从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验方案

土壤中产淀粉酶芽胞杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定设计性实验方案
一、综述：
淀粉酶是淀粉降解酶。

它们广泛存在于微生物、植物和动物体中。

它们将淀粉及相关的聚合物分解为带有具体淀粉分解酶特征的产品。

淀粉酶广泛存在于动植物和微生物中,是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。

淀粉酶种类繁多,特点各异,可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂]等多种领域。

在酿造发酵工业如酒精生产、啤酒制造、发酵原料液化及糖化工艺过程中均有重要价值,如添加淀粉酶分布非常广泛，是人们经常研究的一种酶。

从纺织工业到废水处理，这些酶都有不同规模的应用【1】。

常见产淀粉酶的主要为芽孢杆菌属。

其中的常见产淀粉酶的芽孢杆菌菌种有：地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌【2】、凝结芽孢【3】。

由于芽孢杆菌属是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生抱子的杆状细菌，许多为腐生菌，主要分布于土壤和植物体表面及水体中【4】。

所以此次实验从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌。

二、实验目的要求
1．了解生物分离提纯的原理和方法技术
2．掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理和方法
3.掌握微生物摇瓶培养方法及淀粉酶活力测定的原理和方法
4.培养学生的综合应用微生物实验方法的能力
5.培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。

三、实验原理
自然界中，土壤是微生物生活最适宜的环境。

土壤具有微生物进行生长繁殖和生命活动中所需的各种条件。

土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。

一般地说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10 cm～30 cm的土层中菌数最多，随土层加深，菌的数量减少【5】。

从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。

平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。

其基本原理是选择适合与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

值得指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。

因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。

芽孢杆菌属的共同特征是：革兰氏阳性；接触酶阳性；水解淀粉；VP试验阳性；不产生吲哚；苯甲氨酸不脱氨；分解酪素；不分解酪氨酸；不产生二羟丙酮；营养体的最高生长温度大约从25℃到75℃以上；最低生长温度大约5℃到45℃；生长最低pH值，从7.5—8到2左右；耐盐范围从低于2%的NaCl到25%NaCl；营养明胶（22℃）7天内液化1厘米或1厘米以上。

枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌在糖发酵试验用阿拉伯糖，木糖和甘露糖代
替葡萄糖可产酸；作为营养生长的最低限培养基是无维生素的，但含有葡萄糖、柠檬酸盐和一个氨态盐作为唯一的碳源和氮源【6】。

细菌特性
1. 繁殖快速:代谢快、繁殖快，四小时增殖10万倍，标准菌四小时仅可繁殖6倍。

2. 生命力强:无湿状态可耐低温-60℃、耐高温+280℃，耐强酸、耐强碱、抗菌消毒、耐高氧(嗜氧繁殖)、耐低氧(厌氧繁殖)。

3.体积大:体积比一般病源菌分子大四倍数，占据空间优势，抑制有害菌的生长繁殖。

四、实验材料和用具
4.1 土样采集：采集广大植物园内的有机土壤，和生化楼下花坛的有机土壤
4.2 营养琼脂(%)：蛋白胨1 牛肉膏0.3 氯化钠0.5 琼脂1.5 ～2.0 蒸馏水
将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内，加入15%氢氧化钠溶液约2mL，校正pH至7.2～7.4。

加入琼脂,加热煮沸，使琼脂溶化。

4.3 淀粉牛肉膏蛋白胨培养基(%)：可溶性淀粉0.2 牛肉0.3 蛋白1.0 氯化钠0.5 琼脂1.5～2.0 校正pH至7.2～7.4
4.4 发酵培养基(%)：玉米粉 2 黄豆饼粉 1.5 CaCl 0.02 MgSO4 0.02 NaCl 0.25 K2HPO4 0.2 柠檬酸钠0.2 硫酸氨0.075(溶解后加) Na2HPO40.2 校正pH值7.0
4.5 葡萄糖蛋白胨培养基（V.P试验用）（%）：葡萄糖0.5 蛋白胨0.5 K2HPO4 0.2 校正pH 7.2～7.4
4.6 蛋白胨水培养基（吲哚试验用）（%）：蛋白胨1% 氯化钠0.5% 校正pH 7.2～7.4
4.7 西蒙氏柠檬酸盐培养基（%）：氯化钠0.5 硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.02 磷酸二氢铵0.1 磷酸氢二钾0.1 柠檬酸0.5 琼脂2 溴麝香草酚蓝溶液4 酚红试剂校正pH6.8
先将盐类溶解于水中，校正pH，再加入琼脂，加热融化，然后加入指示剂，混匀后分装试管，121℃高温灭菌15min。

