重组乙肝疫苗的研制生产过程、理化性质、生物学活性、临床应用
重组cho细胞乙肝疫苗生产流程
重组cho细胞乙肝疫苗生产流程英文回答：Recombinant hepatitis B vaccine production process involves several steps. First, a genetically engineered yeast cell line is used to produce the hepatitis B surface antigen (HBsAg), which is the main component of the vaccine. The yeast cells are modified to express the gene encoding HBsAg, and then they are grown in large fermentation tanks under controlled conditions.During the fermentation process, the yeast cellsmultiply and produce HBsAg. The culture is then harvested, and the cells are removed by centrifugation or filtration. The resulting HBsAg-containing solution is purified using various techniques such as chromatography andultrafiltration to remove impurities and other cellular components.Once purified, the HBsAg is formulated into the finalvaccine product. This may involve the addition of adjuvants, preservatives, and stabilizers to enhance the vaccine's effectiveness and shelf life. The final vaccine product is then filled into vials or syringes, and undergoes quality control testing to ensure its safety, potency, and purity.The production process of recombinant hepatitis B vaccine is highly regulated and follows strict quality control measures to ensure the safety and efficacy of the vaccine. The entire process, from the initial genetic engineering of the yeast cells to the final formulation and packaging of the vaccine, is carried out in a controlledand sterile environment to prevent contamination and maintain product integrity.中文回答：重组乙肝疫苗的生产流程涉及多个步骤。
乙肝疫苗 生物制造工艺
乙肝疫苗生物制造工艺乙肝疫苗，这可是个守护健康的小卫士呢。
那它是怎么被制造出来的呀？这就像是一场奇妙的生物魔法之旅。
咱先从原材料说起吧。
制造乙肝疫苗的原材料，就好比是盖房子的砖头和水泥，非常关键。
科学家们得精心挑选合适的酵母或者其他载体，这载体就像是一个小小的工厂，要在里面生产出我们需要的乙肝疫苗成分。
你想啊，如果载体选不好，就像盖房子的砖头质量差，那这房子能结实吗？这疫苗能好用吗？肯定不行呀。
在这个小小的“生物工厂”里，要把乙肝病毒的某个部分基因导入进去。
这个基因就像是一张设计图纸，告诉这个“小工厂”该怎么生产出和乙肝病毒相关的特定蛋白质。
这蛋白质可重要啦，它是乙肝疫苗的核心部分呢。
就像我们做菜，这蛋白质就是主菜，其他的配料都是为了让这个主菜更好地发挥作用。
