实验一淀粉酶产生菌的分离和酶活性测定-附件
《发酵工程实验》
《发酵⼯程实验》实验⼀淀粉酶⽣产菌的筛选⼀、实验⽬的学习淀粉酶产⽣菌的筛选⽅法。
⼆、实验原理淀粉酶在酿造、纺织、⾷品加⼯、医药等领域有⼴泛⽤途。
淀粉酶是⼀类淀粉⽔解酶的统称，它能将淀粉⽔解成糊精等⼩分⼦物质并进⼀步⽔解成麦芽糖或葡萄糖，淀粉被⽔解后，遇碘不再变蓝⾊，因此可根据淀粉培养基上透明圈的⼤⼩来判断所选菌株的淀粉酶活⼒。
三、实验⽤品1．样品淀粉含量丰富的⼟样。
2．培养基⾁汤培养基：⽜⾁膏3g，蛋⽩胨10g，NaCl 5g，加⽔⾄1000ml，pH7.0。
121℃灭菌20min。
初筛平板培养基：⽜⾁膏3g，蛋⽩胨10g，NaCl 5g，可溶性淀粉2g，琼脂18g，加⽔⾄1000ml，pH7.4。
121℃灭菌20min。
Lugol碘液：碘1g，碘化钾2g，蒸馏⽔300ml。
先将碘化钾溶解在少量⽔中，再将碘溶解于碘化钾溶液中，待碘全溶后，加⾜⽔即可。
3．器材⾼压蒸汽灭菌锅，超净⼯作台，电⼦天平，电炉，恒温振荡器，恒温培养箱；烧杯，量筒，三⾓瓶，培养⽫，移液管，洗⽿球，试管，试管架，接种针，涂布棒。
四、实验⽅法1．培养基制备：配制⾁汤培养基45ml，分装于250ml三⾓瓶中，纱布封⼝，灭菌。
配制初筛平板培养基350ml，分装于500ml三⾓瓶中，封⼝膜封⼝，灭菌。
2．倒平板：将融化的初筛平板培养基冷却⾄50～60℃，以⽆菌操作法倒⾄已灭菌的培养⽫中，⾄盖满底部。
冷却凝固待⽤。
3．样品预处理：取5g⼟样接⼊45ml⾁汤培养基中，30℃摇床振荡15min制成⼟壤悬液，此时的稀释度为10-1。
另取4⽀试管，分别记作10-2、10-3、10-4、10-5共5个梯度，每⽀试管内加⼊9mL⽆菌⽔。
⽤⽆菌移液管从三⾓瓶中吸取1mL⼟壤悬液，加⼊到10-2试管中混匀，再从此试管中吸取1mL加⼊到10-3试管中，依此类推直⾄10-5试管。
4．平板涂布分离：分别从不同稀释度的试管中吸取0.1ml悬液，均匀涂布于初筛培养基平板上，于30℃培养24～48h。
实验一 α-淀粉酶活力的测定
颜色变化终点要照像，并多媒体型实验结果 单独标注班级和小组名提交或图片型实验结果 直接写入在实验报告书里。
[实验报告书书写要求]
1. 实验报告书的编写要参考教师提出的写作格式规范。 2. 即：题目、作者（包括同组成员）、单位（班级和组别）、
酶活力单位（g/ml）=(60/T×20×2%×N)÷0.5
60 —酶活定义中反应时间为60min； T —反应时间（min）； 20 —可溶性淀粉的毫升数； 2% —可溶性淀粉浓度； N —酶液稀释倍数； 0.5 —测定时所用的稀酶液量（ml）。
表 1 α-淀粉酶活力测定结果
X
[实验结果处理要求]
酶活力单位gml60t202n05实验结果计算实验结果计算重复数反应时间min酶活力gmlmin要求实验过程中淀粉的颜色变化过程录像或颜色变化终点要照像并多媒体型实验结果单独标注班级和小组名提交或图片型实验结果直接写入在实验报告书里
实验一 α-淀粉酶活力的测定
[实验性质] 验证性实验 [实验学时] 2学时 [实验目的] (1) 掌握淀粉酶糖化淀粉的原理；
[实验步骤]
第一步：待测酶液的配制； 第二步：标准色的配制； 第三步：样品的酶解反应； 第四步：计算。
1. 待测酶液的制备
α-淀粉酶
1.000 g
①
50 mL
2. 标准色的配制
150mL
60℃,30 min
250 mL
③可溶性淀粉 2.0g
酶液
2%淀粉液
A液
②
B液
8.0 mL 1.0 mL
3. 样品测定步骤
中文摘要、中文关键词、英文摘要、英文关键词、前言、材 料与方法、结果与讨论、结论、参考文献等顺序。 2. 报告书的篇幅要求2000字以上。 3. 参考文献必须5篇以上，并至少有一篇英文。 4. 提交时间限为每周一 下午3点。先交到课代表，由课代表汇 总之后按时送到任课老师办公室。 5. 领取的报告书要妥善保管，期末考试时作参考。