4.8 配制营养明胶培养基（%）：蛋白胨0.5、牛肉膏0.3、明胶1.2，调pH 6.8~7.0
4.9耐盐培养基（%）：
①蛋白胨1 牛肉膏0.3 氯化钠2琼脂1.5 ～2.0 蒸馏水
②蛋白胨1 牛肉膏0.3 氯化钠10琼脂1.5 ～2.0 蒸馏水
③蛋白胨1 牛肉膏0.3 氯化钠20 琼脂1.5 ～2.0 蒸馏水
④蛋白胨1 牛肉膏0.3 氯化钠25 琼脂1.5 ～2.0 蒸馏水
加入15%氢氧化钠溶液约2mL，校正pH至7.2～7.4。

加入琼脂,加热煮沸，使琼脂溶化。

4.10 溶液或试剂染料
革兰氏染色：草酸铵结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇;
芽孢染色：5%孔雀绿溶液, 石炭酸复红液; 香柏油、二甲苯
吲哚试验：乙醚、吲哚试剂
V.P.试验：40％NaOH溶液、α-奈酚，
淀粉酶活力测定：1%3, 5- 二硝基水杨酸试剂
4.11 仪器或其它用具
无菌玻璃涂棒无菌吸管接种环无菌培养皿土样三角瓶烧杯洗瓶玻棒试管酒精灯擦镜纸接种环酒精灯载玻片吸水纸等。

恒温摇床恒温培养箱高压蒸汽灭菌箱超净工作台水浴箱紫外灯照射箱磁力搅拌器玻璃珠移液管涂布器显微镜
五、实验方法及步骤
1、初筛方法
①制菌悬液：两个土样分别取5g，放入各自装有45mL无菌水的三角瓶，振荡10min,即为稀释10-1的土壤悬浮液。

每个环境的土样装1个锥形瓶，共2个，同时将其分为4组，编号AB。

②加热筛选有芽孢的菌：将2个锥形瓶加塞、包扎、摇匀（无菌室里），利用恒温水浴装置100℃左右水浴，水浴锅温度恒定后维持15min（制悬液时就应先开始加热），制成10-1 g/ml的土壤悬液
③梯度稀释菌悬液：再分别另取装有9mL无菌水试管5支，用记号笔编上10-2、10-3、10-4、10-5。

取已稀释成10-1土壤液，振荡后静止0.5min，用无菌的移液器吸取1mL土壤悬液加入10-2的无菌水的试管中，并在试管内轻轻反复吹吸数次，使之充分混匀，即成10-2土壤稀释液。

同法从10-2的试管中吸取1mL稀释液加入编号为10-3的无菌水试管中，混匀后即为10-3土壤稀释液，依次连续稀释为10-4、10-5土壤稀释液。

在土壤稀释过程中，用相同的移液枪头由浓到稀来稀释。

④涂布平板用一支新的无菌枪头，由低浓度开始，从各浓度土壤稀释液中各吸取100ul，对号较均匀地放入已写好稀释度的牛肉膏蛋白胨培养基平板上，用灼烧冷却后的无菌玻璃涂棒涂匀。

每个浓度做3个平板（重复）。

37℃下恒温培养24h。

2、复筛方法【1】
划线接种（分区划线法）：在上述不同稀释度培养基中挑取不同形态的
单菌落进行分区划线，先在平板培养基的一边作第1次平行划线3~4条，
再转动培养皿约60°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第1
次划线部分作第2次平行划线，再用同法通过第2次平行划线部分作第
3次平行划线和通过第3次平行划线部分作第4次平行划线（如右图）。

划线完毕，盖上皿盖，倒置于28~29°C温室中培养约20h.。

再继续分
区划线2-3次，以获得较纯的菌种。

将纯化得到的单菌落分为两部分，其中一部分接种到培养基内，
用以保存菌种，另一部分用来做染色实验。

3、获得产淀粉酶芽孢杆菌纯种：
上述划线接种后的菌落中各挑取形态特征不一致的点接于倒好的淀粉牛肉膏培养基中，一个土样取8个平板两两标记同一位置同序号标记，一平板分5个区域，点接重复两次，在37℃培养箱中培养24h。