然后呢，这个“小工厂”就开始按照基因这张“图纸”进行生产啦。
这个过程可复杂着呢，就像是一个超级精密的仪器在运作。
要给这个“小工厂”提供合适的温度、营养物质等条件，就像我们人要吃饭睡觉才能好好工作一样。
如果条件不合适，那这个“小工厂”可能就会出故障，生产出来的蛋白质就可能不合格。
这就像我们做饭的时候火候不对，菜就不好吃了一样。
生产出来的蛋白质还不能直接就变成疫苗。
还得经过一系列的提纯和加工。
这就好比是从一堆矿石里提炼出金子一样。
要把那些杂质去掉，只留下纯净的、有效的蛋白质。
这个过程需要高科技的手段，就像淘金者需要特殊的工具一样。
要是提纯不好，杂质太多，那这疫苗打到身体里可就麻烦了，就像吃了不干净的东西会肚子疼一样。
在把蛋白质提纯之后，还要进行一些处理，让它变得更加稳定，能够在储存和运输的过程中保持活性。
这就像是给珍贵的东西包上一层保护膜一样。
如果没有这层保护膜，这疫苗在还没用到人身上的时候就坏掉了，那之前的努力不就白费了吗？最后，这些处理好的蛋白质就被制成了乙肝疫苗。
这些疫苗被装进小瓶子里，就像一个个等待出征的小战士，它们的使命就是进入我们的身体，让我们的身体认识乙肝病毒，然后产生抵抗乙肝病毒的能力。
重组乙肝疫苗(汉逊酵母)的介绍
重组酵母的构建
获取目的基因
1.根据已经测定的编码乙肝病毒表面抗原决定簇基因序列，用化 学合成法直接合成目的基因
构建重组质粒 导入宿主细胞
2. 用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段连接到质粒分子上， 构成DNA重组分子。
3.借组细胞转化手段将DNA重组分子导入酵母细胞内。
培养酵母细胞ຫໍສະໝຸດ 4.短时间培养转化酵母细胞，以扩增DNA重组分子。
2. 乙肝疫苗的发展： 第一代乙肝疫苗
（血源性乙肝疫苗）
第二代乙肝疫苗 （基因工程疫苗）
cho细胞乙肝疫苗
重组酿酒酵母乙肝疫苗 （第一代重组酵母乙肝疫苗 ） 重组汉逊酵母乙肝疫苗 （第二代重组酵母乙肝疫苗）
3.汉逊酵母为甲基营养型酵母，基因组易操作，培养基廉价，有分泌型表达模式，正确的 折叠和修饰，产量理想，发酵液产出杂蛋白少，产物易于纯化，无热源和其他病原体，安 全性好
疫苗保存
疫苗的稳定性较差，一般在2~8℃下能保存12个月，但当温度升高后，效力很快降低。 在37℃下，许多疫苗只能稳定几天或者几个小时，非常不利于在室温下运输。为了使疫苗 的稳定性提高，可用冻干的方法使之干燥。这样，疫苗的有效期往往可延长1倍或以上，在 室温下其效价的损失亦较慢。 冻干要点是： （1）冷冻，即将疫苗冷冻至共熔点以下。 （2）真空升华，即在真空状态下降水分直接由固态升华为气态。 （3）升温缓慢，即升温的过程尽量缓慢，不使疫苗在任何时间下有融解的情况发生。 （4）冻干好的疫苗应在真空或充氮气后密封保存，使其残余水分保持在3%以下。这样的 疫苗能保持良好的稳定性。
9.用丁基琼脂糖进行疏水层析，纯化后的抗原用硫氰酸盐处理以 完成二硫键的交联
10. 再与氢氧化铝共沉淀，此时抗原吸附在氢氧化铝上
乙肝疫苗的研究进展
乙肝疫苗的研究进展引言乙肝病毒是一种全球性的公共卫生问题，影响着全世界范围内的大量人口。
乙肝病毒感染会导致慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌等疾病，对个人健康和社会经济都产生了巨大的影响。
乙肝疫苗的研制和应用对于预防乙肝病毒感染具有重要意义，本文将围绕乙肝疫苗的研究进展进行综述。
研究现状自乙肝疫苗研制成功以来，疫苗的制备方法、接种时间、接种次数等方面都得到了不断的改进和优化。
目前，乙肝疫苗主要分为血源性疫苗和基因工程疫苗两大类。
血源性疫苗是通过收集乙型肝炎患者血清中的表面抗原（HBsAg）制备而成的，而基因工程疫苗则是通过基因工程技术将表面抗原的基因克隆到酵母或中国仓鼠卵巢细胞中表达制备而成的。
在接种时间方面，一般认为乙肝疫苗的接种应在婴儿出生后尽快进行，最好是在出生后24小时内。
同时，根据研究发现，对于乙肝表面抗原阳性母亲的新生儿，在出生后24小时内接种乙肝疫苗可以更好地保护婴儿免受乙肝病毒的感染。
在接种次数方面，根据现有资料，婴儿接种3针乙肝疫苗后，大多数接种者可以产生有效的保护性抗体，但也有部分接种者抗体水平较低，因此，对于易感人群，尤其是乙肝表面抗原阳性母亲的新生儿，建议在一定的时间间隔后进行补种。
研究方法乙肝疫苗的研究方法主要包括实验设计、数据收集和统计分析等。