产淀粉酶芽孢杆菌分离与酶活力测定
产淀粉酶芽孢杆菌的分离、纯化并发酵测定淀粉酶活力杨敏仪，罗桂莲，关婷婷，黄真梅，肖维兴，梁妃法注明：蓝色字体是已修改的一、实验目的1、掌握分离鉴定产淀粉酶微生物的方法；2、掌握测定酶活力的方法；3、培养自行设计、实施实验的能力。
二、实验原理1、土壤中含有各种微生物，其中产淀粉酶的枯草芽孢杆菌含量在不同土壤中含量也不同，因此实验前进行预埋工作，能使土壤中产淀粉酶的细菌含量增加。
待实验前取样即可。
2、在只用淀粉充当碳源的选择培养基中，只有能产生淀粉酶利用淀粉的菌体能成为优势菌种。
在淀粉选择培养基中，产淀粉酶的菌种可以得到富集及分离。
3、菌体可经革兰氏染色后在显微镜下被判断出是否为枯草芽孢杆菌。
4、在含有淀粉的鉴别培养基上的平板上，具有产淀粉酶能力的枯草芽孢杆菌，水解淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，在淀粉平板上菌落周围出现水解圈，但肉眼不易分辨，滴加碘液，未水解的淀粉呈蓝色，水解圈无色。
三、实验材料1、土壤样品湛师弘志苑后面的花圃，实验前一周在距土壤表层5—8厘米左右处填埋馒头，实验前一天用塑料袋在预埋处取样。
2、培养基淀粉培养基：可溶性淀粉1%，蛋白胨1%，葡萄糖0.5%，氯化钠0.5%，牛肉膏0.5%，琼脂粉2.0%，pH7，配制300ml种子培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，可溶性淀粉0.5%，琼脂粉2.0%，pH7,配制300ml发酵培养基：玉米粉 2% ，黄豆饼粉1.5 %， CaCl20.02% ， MgSO40.02 %， NaCl 0.25 %， K2HPO4 0.2 %，柠檬酸钠0.5 % ，硫酸氨0.075（溶解后），Na2HPO4 0.2% ，校正pH7.0，发酵培养条件为：温度37℃，装液100ml/250ml，配制200 ml3、试剂草酸铵结晶紫染液，95%乙醇，番红水溶液、卢戈氏碘液4、玻璃器皿锥形瓶（250mL）3个，培养皿40个，涂布棒1根，移液管（1mL）10根，试管15根，烧杯（250mL）5个，盖玻片、载玻片若干，5、其他仪器及设备：天平，pH试纸，棉花，牛皮纸，玻璃珠，超净工作台，生化培养箱，电热干燥箱，高压蒸汽灭菌锅，水浴锅，显微镜，接种环等四、实验步骤1、样本采集①在预埋处采取土样用塑料袋装好，不要损坏土壤的内部结构。
淀粉酶产生菌的筛选
实验一淀粉酶产生菌的筛选及酶活力测定指导老师：辛树权生命科学学院08级生物技术（三）班豆豆同组人：xx xxx摘要：自然界是微生物的大本营，实验室微生物几乎都是从自然界中选育出来的。
我们从学校的花坛中采集一些土壤样本，拿到实验室中，进行淀粉产生菌的筛选。
利用土壤制成菌液，将其涂抹在牛肉膏蛋白胨培养基上进行纯化，再用淀粉培养基培养，最后通过淀粉透明圈的大小来判断淀粉产生菌产淀粉的能力。
再使用分光光度计精确测量淀粉酶的酶活力。
关键词：淀粉酶；分离；纯化；透明圈；酶活力；摇瓶；分光光度计一、实验目的：1、学习从土壤中分离微生物的方法；2、学习淀粉酶产生菌的筛选方法3、了解分光光度计法测定酶活力的原理及方法。
二、实验原理：土壤中含有大量的微生物，将土壤稀释液涂在不同类型的培养基上，在适宜的环境中培养几天，细菌或者是其他的微生物便能在平板上生长繁殖，形成菌落。
将初次筛选得到的微生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀粉酶的细菌才能够利用培养集中的淀粉成分来完成自身的生命活动，才能够生存。
故在淀粉培养基上长出的菌便是淀粉产生菌。
在培养基上滴碘液，淀粉被分解掉的部分不显现蓝色，出现透明圈，可以通过透明圈的大小来初步判断菌种产淀粉的能力。