上述点接后的平板中取出一组四个分好区域的淀粉牛肉膏培养基平板于实验室，其他置于无菌室。

实验室里，四个平板均加入碘液，立即观察记录阳性和阴性菌落所在位置，并可同时记录透明圈的大小。

根据所记录的阳性菌的编号，利用另一组中的营养琼脂平板上其对应的菌落继续划线接种，培养后将出现的形态特征不一致的菌落进行编号，然后挑取部分出来进行革兰氏染色镜检，若发现视野内出现形态、大小、颜色一致且为杆菌的菌体，则将其对应的菌种划线接种到新的营养琼脂平板上，标记，37℃下培养24h。

否则继续进行划线分离，培养后再经革兰氏染色镜检直至得到纯种杆菌后进行芽孢染色。

筛选出芽孢纯种后进行斜面接种。

革兰氏染色步骤：
涂片、干燥及固定
初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。

媒染：先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。

脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约15－20秒，后立即用流水冲洗。

复染：滴加番红染色液，染3－5分钟，水洗后用吸水纸吸干。

镜检：油镜观察染色结果。

芽孢染色染色镜检：
·取37℃培养18～24h的枯草芽孢杆菌涂片，干燥，固定。

·于涂片上滴人3～5滴5%孔雀绿水溶液。

·用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时，开始计算时间约4～5min。

加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。

·倾去染液，待玻片冷却后，水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。

·用石炭酸复红液复染l min，水洗。

·制片干燥后用油镜观察。

芽孢呈绿色，菌体红色。

（注：观察芽孢的形状和位置，查伯杰细菌手册）
4.斜面保存菌种
·贴标签取各种无菌斜面试管数支，将注有菌株名称和接种日期的标签贴上，贴在试管斜面的正上方，距试管口2～3cm处。

（每种菌接3管，标上相同编号也要与平板上菌落编号相对应）。

进行斜面接种操作，加塞、包扎好到37℃培养箱里培养24h。

5、菌种的鉴定
5.1所得的斜面菌种接种到新的平板上培养以观察筛选出的产淀粉酶芽孢杆菌菌落的大小、颜色、干湿情况、形态、高度、透明程度、边缘、是否易被挑起、气味等。

然后进行一系列的镜检——革兰氏染色、芽孢染色（具体步骤同上）观察是否符合附表中芽孢杆菌的指标5.2生理生化试验
温度对菌种培养的影响；淀粉水解试验；温度对菌种的影响；明胶液化试验；糖发酵试验；乙酰甲基甲醇试验(V.P试验)；吲哚试验；耐盐性试验；柠檬酸盐利用试验。

·温度对微生物生长的影响
将牛肉膏蛋白胨培养基熔化倒平板。

（培养基厚度为一般培养基的1.5 到2倍）
取30 套牛肉膏蛋白胨平板，分别进行标号。

在上述各平板中分别划线接种不同的菌种，每个菌种重复接种六个平板。

各取每个菌种两套平板倒置于4℃（冰箱）、37℃（或者室温），60℃下保温培养24 小时，观察细菌的生长状况。

（“—”不生长，“+”生长较差，“++”生长一般，“+++”生长良好。

·淀粉水解实验
以18-24h的纯培养物，涂布接种于淀粉琼脂斜面或平板（一个平板可分区划“+“字接种，）或直接移种于淀粉肉汤中，于36±1℃培养24-48h，或于20℃培养5天。

然后将碘试剂直接滴浸于培养表面，若为液体培养物，则加数滴碘试剂于试管中。

立即检视结果，阳
性反应（淀粉被分解）为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明环、或肉汤颜色无变化。

阴性反应则无透明环或肉汤呈深蓝色。

淀粉水解系逐步进行的过程，因而试验结果与菌种产生淀粉酶的能力、培养时间，培养基含有淀粉量和pH等均有一定关系。

培养基pH必须为中性或微酸性，以pH7.2最适。

淀粉琼脂平板不宜保存于冰箱，因而以临用时制备为妥。

·糖类发酵试验（葡萄糖、木糖和乳糖发酵）
用小砂轮轻轻切割发酵管没有标签和标识的另外一端，注意保留标签和糖的名称。

用接种针将各种杆菌分别接种于两种发酵管内，每种发酵管重复两次，标记，要与斜面菌种标记相对应。

两种发酵管各设一支不接种，作为空白对照。

注意接种的整个过程中，不能人为的制造气泡，若发酵管内有气泡，则轻轻甩动发酵管直至气泡消失。

若气泡不能退去，则该管作废应重做一管。

接种后，每一管外包一层无菌纸，以防污染。

接种完毕后，将全部发酵管倒置于干净小烧杯内，37℃培养24h。

观察记录：与对照管比较，若接种培养液保持原有颜色，其反应结果为阴性，表明该菌不能利用该种糖，记录用“－”表示；如培养液呈黄色，反应结果为阳性，表明该菌能分解该种糖产酸，记录用“＋”表示。