在实验设计方面，研究者通常采用随机对照试验的方法，将受试者随机分为实验组和对照组，分别给予不同剂量的乙肝疫苗和安慰剂，并观察其效果和不良反应。
在数据收集方面，通过收集受试者的基本情况、血清学检测和病毒学检测等相关数据，了解疫苗的效果和安全性。
在统计分析方面，利用统计学原理对数据进行处理和分析，计算疫苗的保护率、抗体阳性率、抗体滴度等指标，以评估疫苗的有效性和安全性。
研究结论通过大量的研究和实验，乙肝疫苗在预防乙肝病毒感染方面显示出显著的效果。
根据现有资料，乙肝疫苗可以有效地预防婴儿和儿童感染乙肝病毒，并能够有效地降低肝硬化和肝细胞癌等疾病的发生率。
基因工程乙肝疫苗的制备
基因工程乙肝疫苗的制备【摘要】基因工程乙肝疫苗是通过构建含有乙肝表面抗原的重组质粒转染酵母细胞，制备乙肝病毒表面的有效蛋白。
本文主要介绍基因工程疫苗--重组酵母乙肝疫苗制备的基本原理和工艺流程，以及乙肝疫苗的纯度分析方法。
【关键词】 乙肝疫苗 重组质粒 工艺流程1.基因工程乙肝疫苗产生背景疫苗是人类目前可以彻底消灭某一疾病的唯一武器，接种疫苗被认为是最有效、最经济的疾病预防手段。
《发展中国家消灭乙型肝炎免疫接种计划实施指南》中指出：“世界上四分之三的人口生活在中或高乙肝流行区，因此，唯一的策略就是有效地减少乙肝的流行，最终消灭乙肝······”世界卫生组织肝炎专家及计划免疫全球咨询组认为：控制全球乙型肝炎及减少死亡的策略是开展大规模的婴儿及学龄前儿童的乙肝疫苗接种。
我国卫生部制定的目标是从92年开始在全国逐步推行乙型肝炎（HB ）计划免疫。
92年全国共生产血源疫苗1500万人份，尚不能满足新生儿接种需要，如考虑其他人群，缺口更大。
为了实现HB 计划目标，进一步为控制全球HB 做出贡献，我们必须大规模提高HB 疫苗的产量和进一步提高质量。
血源HB 疫苗原料为无症状带毒者的HBsAg 阳性血浆。
血源价格昂贵，供应量有限，采集困难。
因此血源疫苗的产量和成本受到原料的限制。
利用基因工程重组微生物细胞表达HBsAg 生产HB 疫苗的技术，原料易得，价廉，适宜进行大规模生产，有可能大幅度降低成本。
2.使用重组酵母的原因和重组酵母构建2.1使用重组酵母的原因使用重组酵母进行乙肝疫苗的大规模生产，有如下几点原因：（1）.酵母对培养基的要求低，价廉易得。
（2）.酵母细胞生长快，故生产率高。
（3）.动物细胞生长慢，容易染菌，对操作要求严。
（4）.酵母系统容易放大，动物细胞系统放大难。
2.2重组酵母构建HBV 只有3200bp ，为双链的DNA,是一个相当小的病毒。
国产重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)
19
现有的国产及进口基因重组乙肝疫苗
生产单位
大连汉信 天坛生物 国内 华药金坦 深圳康泰 北京华尔盾 进口
疫苗名称(种类)
重组乙肝苗（汉逊酵母） 重组乙肝苗（酿酒酵母） 重组乙肝苗（CHO） 重组乙肝苗（酿酒酵母） 重组乙肝苗（CHO） 重组乙肝苗（汉逊酵母） 重组乙肝苗（酿酒酵母） 倍尔来福 10μg/0.5ml/支 5μg/0.5ml/支 10μg/1.0ml/支 10μg/0.5ml/支 10μg/0.5ml/支 5μg/0.5ml/支 10μg/支 10μg/0.5ml/支 10μg/0.5ml/支
6
不同种类疫苗抗体滴度比较
250
200
150
100
50
0
(mIU/ml) GMT 酵母5ug 酵母10ug 华北CHO10ug 华北CHO20ug T1 48.15 67.91 85.23 201.08 (mIU/ml) GMT T3 33.36 35.28 68.17 167.43 (mIU/ml) GMT T6 23.51 39.97 47.31 81.81
CHO乙肝疫苗 啤 酒 酵 母乙肝疫苗
24
CHO乙肝疫苗的优势
CHO苗特性 酵母苗特性
重组CHO细胞乙肝疫苗技术为 酵母技术系美国默克公司技术
我国专有技术，国家Ⅰ类新药 型的HBsAg基因，针对性更强 转让。
用我国乙肝病毒流行株adr亚 流行株为adw亚型 由哺乳动物细胞（CHO细胞） 低等的真核细胞酵母菌表达，
陈胤忠，江苏省盐城市CDC，《基因重组乙型肝炎疫苗用于成人的免疫程序和接种剂量的研究》， 《中国计划免疫》2005.2 结果：高剂量疫苗组抗一HBsGMT和抗体高滴度分布比例均高于低剂量疫苗组；重组(CHO细胞) 乙肝疫苗抗一HBsGMT高于重组(酵母)乙肝疫苗，重组(CHO细胞)乙肝疫苗10ug诱导的抗一HBs GMT显著优于10ug重组(酶母)乙肝疫苗。 结论:对成人开展乙肝疫苗接种应选择高剂量的乙肝疫苗，建议选用20ug重组(CHO细胞)乙肝 疫苗．并优先选择0、1、6个月免疫程序。 12 华北制药—金坦生物
