳总结种子制备的基本步骤和技术要求。
b. 学生讨论发酵工业中种子制备的应用意义和局限性。
c. 教师给予学生反馈和指导，鼓励他们提出问题和展示实验成果。
五、延伸拓展：根据学生实验结果，可以开展如下拓展活动：1. 探究不同培养基对发酵种子生长的影响。
2. 研究温度变化对发酵种子生长速率的影响。
3. 分析种子制备中可能出现的常见问题，并提出解决方案。
六、教学评估：1. 实验操作过程中学生的操作规范和无菌技术掌握情况。
2. 实验结果的准确性和可靠性。
3. 学生对于种子制备步骤和技术要求的理解程度。
七、教学反思：针对学生在实验过程中可能遇到的难点和疑惑进行及时引导和解答，同时加强对于实验操作规范和安全意识的培养。
5.发酵工业的种子制备
发酵工业种子制备
一 一 种子制备原理与技术
种 优良种子应具备的条件
子
制 ①迟滞期短；②生理状态稳定；③能满足接
备 原 理
种量的要求；④无杂菌污染；⑤生产性能稳 定；
与 技
判断种子质量的指标
术 ①pH值；②种子液的糖、氨基氮、磷酸盐水
平；③种子液形态；④无杂检查；⑤溶氧、
酶活等其他指标；
技 ⑤种子罐与发酵罐的容积比
术
种子罐级数越少，越有利于简化工艺，便于 控制，减少染菌；
发酵工业种子制备
一
种 子
在生产中应注意种龄与接种量
制
备 种龄：过老过嫩都不好，细菌以对数生长期
原 理 与
为宜（霉菌也是），酵母以二倍体细胞为好。 接种量：依据具体的发酵类型和工艺条件而
技 定，过多过少都不好。
术
发酵工业种子制备
子
质 量
②pH值：对微生物有明显的影响。培养基
的 pH调节方法：用酸碱溶液中和法；使用缓
因 素
冲溶液法；使用生理缓冲剂；
发酵工业种子制备
二 ③通气搅拌
影 响
溶解氧的作用：参与菌体呼吸作用;
种 搅拌：促进氧的溶解与营养物质及代谢产物
子 质 量
的扩散。 通气量的多少以溶解氧的多少来衡定。
的 通气过程中，影响溶解氧的因素：
发酵工业种子制备
二 影
3.染菌的控制
响 种
染菌原因：设备、管道、阀门漏损、发酵罐
子 结构“死角”、灭菌不彻底、空气净化不好、
质 量
无菌操作不严、菌种不纯；
的
因
素
发酵工业种子制备 作业题
分析影响种子质量的主要因素。
5_发酵种子制备与发酵机制
本章内容：⏹种子制备原理与技术⏹影响种子质量的因素⏹种子质量的控制措施⏹种子制备的放大原理与技术概念：种子的制备，即菌种的扩大培养就是把保藏的菌种，即砂土管，冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化，再经过扁瓶或摇瓶和种子罐，逐级扩大培养后达到一定的数量和质量的纯种培养过程。
这些纯种的培养物称为种子。
种子扩培的目的❑接种量的需要❑菌种的驯化❑缩短发酵时间、保证生产水平优良种子应具备的条件/种子的要求：生长活力强，延迟期短；(接种后在发酵罐中能迅速生长)生理状态稳定；浓度及总量能满足大容量发酵罐接种量的要求； 无杂菌污染，保证纯种发酵；适应性强，生产能力稳定种子制备原理与技术：一.发酵级数的确定种子扩大的级数：制备种子需逐级扩大培养的次数级数愈少，愈利于简化工艺及控制，并可减少种子罐污染杂菌的机会，减少消毒及值班工作量，减少因种子罐生长异常而造成的发酵波动。
一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数谷氨酸：三级发酵（谷氨酸棒杆菌）一级种子（摇瓶）→二级种子（小罐）→发酵青霉素：三级发酵一级种子（小罐）→二级种子（中罐）→发酵发酵级数确定的依据❑级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响❑级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般2-4级。
