基于测序的微生物多样性分析总结

基于二代高通量测序的环境微生物多样性分析

一般认为土壤、海洋、肠道等生态系统中的微生物数量繁多、种类多样。传统的培养方法只限于对环境样品中极少部分（0.1%-1%）可培养的微生物类群的研究，而变性梯度凝胶电泳（DGGE）、克隆文库等常规的分子生物学方法也因操作复杂、成本高、痕量菌发现困难等因素无法达到深入分析环境微生物多样性的目的。高通量测序技术的出现，极大的促进了对环境中不可培养微生物以及痕量菌的研究，为环境微生物多样性的研究开启了新的研究热潮。

微生物群落中物种的多样性依然是目前研究的重点。对群落结构的研究，将有助于了解种群结构的稳定性，进而了解种群内物种间的相互依赖、相互制约的内在联系，为将来构建功能性种群服务。鉴于微生物群落是一个多物种的集合体，其中高达95%以上的微生物物种无法分离也不能独立培养，拼装出每个独立个体的基因组现在也无法实现，细菌16S 或真菌ITS测序分析依然是现阶段微生物群落多样性和多态性分析的基石。

一、高通量测序背景介绍

高通量测序技术，可以一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，使得对PCR扩增产物直接进行序列测定成为可能。极大的促进了对环境中不可培养微生物以及痕量菌的研究，为环境微生物多样性的研究开启了新的研究热潮。目前高通量测序的主要平台代表有Illumina公司的Solexa基因组分析仪（Illumina Genome Analyzer）、罗氏公司(Roche)的454测序仪（Roch GS FLX sequencer）和ABI的SOLiD测序仪（ABI SOLiD sequencer）。微生物多样性分析中，以Illumina 及454测序平台应用最为广泛。

二、工作流程

1 PCR引物的设计

2 PCR扩增条件摸索

3琼脂糖凝胶电泳检测结果

4 全部样品进行PCR

5 PCR产物的凝胶回收及检测

6 PCR产物精确定量（Qubit 2.0 ）

将纯化后的PCR产物采用微量荧光核酸定量仪进行精确定量（精确到0.1ng/ul）

7. 将定量后混匀的DNA样本再次进行磁珠法纯化后，进行高通量测序

三、可分析项目

1) 有效序列数据统计

在测序实验中，通常采用多个样品平行测序的方法，即多个样品混合测序。为了能区分样品，各样品中的序列均引入了一段标示其样本来源信息的barcode标签序列。若所测序列中不含有barcode 标签序列，则无法确定其样本来源，进而导致后续生物信息错误或意义不明。因此，仅当原始序列中含有完整的barcode 标签序列时，该条序列才被认可为有效序列。

2）优化序列数据统计

通常情况下，有效序列可以直接用于后续生物信息学分析。在实验过程中，测序产物可能含有非特异性扩增片段，利用特异性引物信息可以将其去除；序列中可能含有模糊碱基（ambiguous）、单碱基高重复区（homologous ）以，长度过短的序列(序列长度小于200bp)，及PCR过程中产生的一些嵌合体，将这些序列纳入分析范围会降低分析质量，因此修剪、去除（trim）此部分序列，可得到供精准分析的优化序列。在数据去除（trim）时，把maxambig=0，axhomop=8，maxlength=200，及其嵌合体序列去掉，并对数据进行统计，得到优化序列的百分率。

3) OTU生成

根据序列的相似性，将序列归为多个OTU（操作分类单元），以便后续分析。OTU （Operational Taxonomic Units）是在系统发生学研究或群体遗传学研究中，为了便于进行分析，人为给某一个分类单元（品系，种，属，分组等）设置的同一标志。在生物信息分析中，一般来说，测序得到的每一条序列来自一个菌。要了解一个样品测序结果中的菌种、菌属等数目信息，就需要对序列进行归类操作（cluster）。通过归类操作，将序列按照彼此的相似性分归为许多小组，一个小组就是一个OTU。根据客户指定的相似度（96%、97%或者98%），对所有序列进行OTU 划分并进行生物信息统计分析。

OTU 分析主要步骤

(1) 提取非重复序列，碱基完全一致序列为重复序列；

(2) 与silva 库中的aligned(16S/18S, SSU)核糖体序列比对；

(3) Chimeric 序列检测与去除

(4) 距离计算与OTU 聚类。

4) 多样性分析（Alpha-diversity）

计算菌群丰度（Community richness）的指数有：

（1）Chao：是用chao1 算法估计群落中含OTU 数目的指数，chao1 在生态学中常用来估计物种总数，由Chao (1984) 最早提出。

（2）Ace：用来估计群落中含有OTU 数目的指数，由Chao 提出，是生态学中估计物种总数的常用指数之一，与Chao I 的算法不同。

计算菌群多样性（Community diversity）的指数有：

（1）Simpson：用来估算样品中微生物的多样性指数之一，由Edward Hugh Simpson (1949) 提出，在生态学中常用来定量的描述一个区域的生物多样性。Simpson 指数值越大，说明群落多样性越低。

（2）Shannon：用来估算样品中微生物的多样性指数之一。它与Simpson多样性指数均为常用的反映alpha多样性的指数。Shannon值越大，说明群落多样性越高。

测序深度指数有：

Coverage：是指各样品文库的覆盖率，其数值越高，则样本中序列没有被测出的概率越低。该指数实际反映了本次测序结果是否代表样本的真实情况。

使用软件：mothur及BioLinker自编程序。

5) 稀释性曲线（Rarefaction curve）

稀释性曲线：一般是从样本中随机抽取一定数量的个体，统计出这些个体所代表物种数目，并以个体数与物种数来构建曲线。它可以用来比较测序数量不同的样本物种的丰富度，也可以用来说明样本的取样大小是否合理。分析采用对优化序列进行随机抽样的方法，以抽到的序列数与它们所能代表OTU的数目构建稀释性曲线。稀释性曲线图中，当曲线趋向平坦时，说明取样的数量合理，更多的取样只会产生少量新的OTU，反之则表明继续取样还可能产生较多新的OTU。因此，通过作稀释性曲线，可以得出样品的取样深度情况。

稀释性曲线分析结果默认是在97%相似性水平下划分OUT并制作各样品的稀疏曲线。

6) 分类学分析（Taxonomy）