重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)研究概述
重组乙型肝炎疫苗（CHO细胞）研究概述作者：曹洋洋来源：《世界家苑·学术》2017年第07期摘要：全世界目前有慢性乙肝病毒感染3.5亿人，我国目前有慢性乙肝病毒感染1.3亿人，慢性乙肝病毒感染严重威胁着人类健康。
慢性乙肝病毒持续感染会发展为慢性肝炎、肝硬化、肝癌，故积极防治慢性乙肝病毒感染非常重要。
重组[中国仓鼠卵母细胞（（CHO细胞）乙肝疫苗]是采用基因工程技术将无传染性的乙肝病毒表面抗原（HBsAg）的s基因片段克隆到载体，用重组载体转染真核生物CHO细胞，通过细胞培养、增殖、分泌出HBs旭到培养液中，收集分泌液，经高速离心、纯化、除菌后，加入佐剂吸附（氢氧化铝）而制成。
提取总的核酸RNA，逆转录成cDNA，利用特异l性引物扩增出轻重链Fd片段，成功构建人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗体文库。
富集筛选，通过ELISA功能分析和序列测定，选择有较高的亲和力的抗体。
关键词：乙肝；CHO；基因重组；抗体1.背景介绍乙型肝炎病毒（HBV）属嗜肝DNA病毒科正嗜肝DNA病毒属，HBV感染严重威胁人类生命健康，HBV感染在我国是一个严重的公共卫生问题。
接种乙肝疫苗对预防乙肝病毒感染，控制乙肝病毒传播具有重要意义。
在HBsAg的两种表达系统中，利用CHO细胞表达的乙肝表面抗原具有免疫原性强，阳转率高的优点，但产量低是目前遇到的主要问题。
1.1乙肝病毒基因组结构HBV基因组是一部分双链DNA分子，由约3200个碱基对组成。
HBV的DNA双链中，短链称为正链，长度可变。
两条链5’端开始的250个核普酸交错排列，其碱基互补配对，故HBV DNA可保持环形。
HBV基因结构1.2乙肝病毒的分子生物学性质完整的HBV颗粒，即Dane颗粒，直径为42nm，由外膜和核衣壳组成。
外膜由HBsAg组成，后者含有一个环状的部分双链DNA分子，DNA多聚酶（P蛋白），DNA结合蛋白（C蛋白），及蛋白激酶（X蛋白）等。
1.3 CHO细胞表达系统蛋白质在合成过程中往往要经过翻译后的加工和修饰，才能成为有活性的蛋白质。
基因重组乙肝疫苗制备流程
基因重组乙肝疫苗制备流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!基因重组乙肝疫苗的制备流程主要包括以下几个步骤：1. 目的基因的获取：首先需要获取乙肝病毒表面抗原（HBsAg）的基因序列。
乙肝疫苗生产使用的技术_概述及解释说明
乙肝疫苗生产使用的技术概述及解释说明1. 引言1.1 概述乙肝是一种由乙型肝炎病毒（HBV）引起的严重传染病，全球范围内乙肝感染者众多。
为了有效控制乙肝的传播，乙肝疫苗成为预防和控制该疾病最重要的手段之一。
乙肝疫苗的生产和应用技术在过去几十年取得了巨大进展，并且持续进行着创新与改进。
1.2 文章结构本文将从乙肝疫苗的生产技术和使用技术两方面进行全面介绍和解释。
在第2节中，我们将详细描述乙肝疫苗的生产工艺、生产原理以及在生产过程中需要注意的关键技术要点。
紧接着，在第3节中，我们将介绍乙肝疫苗的使用技术，包括接种程序、接种途径与剂量说明以及安全性与不良反应注意事项。
在第4节中，我们将讨论目前针对新一代乙肝疫苗的研发进展以及技术改进对提高疫苗质量所起到的作用。
最后，在第5节中，我们将得出结论并探讨可能的未来发展方向和挑战预测。
1.3 目的本文的主要目的是全面介绍乙肝疫苗的生产使用技术，并解释说明其中的关键要点。
通过对疫苗生产工艺和技术的概述，读者将了解到乙肝疫苗在不同阶段的生产过程和其背后的原理。
此外，我们还将详细介绍乙肝疫苗的使用技术，以帮助读者了解接种程序、剂量说明以及安全性与不良反应注意事项。
最后，我们将展望乙肝疫苗技术的未来发展方向，并探讨可能面临的挑战。
这篇长文将为读者提供关于乙肝疫苗生产使用技术的全面概述，并加深对该领域重要内容的理解，也有助于推动相关技术进步和创新。
2. 乙肝疫苗生产技术2.1 疫苗生产工艺概述:乙肝疫苗的生产过程包括病毒培养、病毒清除、病毒灭活或亚单位疫苗制备、纯化和浓缩等步骤。
主要包括以下几个阶段：首先，通过采集感染乙肝病毒的人类血样，从中提取出含有乙肝表面抗原（HBsAg）的血浆。