❑在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要的一个方面发酵级数确定方法菌种的性质(如菌种传代后的稳定性)瓶中的孢子数，孢子发芽及菌丝繁殖速度发酵罐中种子培养液的最低接种量种子罐与发酵罐的容积比生产规模随工艺条件的改变作适当的调整二.种子质量的判断方法通常检测的培养液中参数pH是否在种子要求的范围之内糖、氨基氮、磷酸盐的含量菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观有无杂菌污染其他参数，如接种前酶活、种子罐的溶氧和尾气等种子制备步骤：斜面培养基中活化；扁瓶固体培养基或摇瓶培养基中扩大培养，完成实验室种子制备一级种子罐，制备生产用种子；视情况确定扩大级数，完成生产车间种子制备；种子转种至发酵罐三.种子制备过程实验室种子制备阶段：琼脂斜面至固体培养基扩大培养（如茄子瓶斜面培养等或液体摇瓶培养生产车间种子制备阶段：种子罐扩大培养种子制备过程概览实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。
5发酵种子制备与发酵机制知识课件
2.霉菌孢子的制备
注意事项
① 天然农产品因具有独特的营养成分 和较大表面积而适合作霉菌的培养基
② 培养温度多为25~28 ℃ ，培养时间为 4~14天
3. 细菌孢子的制备
注意事项 ① 适合采用碳源限量而氮源丰富的培
养基 ② 培养温度多为37 ℃ ，少数为28
℃ ，培养时 间细菌菌体为1~2天， 产芽孢的细菌为5~10天
孢子培养时注意湿度，子斜面使用一般不超过1个月
❖ 其他参数，如接种前酶活、种子罐的溶氧和 尾气等
种子制备
❖ 步骤： ➢ 斜面培养基中活化； ➢ 扁瓶固体培养基或摇瓶培养基中扩大培 养，完成实验室种子制备 ➢ 一级种子罐，制备生产用种子；视情况 确定扩大级数，完成生产车间种子制备； ➢ 种子转种至发酵罐
三.种子制备过程
❖ 实验室种子制备阶段：琼脂斜面至 固体培养基扩大培养（如茄子瓶斜 面培养等或液体摇瓶培养
在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要 的一个方面
发酵级数确定方法
菌种的性质(如菌种传代后的稳定性) 瓶中的孢子数，孢子发芽及菌丝繁殖速度 发酵罐中种子培养液的最低接种量 种子罐与发酵罐的容积比 生产规模 随工艺条件的改变作适当的调整
二.种子质量的判断方法
❖ 通常检测的培养液中参数 ➢ pH是否在种子要求的范围之内 ➢ 糖、氨基氮、磷酸盐的含量 ➢ 菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观 ➢ 有无杂菌污染
优良种子应具备的条件/种子的 要求：
➢ 生长活力强，延迟期短；(接种后在发酵罐
中能迅速生长)
➢ 生理状态稳定； ➢ 浓度及总量能满足大容量发酵罐接种量的要求； ➢ 无杂菌污染，保证纯种发酵； ➢ 适应性强，生产能力稳定
种子制备原理与技术：
发酵工程实验五一级种子的制备
发酵工程实验五一级种子的制备《发酵工程实验》实验五、一级种子的制备一、实验目的1、了解发酵工业菌种的制备过程及质量控制。
2、熟悉发酵实验的一级菌种制备。
二、实验原理菌种制备的主要手段是扩培，其出发点是尽可能培养出高活性的、能满足大规模发酵需要的纯种。
由于现代生产菌种的生产性能已非常高，因此，菌种在培养过程中自发突变往往以负向突变为主，加上平时操作中可能有污染，导致发酵菌种容易退化。
因此，菌种的管理主要有两点：分离纯化和扩大培养。
前者目的为分离出单细胞菌落，保证菌种的性能稳定。
后者目的是为发酵生产提供充足的高活性菌种，分斜面菌种、一级菌种和二级菌种。
在进行各级菌种的扩培时，菌种的质量要达到发酵要求。
比较简单的做法是用显微镜观察细胞的形态是否正常、测定种子培养基的pH 值是否正常及细胞生长繁殖活力等。
三、实验器材与试剂1、菌种实验二中筛选到的-淀粉酶产生菌(酵母)。
2、培养基（W/V）（1）斜面培养基（已制备）（2）摇瓶种子培养基：蔗糖20g/L，蛋白胨5.0g/L，磷酸氢二钠4.0g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，pH为5.0-5.5。