培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，表明该菌分解糖能产酸并产气，记录用“＋”表示；如杜氏小管内没有气泡为阴性反应，记录用“－”。

·乙酰甲基甲醇试验(V．P试验)
标记试管：取装有葡萄糖蛋白胨培养液的试管，编号。

接种培养
以无菌操作分别接种少量菌苔至以上相应试管中，空白对照管不接菌，置37℃恒温箱中，培养24h。

观察记录
取出以上试管，充分振荡2min。

每管分别加入40％NaOH溶液10～20滴，并加等量α-奈酚，振荡试管，以使空气中的氧溶入，置37℃恒温箱中保温15～30min后，若培养液呈红色，记录为V.P.试验阳性反应（用“＋”表示）；若不呈红色，记录为V.P.试验阴性反应（用“－”表示）。

·吲哚试验
试管标记
取装有蛋白胨水培养液的试管，编号。

接种培养
以无菌操作分别接种少量菌苔到以上相应试管中，空白对照管不接种，置37℃恒温箱中培养24h。

观察记录
在培养液中加入乙醚1～2ml，经充分振荡使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入5～10滴吲哚试剂（加入吲哚试剂后切勿摇动试管，以防破坏乙醚层影响结果观察），如有吲哚存在，乙醚层呈现玫瑰红色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应，阳性用“＋”、阴性用“－”表示。

·耐盐性试验
将分离获得的细菌分别接种在NaCl浓度为2%，10%，20%，25%，的牛肉膏蛋白胨液体培养基中,置37℃下培养,观察生长情况[7]。

·柠檬酸盐试验
取装有西蒙斯氏柠檬酸盐培养基的试管分别标记待测菌种的编号和空白对照以无菌操作分别将少量菌苔接种于各支相应的管中，然后置于37℃恒温箱中培养24h。

观察结果，若培养基变蓝色，则表明该菌能利用柠檬酸盐作为碳源而生长，即为阳性反应，以“＋”表示。

若培养基仍为绿色则为阴性反应，以“－”表示【8】。

6、产淀粉酶芽孢杆菌产淀粉酶活性的测定
发酵：将初筛纯菌种接种于30/250mL 种子培养基,37 ℃、250r/min摇床培养过夜。

种子液以2 %接种量接种于产酶液体培养基50/500mL ,相同条件培养72h ,发酵8000r/min，离心10min ,取上清液测酶活, 每个样品重复3 次,最后结果取平均值。

在Young等方法的基础上作了改进：取5ml 0.5%的可溶性淀粉溶液，在40℃水浴中预热10min，然后加适当稀释的酶液0.5ml，反应5min后，用5ml 0.1mol/L H2SO4终止反应。

取0.5ml反应液与5ml碘液显色，在620nm处测光密度。

以0.5ml水代替0.5ml反应液为空白，以不加酶液（加同样体积的缓冲液）的管为对照。

酶活力根据下式计算：
酶活力（u/ml）=(R-r)/R*50*D
式中R、r分别表示对照和反应液的光密度，D为酶的稀释倍数。

调整D使（R-r）/R在
0.2-0.7之间。

确定在40℃ 5min内水解1mg淀粉的酶量为一个活力单位。

菌种保藏法（斜面冰箱包保藏法）
将菌种接种在新鲜外面培养基上，定温培养长出丰满菌苔后（一般形成芽孢的细菌要形成芽孢），贴上标签，放在试管上，在棉塞部位用尼龙纸或防水纸包好，以防外界污染和水浸湿，放入4℃冰箱中保藏。

六、可能遇到的问题和需要注意的关键点。

1、要严格按照培养基配方配制培养基，防止杂菌污染。

2、观察结果时要注意滴加药量及反应时间。

3、严格无菌操作，防止污染情况的发生。

4、称药品用的药匙不要混用，称完药品应及时盖紧瓶盖。

调pH时要小心操作，避免回调。

不同培养基各有配制特点，要注意具体操作。

5、革兰氏染色时注意脱色的时间的控制，过长或过短都会影响实验结果。

6、进行染色鉴定时，都应有已知的对照菌种在同等条件下染色，然后进行对比记录结果。

7、在芽孢染色中，应注意温度的控制，避免染料在玻片上蒸腾，否则影响实验结果。