然后，将这些血浆进行初步处理，以去除杂质，并进行超滤或沉淀来富集HBsAg。
接下来，在严格控制条件下在细胞培养基中培养受到感染的真核细胞系，使其表达并分泌大量的HBsAg。
随后通过离心等步骤将细胞培养液离心分离得到疫苗原液。
乙型肝炎疫苗
重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）外文名称Recombinant Hepatitis B Vaccine (Saccharomyces cerevisiae)剂型注射剂批准文号S2*******药品类型生物制品规格每1次人用剂量1.0 ml/60μg目录1基本信息2成分和性状3接种对象4作用与用途5规格6免疫程序与剂量7不良反应8注意事项9贮藏10包装11有效期12执行标准13批准文号1基本信息为使更多的人群免受乙肝病毒的侵害，解决低无应答人群按常规免疫剂量接种乙肝疫苗后没有产生保护性抗体的问题，60μg/1.0ml/支规格的重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）可用于低无应答人群的免疫预防。
2成分和性状本品系由重组酿酒酵母表达的乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）经纯化，加氢氧化铝佐剂制成。
为乳白色混悬液体，可因沉淀而分层，易摇散，不含任何防腐剂。
有效成分：乙型肝炎病毒表面抗原。
辅料：氢氧化铝、氯化钠。
3接种对象本疫苗适用于对乙型肝炎疫苗常规免疫无应答的16岁及以上年龄的乙型肝炎易感者。
以上所述“无应答者”系指按照常规免疫剂量和程序接种3剂乙型肝炎疫苗后，经采血确认其抗体水平未达到阳转者（≥10mIU/ml为阳转标准）。
4作用与用途接种本规格疫苗后，可刺激对常规剂量和程序接种无应答人群的机体产生抗乙型肝炎病毒的免疫力。
用于预防乙型肝炎。
[2]5规格每支1.0 ml。
每1次人用剂量1.0 ml，含HBsAg 60μg。
6免疫程序与剂量（1）于上臂三角肌肌内注射。
（2）根据目前临床研究结果，推荐无应答者接种1剂（60μg），经采血确认其抗体水平仍未达到阳转者再考虑接种第2剂，两剂间隔至少4周以上。
7不良反应基于国内已完成的1105例16岁以上无应答者的临床试验结果汇总分析（详见【临床试验】），60μg（445例）、30μg（439例）和10μg（221例）疫苗组不良反应总体发生率分别为33.03%、31.21%、29.86%。
乙肝疫苗的制备
向运新 李凯 周永斌
彭博 王伟杰
朱晓东
资料提供者：
刘珍
鞠林
基因工程
定义：又称为重组DNA技术，指将某些特定的基因或DNA片断，通过 载体或其它手段送入受体细胞，使它们在受体细胞中增殖并表达的一 种遗传学操作。是生产出符合人类需要的产品或创造出生物的新性状 并能稳定遗传。
作用：可把来自任何生物的基因转移到与其毫无关系的任何其他受体 细胞中，可以任意改造生物的遗传特性，创造出生物的新性状。某一 段DNA可在受体细胞内进行复制，为制备大量纯化的DNA片段提供了 可能.
抗病毒抗肿瘤
• 白细胞介素(interleukin)
治疗癌症
• 基因重组乙肝疫苗
用基因重组技术把乙型肝炎病毒的表面抗原 （HbsAg）基因片段插入酵母细胞或哺乳动物 细胞的基因中，在体外培养增殖过程中组装或 分泌出乙型肝炎表面抗原，然后把表面抗原收 集起来提纯之后做成乙型肝炎疫苗。
乙肝疫苗的制备
获得目的基因
表达载体
重组的表达载体
酶切、连接
转化、转染等
宿主细胞
原核生物细胞
转基因 微生物
基因工 程药物
植物细胞
动物细胞
人类细胞
转基因植物 培养的动 物细胞
卵细胞
胚胎 发育
基因 治疗
药物、疫苗 转基因动 物
• 蛋白质名称
用途
• 促肾上腺皮质激素（adrenocorticotrophic hormone） 治疗风湿（rheumatic disease）
固液 分离 细胞 破碎
浓缩 与初 步纯 化
高度 纯化
成品 加工
• 浓缩与初步纯化
• 离子交换层析 • 疏水层析 • 亲和层析
重组乙肝疫苗汉逊酵母工艺流程
重组乙肝疫苗汉逊酵母工艺流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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在开展重组乙肝疫苗汉逊酵母的生产之前，要进行充分的准备。