淀粉酶是指一类能催化分解淀粉分子中糖苷键的酶的总称，主要包括α－淀粉酶和β-淀粉酶等，α-淀粉酶可从淀粉分子内部切断淀粉的α-1,4糖苷键，形成麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖，是淀粉的粘度下降，因此又称为液化型淀粉酶。
淀粉遇碘呈蓝色。
这种淀粉-碘复合物在660nm处有较大的吸收峰，可用分光光度计测定。
随着酶的不断分作用，淀粉长链被切断，生成小分子的糊精，使其对碘的蓝色反应逐渐消失，因此可以根据一定时间内蓝色消失的程度为指标来测定α-淀粉酶的活力。
三、实验器材及试剂：1.、材料：长春师范学院家属楼前小菜园2培养基：（1）分离培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基（牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、溶于1000mL蒸馏水中，再加入15g琼脂粉，pH调至7.2，121℃灭菌15min，待冷却至50℃左右时，于超净工作台倒平板）（2）筛选培养基：淀粉培养基（可溶性淀粉 20g, 硝酸钾 1g, 磷酸氢二钾 0.5g, 氯化钠 0.5g, 硫酸镁 0.5g, 硫酸亚铁 0.01g, 琼脂 20g, 水 1000毫升，调整pH值到7.2～7.4。
实验一 淀粉酶产生菌的分离和酶活性测定 - 附件
本科学生实验报告学号： 124120463 姓名：学院：生命科学学院专业、班级： 12级生物技术班实验课程名称：酶工程实验一教师：吴倩云南师范大学教务处编印实验一淀粉酶产生菌的分离及酶活性测定一、目的要求1、掌握从土壤中分离酶产生菌的方法，学会应用微生物生态知识分离产酶微生物。
2、掌握淀粉酶活性测定的原理，学会淀粉酶活性的测定方法。
二、基本原理（一）淀粉酶产生菌的分离1.菌种的采集①要获得产生某种酶的菌种，可从富含该酶作用底物的场所去采集。
②胞外酶的稳定性和最适反应条件通常和菌的最适生长条件一致，因此要筛选具有某一特性的酶时，只要到相应的环境中采样即可。
2.富集培养①原理：采集到的样品中如果所需的菌很少，需要先经过富集培养，使所需的菌大量繁殖，而不需要的菌则不生长或少生长，以利于筛选。
②富集的方法：控制培养的温度、pH和营养成分等。
3.菌种的分离①淀粉与碘液反应会形成蓝色化合物。
②淀粉酶能使淀粉分解为葡萄糖，而葡萄糖与碘反应不会形成蓝色化合物，结果可使淀粉酶产生菌周围形成透明圈，从而筛选出淀粉酶产生菌。
（二）淀粉酶产生菌的发酵及葡萄糖标准曲线绘制1.原理：根据淀粉酶水解淀粉生成还原性糖，还原糖与3，5 -二硝基水杨酸共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定的范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈比例关系，可利用比色法在540nm进行测定。
2.酶活定义：在一定pH5.5、37℃条件下，每分钟内从底物溶液中分解释放1μmol葡萄糖所需要的酶量为一个酶活单位U/g。
酶活计算公式：酶活（U/g）=A×5×K×N×1000/（T×W）A:样品的OD值(平均值) K:标准曲线的斜率N:稀释倍数5:0.2毫升反应液转换为1毫升体积T:反应时间（min）1000:转换因子1mmol=1000μmolW:葡萄糖的分子量（180.2g/mol）3绘制标准曲线①先配制一系列浓度不同的标准溶液，用选定的显色剂进行显色，在一定波长下分别测定它们的吸光度A。
酶的活性测定实验报告
一、实验目的1. 了解酶活性测定的原理和方法。
2. 掌握酶活性测定的操作步骤。
3. 学会分析实验结果，了解酶活性受温度、pH值等因素的影响。
二、实验原理酶是一种生物催化剂，能够加速化学反应的进行。
酶活性是指酶催化特定反应的能力，通常以单位时间内底物消耗量或产物生成量来表示。