250ml 三角瓶中装培养基50ml，8层纱布封口，0.1MPa 灭菌20min（现用现配）。
四、实验步骤1、斜面接种挑取保藏菌种接种到斜面培养基上，28℃培养24h。
仔细观察斜面菌苔生长情况（菌苔的颜色、边缘等特征是否正常），有无感染杂菌。
2、镜检在无菌条件下，挑取斜面菌苔少许，在载玻片上制成涂片，在显微镜下检查菌苔形态特征，大小、均匀情况。
3、摇瓶培养挑取经镜检确定后的活化斜面菌苔3-5环，接入上述液体培养基中，28℃恒温摇床培养(180rpm)，培养12h。
观察摇瓶菌液外观稠度、静置沉降情况。
镜检菌液中菌体细胞的形态是否正常（大小均匀程度等）及测定培养液中pH。
五、注意事项1、出现污染征象的斜面培养活化菌苔坚决不能使用。
2、菌种的污染，势必导致发酵的失败，轻者产量降低，严重的不积累产物。
第五章发酵工业的种子制备ppt课件
湿度
❖湿度低，孢子生长快 ❖湿度大，孢子生长慢
制备土霉素消费菌种龟裂链霉菌孢子时发现， 在含有少量水分的试管斜面培育基下部孢子长得 较好，而斜面上部由于水分迅速蒸发呈干瘪状， 孢子稀少。
❖ 原资料质量 ❖ 培育温度 ❖ 湿度 ❖ 通气与搅拌
❖ 斜面冷藏时间 ❖ 培育基 ❖ pH
原资料质量
❖ 原资料质量动摇引起种子质量不稳定
❖ 原资料质量动摇的主要缘由：无机离子含量不 同〔微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+能刺激孢子的 构成，磷含量太多或太少也会影响孢子的质量〕
培育温度
❖ 温度过低，菌种生长发育缓慢 ❖ 温度过高会使菌丝过早自溶
❖ 消费车间阶段：种子培育在种子罐里面进展，普 通在工程归为发酵车间管理，因此笼统地称这些 培育过程为消费车间阶段。
〔二〕实验室种子制备阶段
目的：将种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终的 培育物可分为两类：
对于不产孢菌 体对于产孢子的微生物
➢ 获得一定数量和质量的孢子
种子液生化分析工程主要有：营养基质的耗费速度、 pH变化、溶氧变化、色泽和气味等。
第四节 种子制备放大技术实例
一、细菌发酵种子扩展培育 二、酵母发酵种子扩展培育 三、丝状真菌发酵种子扩展培育 四、放线菌发酵种子扩展培育 五、谷氨酸消费种子制备 六、青霉素消费种子制备
一、细菌发酵种子扩展培育
❖ 细菌发酵过程中种子扩展培育的主要目的是为 了获得大量的活力强的种子
五、青霉素消费种子制备
制备过程
安瓿管 → 斜面孢子 → 大米孢子 → 一级种子 → 二级种子 → 发酵
第五章 发酵工业的种子制备
种子罐级数的确定方法
菌种的性质(如菌种传代后的稳定性) 菌种的性质(如菌种传代后的稳定性) 瓶中的孢子数， 瓶中的孢子数，孢子发芽及菌丝繁殖速度 发酵罐中种子培养液的最低接种量 种子罐与发酵罐的容积比 生产规模 随工艺条件的改变作适当的调整
总结： 总结：种子扩培 ——实验室种子制备 ——实验室种子制备
例：青霉素生产菌种
孢子悬浮液
（4-14h） 14h）
一级种子罐
（27℃，40h） ）
二级种子罐
（27℃， 10-24h） ）
发酵罐
实验室种子 制备
孢子进罐法
★ 不产孢子的细菌：获得一定数量和质量的菌体 菌体
保藏斜面
活化斜面
摇瓶培养
种子罐
如生产谷氨酸的棒状杆菌属、短杆菌属
例：谷氨酸棒杆菌
斜面菌种于32℃，培养18~24h 斜面菌种 茄子瓶斜面培养基/1000mL 250mL茄子瓶斜面培养基 茄子瓶斜面培养基 摇瓶液体培养基，32℃培养12h 摇瓶液体培养基 种子罐
种子罐级数：
制备种子需逐级扩大培养的次数。 制备种子需逐级扩大培养的次数。
一级种子罐扩大培养 一级 二级发酵 三级发酵 四级发酵
二级种子罐扩大培养（发芽罐、繁殖罐） 二级 三级种子罐扩大培养：生长更慢的菌种 三级
一级发酵：在小型发酵罐(5~30L)中进行试验时，直接采 一级 用孢子或菌丝体接入罐中发酵
放射形土壤杆菌多糖（ARPS） 发酵过程中不同的接种龄对多糖产量的影响
种龄和接种量
接种量： 接种量：移入的种子液体积和接种后培养液体的体 积的比例