乙肝疫苗生产发展简介 PPT
n80年代中期----基因工程乙肝疫苗（第二代乙肝
疫苗）。包括：
• 重组酿酒酵母乙肝疫苗，表达水平不理想—
50mg/L。5ug/0,5ml的成人剂量偏低，抗体滴度 偏低。
• 重组CHO细胞乙肝疫苗，表达水平低，2-5mg/L，
母婴阻断效果不理想
• 重组牛痘病毒乙肝疫苗。表达水平低，1-3mg/L，
大家有疑问的，可以询问和交流
可以互相讨论下，但要小声点
9
• 10, 大连高新（汉信）生物制药有
限 公 司 从 1998 年 开 始 重 组 汉 逊 酵 母 乙 肝 疫 苗 的 研 制 工 作 ， 在 2002 年6月获得了国家药品监督管理局 颁 发 的 “ 新 药 证 书 ” ， 在 2003 年 开始商业化生产。
母总蛋白）
• 纯化收率：20% • 发酵罐工作体积：500L • 一次发酵所得抗原量：
50mg/Lх500L=25g
• 纯化后所得抗原量25gх20%=5g • 可生产疫苗量
5,000,000/5=1,000,000支
北京天坛和新乡华兰表达 水平和抗原产量的比较
汉逊酵母和啤酒酵母的比较
重组汉逊酵母的特点 （甲基营养型酵母）
无法实现工业化生产。
n90年代初期---重组汉逊酵母乙肝疫苗。更先进的
基因工程乙肝疫苗。
国外主要的乙肝疫苗生产厂家
国内主要的乙肝疫苗生产厂家
国内乙肝疫苗生产厂家工艺比较
• 华兰：菌种好，表达水平高，纯化
收率高，所以，总体而言，华兰公 司的技术更为先进。
• 基本技术资料： • 菌种：重组酿酒酵母 • 表达水平：50mg/L • 表达效率：1,35%(表面抗原蛋白/酵
• 8, 1989 年 北 京 生 物 制 品 研 究 所 与
重组乙肝疫苗工艺流程
重组乙肝疫苗工艺流程重组乙肝疫苗的工艺流程呀，那可有点小复杂呢。
一、基因工程菌的构建。
要做重组乙肝疫苗，得先构建基因工程菌。
科学家们就像超级魔法师一样，从乙肝病毒里找到那个能表达乙肝表面抗原（HBsAg）的基因片段。
这就好比从一堆宝藏里精准地挑出最珍贵的那一颗宝石。
然后把这个基因片段整合到合适的载体上，这个载体就像是一艘小船，载着基因片段进入大肠杆菌或者酵母菌等宿主细胞。
这过程就像是给小宝石找了个合适的小盒子，再把小盒子放到一艘大船里。
二、工程菌的发酵培养。
工程菌构建好啦，接下来就是让它们大量繁殖啦。
把工程菌放到发酵罐里，就像把小种子种到肥沃的土壤里一样。
要给它们合适的环境哦，温度、酸碱度、营养物质啥的都得控制好。
比如说温度得像春天一样适宜，不能太热也不能太冷，不然工程菌会闹小脾气，不好好生长的。
营养物质就像是工程菌的美食，有了充足的美食，它们就会开开心心地分裂繁殖。
酵母菌在发酵罐里就像一群勤劳的小蜜蜂，不停地繁殖，产生越来越多带有乙肝表面抗原的菌体。
三、抗原的提取与纯化。
工程菌繁殖得差不多了，就该把我们想要的乙肝表面抗原提取出来啦。
这就像是从一大筐水果里挑出最甜的那几个。
首先要把工程菌破碎，把里面的东西都释放出来。
这就好比把装着宝贝的小盒子打破，才能拿到里面的宝石。
然后用各种办法把乙肝表面抗原分离出来，像是用离心的方法，让重的东西沉下去，轻的东西浮起来，抗原就在我们想要的那一层里。
再用层析的方法，就像过筛子一样，把杂质一点点去掉，让乙肝表面抗原越来越纯。
四、疫苗的配制与包装。
最后一步啦，把纯化好的乙肝表面抗原配制成疫苗。
就像把最精美的材料做成一个小礼物。
要加入一些佐剂，佐剂就像是小帮手，能让疫苗的效果更好。
然后把配好的疫苗装进小瓶子里，贴上标签。
这小瓶子就像是疫苗的小房子，标签就像是它的身份证，告诉人们这是什么疫苗，有什么作用。
整个重组乙肝疫苗的工艺流程就像是一场精心策划的魔法之旅，每一步都很关键。
重组乙型肝炎疫苗的生产1
CHO细胞培养 收获细胞培养液
添加防腐剂 分装 外包
分离纯化 除菌过滤 添加佐剂
成品
九逸作品
三、疫苗的制备
（一）原液的制备
1、细胞的培养和表达 2、细胞培养液的提取和纯化： 收获培养液—疏水层析—离子交换—凝胶过滤层析—收获HBsAg 3、除菌过滤
4、疫苗原液
注：分离纯化—— 根据生物功能特性（大分子之间的分子识别和特异性识别）采用 疏水层析法（吸附力），再进行离子交换法和凝胶过滤层析的多级单元操作分离、纯 化，可得到精制后的HBbAg(蛋白质)目的物。
重道
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1、目的物是什么？(HBsAg)