本实验采用比色法测定酶活性，通过测定酶催化反应产物的生成量来间接反映酶的活性。
三、实验材料与仪器1. 仪器：紫外分光光度计、恒温水浴、电子天平、移液器、试管等。
2. 试剂：淀粉酶、淀粉溶液、碘液、NaOH溶液、HCl溶液等。
3. 材料：新鲜土豆、苹果、黄瓜等。
四、实验步骤1. 淀粉酶的提取- 称取新鲜土豆或苹果，切碎后加入适量的蒸馏水，研磨成匀浆。
- 将匀浆过滤，取滤液备用。
2. 淀粉溶液的制备- 称取一定量的可溶性淀粉，加入适量的蒸馏水，搅拌均匀。
- 将淀粉溶液煮沸，使其糊化，冷却后备用。
3. 酶活性测定- 取适量淀粉溶液，加入一定量的酶液，混合均匀。
- 将混合液放入恒温水浴中，保持一定温度。
- 定时取样，用碘液滴定，计算淀粉的剩余量。
- 根据淀粉的剩余量，计算酶活性。
4. 不同温度、pH值对酶活性的影响- 将淀粉溶液和酶液在不同温度、pH值下进行混合，观察酶活性变化。
五、实验结果与分析1. 酶活性测定结果- 根据实验结果，计算酶活性单位。
2. 不同温度、pH值对酶活性的影响- 在不同温度、pH值下，酶活性变化如下：- 温度：在适宜的温度范围内，酶活性随着温度的升高而增加，超过适宜温度后，酶活性逐渐降低。
- pH值：在适宜的pH值范围内，酶活性随着pH值的升高而增加，超过适宜pH值后，酶活性逐渐降低。
六、实验结论1. 酶活性是指酶催化特定反应的能力，可以通过比色法等方法进行测定。
2. 酶活性受温度、pH值等因素的影响，适宜的温度和pH值可以提高酶活性。
3. 本实验成功测定了淀粉酶的活性，并探讨了温度、pH值等因素对酶活性的影响。
实验一 淀粉酶产生菌的筛选
实验一淀粉酶产生菌的筛选一、实验要求：1、写出完整的分离纯化淀粉酶产生菌的实验步骤；2、写出分离培养基及其相关试剂所需的量、仪器、器皿所需的量；3、掌握从土壤分离酵母菌的方法和技术，从样品中分离出所需菌株；4、学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养淀粉酶产生菌的培养条件和培养时间。
二、实验原理：用梯度稀释法来分离淀粉酶产生菌三、实验材料：1.培养皿、移液管、刮铲、显微镜等,2.可选取厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤 ;3.培养基与试剂 :牛肉膏、蛋白胨、NaCl 、可溶性淀粉、蒸馏水、琼脂粉。
四、实验步骤：1、选定采土点后，铲去表土层2-3cm，取3-10cm深层土壤5g，装入灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。
土样采集后应及时分离，凡不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥条件下，尽量减少其中菌相的变化。
2、培养基的配置，(1)分离培养基采用牛肉膏蛋白胨固体培养基加0.2%可溶性淀粉即牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、可溶性淀粉2g溶于1000mL蒸馏水中再加入15g琼脂粉pH调至7.2121℃灭菌15min待冷却至50℃左右时于超净工作台倒平板。
注:先将可溶性淀粉加少量蒸馏水调成糊状再加到溶化好的培养基中调匀; (2)分离培养基液体培养基采用牛肉膏蛋白胨固体培养基加0.2%可溶性淀粉,即牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、可溶性淀粉2g溶于1000mL蒸馏水中 pH调至7.2,121℃灭菌15min。
3、取所采的土样5g加入到三角瓶中,加入无菌水45mL,30℃摇床振荡30min制成土壤悬液,此时的稀释度为10-1。
另取7支试管分别记作10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8共8个梯度每支试管内加入9mL无菌水。