大多数抗生素发酵：7~15% ，有时可达20~25% 有机酸发酵：10% 谷氨酸发酵（棒状杆菌）：1% 肌苷酸发酵1.5~2% 制霉菌素发酵0.1~1%
【发酵工程】第五章_发酵工业种子制备
在液体深层培养基中产生孢子 灰黄霉素产生菌展青霉一试验表明： 在良好的通气条件下，培养基中含氮在0.05 ～0.1％（w/v）之间时，可以产生大量的孢子。
2、丝状真菌的菌丝体作为接种物
不能产生无性孢子的丝状真菌用繁殖体菌丝 作为接种物，如生产赤霉素的菌种——藤仓 赤霉。 问题：难以获得均一的接种物。
4、通气与搅拌
足够的通气量，以保证菌种代谢正常，提高 种子的质量 ； 适度搅拌可提高通气效果，促进生长繁殖， 但过度搅拌导致培养液大量涌泡，液膜表面 的酶易氧化变性，泡沫过多增加染菌机会， 增加能耗。
丝状微生物不宜剧烈搅拌。
5、斜面冷藏时间
对孢子的生产能力有较大影响；； 冷藏时间越长，生产能力下降越多。
一、细菌发酵时的种子扩大培养
细菌发酵过程中种子扩大培养的主要目的是 为了获得大量的活力强的种子 ；
种龄对于生芽孢的种子尤其重要。若接种物 含大量芽孢，将给后续发酵带来较长迟滞期
举
例：
梭状芽孢杆菌发酵丁醇－丙酮时种子扩大培养的程序
二、酵母发酵时的种子扩大培养
酿酒酵母的扩大培养
Hansen最初采用纯种进行酵母发酵并设计 出酵母繁殖流程，他将每一步的接种量规 定为10％，并控制繁殖条件与酿造时一致。 现代的流程中，接种量为1%或更低，控制 的条件也与酿造时不同。
菌种产孢子能力不强或孢子发芽慢，可用摇 瓶液体培养法培养菌丝，作为种子。
不产孢子的菌种，将斜面营养细胞保藏的菌 种，在一定温度下活化，即可移入液体培养 基培养，作为种子。
种子扩大培养阶段
液体培养法：试管、三角瓶摇床振荡或回 旋式液体培养。
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《发酵工程实验》
实验五、一级种子的制备
一、实验目的
1、了解发酵工业菌种的制备过程及质量控制。
2、熟悉发酵实验的一级菌种制备。
二、实验原理
菌种制备的主要手段是扩培，其出发点是尽可能培养出高活性的、能满足大规模发酵需要的纯种。
由于现代生产菌种的生产性能已非常高，因此，菌种在培养过程中自发突变往往以负向突变为主，加上平时操作中可能有污染，导致发酵菌种容易退化。
因此，菌种的管理主要有两点：分离纯化和扩大培养。
前者目的为分离出单细胞菌落，保证菌种的性能稳定。
后者目的是为发酵生产提供充足的高活性菌种，分斜面菌种、一级菌种和二级菌种。
在进行各级菌种的扩培时，菌种的质量要达到发酵要求。
比较简单的做法是用显微镜观察细胞的形态是否正常、测定种子培养基的pH值是否正常及细胞生长繁殖活力等。
三、实验器材与试剂
1、菌种
实验二中筛选到的-淀粉酶产生菌(酵母)。
2、培养基（W/V）
（1）斜面培养基（已制备）
（2）摇瓶种子培养基：蔗糖20g/L，蛋白胨5.0g/L，磷酸氢二钠4.0g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，pH为5.0-5.5。
250ml三角瓶中装培养基50ml，8层纱布封口，0.1MPa 灭菌20min（现用现配）。
四、实验步骤
1、斜面接种
挑取保藏菌种接种到斜面培养基上，28℃培养24h。
仔细观察斜面菌苔生长情况（菌苔的颜色、边缘等特征是否正常），有无感染杂菌。
2、镜检
在无菌条件下，挑取斜面菌苔少许，在载玻片上制成涂片，在显微镜下检查菌苔形态特征，大小、均匀情况。
3、摇瓶培养
挑取经镜检确定后的活化斜面菌苔3-5环，接入上述液体培养基中，28℃恒温摇床培养(180rpm)，培养12h。
观察摇瓶菌液外观稠度、静置沉降情况。
镜检菌液中菌体细胞的形态是否正常（大小均匀程度等）及测定培养液中pH。
五、注意事项
1、出现污染征象的斜面培养活化菌苔坚决不能使用。
2、菌种的污染，势必导致发酵的失败，轻者产量降低，严重的不积累产物。
因此，在菌种制备过程中，都要树立牢固的无菌概念，力求细致、到位。