2、用什么手段最大限度的获取目的物，及： ①如何使目的物数量达到最大？（建立三级种子批细胞库连续培
养CHO细胞，直接收集培养液）
② 如何提取目的物？（HBsAg存在于细胞培养液中，根据其理化 性质的特点采用疏水层析法) ④如何增强免疫原性？（加入氢氧化铝佐剂） 二、 CHO细胞生产工艺流程：
君子
（二）半成品的制备 1、稀释原液：蛋白质含量，使HBsAg 终含量为10µg/ml或20µg/ml。 2、添加佐剂：氢氧化铝佐剂 3、添加防腐剂：硫柳汞 4、半成品 （三）成品制备
1、分装：洗、烘、灌、半加塞；
2、冻干：冻干、全加塞、轧盖; 3、包装：喷码、贴标、装小盒（说明书）、装大盒、打包。
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（CHO细胞）
重组疫苗的研发与应用
重组疫苗的研发与应用近年来，随着全球人口增加及人类活动的频繁性，传染病的爆发和传播成为一个全球性问题。
为了有效预防和控制传染病的蔓延，科学家们不断努力寻找更高效、安全的疫苗。
其中，重组疫苗因其优良特性而备受关注和广泛应用。
本文将重点讨论重组疫苗的研发与应用。
一、重组疫苗的定义及原理重组疫苗是指利用分子生物学技术，将目标抗原基因导入到宿主细胞或其他表达系统中，使其产生足够量的抗原以诱导免疫反应。
相对于传统灭活或弱毒化疫苗，重组疫苗能够更准确地模拟真实感染过程，同时避免了潜在风险因素。
重组疫苗的制备过程包括以下步骤：1）选择目标抗原；2）克隆和表达基因片段；3）得到免容宿主细胞表达该基因；4）收集并纯化抗原蛋白。
可以使用多种表达系统，如细菌、酵母、真核细胞等。
二、重组疫苗的优势2.1 高效性由于重组疫苗是针对特定抗原进行设计，可以激发高效且持久的免疫反应。
相比传统疫苗，其抗原特异性更强，因此在免疫保护上具有明显优势。
2.2 安全性重组疫苗避免了一些常见的风险因素，如接种过程中与人体其他成分的反应、致病微生物残留和使用活体微生物的潜在感染风险等情况。
此外，由于基因工程技术的应用，重组疫苗不会导致感染或并发症，并且通常不需要添加佐剂来增强免疫效果。
2.3 稳定性重组疫苗能够避免使用整活微生物生产过程中存在的自然变异问题，并提供一个稳定和一致性产品。
这为制造、保存和运输提供了便利。
2.4 应用范围广泛重组疫苗可针对多种传染病进行开发，例如流感、人乳头瘤病毒（HPV）感染和新冠病毒等。
它们不仅可以用于预防患者感染病原体，还可以用于控制特定感染的传播。
三、重组疫苗的应用案例3.1 流感疫苗流感是一种常见的呼吸道传染病，严重影响了全球人口的健康。
传统流感疫苗采用鸡胚系列的生产方式，在生产过程中可能引入其他致病微生物或导致部分人群不能接种。
通过基因工程技术，科学家们成功地开发了基于表达谷氨酸蛋白（HA）及神经氨酸蛋白（NA）的亚单位型流感疫苗。
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主讲：胡永珍
参加人员：
内容：重组乙肝疫苗的研制生产过程、理化性质、生物学活性、临床应用
国际上先后研制出了第一代血源性乙肝疫苗和第二代基因工程乙肝疫苗。
第一代乙肝疫苗主要运用乙肝病毒携带者血清中提取纯化出的的乙肝病毒表面抗原，先后经过减毒处理和添加佐剂后注入人体预防接种。
但是由于对血源性疫苗安全性存在顾虑，人们进一步着手开发第二代乙肝疫苗，也就是基因重组疫苗。
第一步是分离目的基因，获得目的DNA片段的方法主要有两种，一是直接从细胞基因组中分离，二是人工合成。
第二步是将DNA片段和载体在体外连接重组，成为重组DNA分子，多采用连接酶的方法连接。
第三步是基因克隆，即将重组体DNA分子，引进合适的宿主细胞(大肠杆菌、酵母)中增殖。
根据所用载体的不同，可选用转化(以质粒作载体时，重组体DNA分子以此种方式进入感受态的宿主细胞，以获得转化子菌落)、转染(λ噬菌体作载体时，构成的重组体DNA分子，以此种方式进入宿主细胞，可转染得到噬菌斑)、转导(λ噬菌体DNA与外源DNA组成的重组体DNA分子，与噬菌体蛋白组装成具有感染力的噬菌体颗粒，即人工包装的噬菌体颗粒，引入宿主细胞)的方法，往宿主细胞引入重组体DNA分子。
第四步是目的基因克隆的筛选与鉴定，即从大量携带重组体DNA分子的细胞中分离出带目的基因的细胞。
因为不是所有的细胞都能获得重组体DNA分子，为了获得摄取了重组体DNA分子细胞，需经筛选，才能将其与未摄取重组体DNA分子的细胞区别开来，并作进一步鉴定。