用无菌移液管从三角瓶中吸取1mL土壤悬液加入到10-2试管中混匀,再从此试管中吸取1mL加入到10-2试管中,依此类推直至10-7试管。
α-淀粉酶产生菌株(细菌)的分离纯化及检测
1、菌落周围有透明圈 2、菌落粗糙、颗粒感强、 边缘不整齐、有丝状感 （正反面）
32℃培养 24hr
仔细观察 生长菌落
有无透明 圈（有）
选择12个单 菌落，编号
点接于平板 相应区域
加入检测 碘液显色
测量透明圈 和菌落直径
计算D/d比 值（排序）
选择最好 3-4株菌种
划线接种 斜面
培养好后冰 箱保存备用
本次实验基本流程
准备工作 灭菌 制备分离 用平板 冷却99mL 无菌水 加入分离 样品振荡
十倍梯度 稀释涂布 平板分离
培养
菌落计数 挑菌点接 平板培养 测量透明 圈及菌落 直径 需要留下 培养 留于以后 的，挑于 实验用 斜面保存
平板点接检测流程 （尽量不要打开平板，无菌操作）
平板底部 “十字”划 分 四区域对 应编号
第二种 分离和检测用平板培养基 ——300mL/组
可溶性淀粉 30g； Na2HPO4 .12H2O 8g； （NH4）2SO4 4g； NH4Cl 1.5g； 3%豆粕粉浸出液 1000mL 琼脂 20g 121.3℃灭菌20分钟 注：如果还想使用自已组的设计培养基或其它培 养基也可以。 每组200mL培养基制备10个平板。
记录结果 填表计算
1、测量透明圈直径 2、测量菌落直径 3、计算透明圈与菌落直径比值（D/d） 4、根据D/d值大小排序（挑取4株于 斜面培养后备用）
平板菌落计数
总菌落数 计数 有透明圈 菌落计数
记录结果 填表计算
平板放入 冰箱保存
根据碘液 检测结果
挑取单菌 菌于斜面
清洗干净 平板（字）
1、细菌总数 2、产淀粉酶的菌数 3、产淀粉酶菌株占总菌数的比例
α-淀粉酶产生菌的分离筛选及酶学性质研究
安徽农业科学１６０ｒ／ｖａｉｎ摇床培养１２ｈ／’种子液以１０％的接种量接种于产酶发酵培养基上，３７℃、１６０ｒ／ｍｉｎ摇床培养２４ｈ后发酵液５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液测酶活力。
选取酶活力较高的菌株作为试验菌种。
１．４．Ｌ３酶活力的测定一１。
仅一淀粉酶能将淀粉水解为长短不一的短链糊精和少量的还原糖，而使淀粉对碘呈蓝紫色的特异反应逐渐消失，可以用这种显色消失的速度来衡量酶的活力。
用ＹｏｕｎｇＪ．Ｙ００改良法：取５ｒＩｌｌ０．５％可溶性淀粉溶液，在４０℃水浴中预热１０ｍｉｎ，然后加入适当稀释的酶液０．５ｍｌ，反应５ｍｉｎ后用５Ｉｌｌｌ０．１ｍｏｌ／ＬＨ２Ｓ０４溶液终止反应。
取０．５ｍ１反应液与５ｌＩｌｌ工作碘液显色，在６２０ｎｍ波长处测光密度。
以０．５ｍｌ水代替０．５ｒＩｌｌ反应液为空白，以不加酶液（加相同的水）的管为对照。
，酶活力单位定义为：在４０℃、５ｖａｉｎ内水解ｌｎ蟮淀粉（０．５％淀粉）的酶量为１个活力单位。
酶活力计算公式如下：酶活力（ｕ／ＩＩｌｌ）＝（民一Ｒ）／ＲｏＸ５０ＸＤ式中，尺。
、Ｒ分别为对照、反应液的光密度；Ｄ为酶的稀释倍数，调整Ｄ使（Ｒ一尺）／民在０．２～０．７。
１．４．２酶学性质的研究。
１．４．２．１酶反应最适温度的确定。
设置４０、６０、８０℃３个温度梯度，测定反应体系在不同温度下的酶活力，确定酶反应的最适温度。
１．４．２．２酶反应最适ｐＨ值的确定。
用不同的缓冲液设置ｐＨ值为４、６、ｌＯ３个梯度值，测定反应系在不同ｐＨ值下的酶活力，确定酶反应的最适ｐＨ值。
１．４．２．３ｃａ２＋对酶热稳定性的影响。
在１００℃下调整酶液中Ｃａ２＋的不同浓度，测定不同时间Ｆ的酶活力，确定ｃｄ＋对酶热稳定性的影响。
２结果与分析２．１Ｏｒ＂淀粉酶生产菌株的分离筛选２．１．１初筛结果。
采用碘熏法从淀粉筛选平板｝＝挑出ｌＯ株有明显淀粉水解圈（图１）的菌株。
