细胞复苏实验指导

细胞复苏

细胞复苏是将休眠的细胞重新活化，使之重新生长，进入细胞周期，进而分裂产生子细胞的过程。细胞复苏后，可进入细胞周期，重新获得细胞类型特异的生物学功能。

一、实验前准备

实验开始前，将无菌培养瓶，15ml离心管、移液管、移液枪、枪头等放入无菌超净工作台，以紫外线照射30min。然后，采用通风机通风3min。以75%酒精擦拭操作台和双手。准备好冰盒。

将离心机调节至800rpm，5min。水浴箱调节至37度恒温。取细胞完全培养基，放于水浴箱中预热。

消毒双手和超净台。取约10ml细胞完全培养基放于15ml离心管中。

实验前备冰盒，快速由液氮中取出冻存的细胞，置于冰盒内。然后迅速将冻存管投入到已经预热到37度的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，注意管口处高于水面，以免进入导致污染。整个解冻过程最好在1分钟以内，以防融化过程中产生大量冰晶损伤细胞，约1min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精喷拭冻存管的外壁，立即拿入超净台内。

二、制备细胞悬液

以无菌枪头吸取细胞冻存液，置于已放入细胞完全培养基的离心管中，上下吹打5次，使冻存液与完全培养基充分混匀，尽量减少冻存液中DMSO的浓度，减轻细胞损伤。以封口膜封好管口。

配平离心：采用天平配平两端，800rpm，室温离心5min。

三、细胞计数

采用罗氏CASY-DT快速细胞计数及活率分析仪进行细胞计数。加入10ml CASY-ton至以标记viable的管子中，加入100ul细胞悬液，颠倒混匀三次，可进行细胞计数。可见每毫升悬液中有活细胞2乘10的5次方.

四、细胞培养

离心后，吸弃上清液，不要吸到底部的细胞沉淀。根据计数结果，向离心管内的细胞沉淀加入10ml细胞完全培养基，反复吹打制成细胞悬液，吹打过程中尽量不要产生气泡。

符合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，左右轻轻摇动培养瓶，把细胞摇均匀，将培养瓶放入37℃，5％CO2的培养箱中培养，2-4小时或者24-48小时后换液继续培养，换液的时间由细胞情况而定，一般以大部分细胞状态良好时换液为宜，比如超过半数的细胞贴壁，即可换液。

五、注意事项

1、取冻存管要做好保护措施

取细胞的过程中未带好防冻手套，护目镜。此项尤为重要，细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸,当然，选择好的冻存管此状况一般不会发生。

2、解冻速度要快

在常温下，冻存液中的DMSO对细胞的毒副作较大，因此，必须在一到两分钟内使冻存液完全融化。如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤。

3、细胞贴壁少

一般冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml－15ml培养液，培养基加入过多，造成细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁，所以进行细胞的计数尤为重要。

4、一次复苏细胞不宜过多

细胞在解冻时，水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。正规来说，需要迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。并且一次复苏细胞过多，容易忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。