筛选含有重组体DNA分子细胞的方法，一般都是以载体DNA及目的基因的遗传标记及分子特征为依据，并结合受体细胞的基因表型而建立起来的。
由于许多质粒都具有抗生素等药物的抗性标记，因此，在含有一定浓度抗生素的选择培养基上，可以很容易地把摄取了重组体DNA分子，因同时也获得了抗生素抗性的细胞辨认出来。
但药物筛选只是一个方面，依据它只能判断质粒载体是否进入了受体细胞，还不能确定受体细胞是否摄取了含有目的基因的重组体DNA分子。
对于重组体DNA分子的鉴别，通常是在抽提出重组质粒DNA后，用凝胶电泳法或电镜观察其分子大小，用限制酶酶解，观察其酶切图谱进行。
还可采用菌落原位杂交法来进行鉴定，即将菌落从最初生长的平板上转移到硝酸纤维素滤膜上，用碱裂解滤膜上的菌落，使DNA分子游离，变性，并固定在滤膜上，随即用同位素标记的与目的基因互补的DNA或RNA探针杂交，最后通过滤膜的放射自显影鉴定菌落，并从最初生长的平皿上挑选出放射自显影呈阳性的菌落。
第五步是基因表达，这是指宿主细胞在大量繁殖过程中外源DNA在宿主细胞中的转录和翻译，表达生成的产物(蛋白质)，最好在细胞内不被分解，而分泌到细胞外面。
表达产物若为较小的多肽，或是对细菌蛋白酶极为敏感的蛋白质，形成后，通常即被迅速降解。
为了保证外源基因表达产物能分泌到细胞外而不被降解，通常可以把外源基因插入在载体的某些结构基因中间，在这种情况下，表达产物是融合蛋白质，融合蛋白质可以抵抗内源蛋白酶的降解，又可以在细胞信号肽的引导下分泌到细胞外。
最后，利用发酵工程培养重组与乙肝疫苗的工程菌理化性质从热稳定性方面说酵母源乙型肝炎疫苗37℃保存1周不改变其免疫原性乙肝疫苗，主要成分是45个氨基酸的多肽，通过化学合成的方式制备，使用直接注射的方法打入静脉。
这45个氨基酸分别编码了三个抗原表位（所谓表位，是一串大于9个氨基酸的多肽，是能够刺激免疫系统发生反应的最小多肽片段）：,HBscFv等电点理论值为8.5 1,实验值为7.3～8.1（就是抗体）综上所述，用基因工程法生产乙肝疫苗要先后将过获取目的基因、构建重组质粒、构建基因工程菌、培养工
程菌、乙肝病毒表面抗原的分离纯化、产品多项性质的初步检测、成品化处理（如添加佐剂、抗生素、除菌）、成品检测鉴定、包装几个步骤。
对产品多项性质的检测对于保证疫苗的安全性尤其重要。
目前临床上应用的乙肝疫苗主要有以下几种：(1)血源性乙肝疫苗：此疫苗是用无症状的HBsAg携带者的血液制成，故称血源性乙肝疫苗。
它的制备步骤大致是：采用高滴度HBsAg阳性携带者血液，分离出血浆并除去其中有感染的HBV颗粒后，再将HBsAg予以浓缩与纯化，充分灭活，以消灭其中可能存在的一切已知病毒和消除HBsAg表面可能存在的全部宿主蛋白，然后添加佐剂及防腐剂而成。
为确保疫苗的安全，每一阶段均取样做无菌试验、热源试验及动物安全试验等，以检查疫苗中有无其他病原体及血液中的抗原物质。
此种疫苗的免疫原性与安全性均已获得解决。
(2)基因工程疫苗：利用基因工程研制重组DNA乙肝疫苗，曾先后研制过大肠杆菌系统、啤酒酵母细胞系统、哺乳动物细胞系统和牛痘病毒系统的重组乙肝疫苗。
目前多用酵母基因的重组疫苗。
其具有良好的免疫原性，免疫应答特点与血源性乙肝疫苗基本相似，且多无严重的不良反应。
(3)含前S 蛋白的乙肝疫苗：目前临床上应用的血源性疫苗与基因工程疫苗，均只含HBsAg蛋白，当证实S蛋白能增强HBsAg的免疫应答后，又注意到单纯只含HBsAg蛋白的疫苗对血液透析病人与新生儿免疫效果较差时，遂生产出添加前S蛋白的酵母源性重组乙肝疫苗，它确能明显地增强免疫应答。
基因工程技术生产乙肝疫苗首先要选择表达HBsAg的载体系统。
在之前的研究中发现，若选用细菌为基因表达载体，即使使用强启动子，也不能得到大量具有免疫原性的基因表达产物。
这可能是由于原核表达系统中不能进行糖基化修饰，或者原核细胞环境不适合专性寄生于真核生物的乙肝病毒包膜蛋白表达，故应选用真核表达系统。
选用酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为宿主系统，因其具有丰富的膜结构和细胞器的特点，既可使蛋白以分泌形式表达，又可以使蛋白糖基化变为活性形式。
克隆载体构建时，将编码HBsAg的基因（野生型adw）添加到酵母酒精脱氢酶Ⅰ（ADHⅠ）的启动子之后。
如图1 所示构建载体。
[6] 将质粒转化至酵母菌中，通过HBsAg抗体与酵母菌积累产物HBsAg之间的特异性反应筛选出成功转化的菌体。
对筛选出的菌体进一步发酵培养，摸索合适的基因工程菌培养条件，使产物尽量高效积累。