图１菌种的水解圈Ｆｉｇ．１Ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｃｉｒｃｌｅｏｆｓｔｒａｉｎ２．１．２复筛结果。
实验一土壤中淀粉酶产生菌的分离和纯化
1.掌握常用培养基的配制方法。
2.掌握微生物的分离、纯化及菌种保藏的基本原理和方法。
3.练习微生物接种、移植和培养等基本技术，掌握无菌操作技术。
二、基本原理
在土壤、水、空气或人及动、植物体中，混杂生存着大量不同种类的微生物，从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。
3.3.4恒温培养：将划线平板倒置，于37℃（或28℃）培养，24hr后观察。
六注意事项
1 整个操作在无菌条件下进行
2 配置固体培养基时要等溶液煮沸再加琼脂
3 稀释土壤悬液时每次换枪头
4 高压蒸汽灭菌过程中，注意不要将待灭菌的物品摆放太密，以免妨碍空气流通；灭菌结束后，应待压力降至接近“0”时，才能打开放气阀，过早过急地排气，会由于瓶内压力下降的速度比锅内慢而造成瓶内液体冲出容器之外
1.5加塞培养基分装完毕，在试管口或三角烧瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。
1.6灭菌将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜，放回内层锅，并装入培养基，加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内，加热，0.103MPa，121℃并同时打开排气，使水沸腾以排除锅内的冷空气，待冷空气完全排尽后，关上排气，让锅内的温度随蒸气压力增加而逐渐上升；当锅内压力升到所需压力时，控制电压以维持恒温，并开始计算灭菌时间。30min后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至”0”时，打开排气，旋送螺铨，打开盖子，取出。
3.3.2 划A区：将平板倒置于酒精灯旁,左手拿出皿底并尽量使平板垂直于桌面，有培养基一面向着酒精灯(这时皿盖朝上，仍留在酒精灯旁)，右手拿接种环先在A区划3—4条连续的平行线(线条多少应依挑菌量的多少面定)。划完A区后应立即烧掉环上的残菌，以免因菌过多而影响后面各区的分离效果。在烧接种环时，左手持皿底并将其覆盖在皿盖上方(不要放入皿盖内)，以防止杂菌的污染。
高产淀粉酶菌株的分离与酶活性检测 2(1) 2
高产淀粉酶菌株的分离与酶活性检测西南大学生命科学学院 2011级5班第3小组自主实验摘要：土壤是微生物的良好生境，土壤中有多种类群的微生物，它们对自然界物质的转化和循环起着极为重要的作用，对农业生产和环境保护有着不可忽视的影响。
目的:从土壤中分离筛选高产淀粉酶菌株,方法:通过碘比色法比较水解圈的直径大小测酶活性高低,从而从土壤中分离筛选到高产淀粉酶的菌株关键词：土壤淀粉酶分离水解圈碘液淀粉酶是催化淀粉水解的一类酶的总称，广泛存在于动物、植物和微生物中，是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。
本实验从土壤中分离高产淀粉酶菌株并通过碘比色法比较水解圈的直径大小测酶活性高低。
一、实验材料1.1、实验取材从学校枯叶堆积处取土层下5-10cm处的土壤1.2、培养基配方淀粉培养基: 称取牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、NaC l 5 g、可溶性淀粉2 g 溶于900 m l蒸馏水中, 再加入25 g琼脂粉并搅拌至充分溶解, 调pH 至7. 2, 最后加蒸馏水定容至1000 m ,l 高压蒸汽灭菌;种子培养基( LB): 除不加琼脂粉外, 其它成分和淀粉培养基配置相同。
1.3、试剂与仪器碘液、烧杯（500ml）、锥形瓶（250ml）、酒精灯、培养皿、涂布棒、移液枪、无菌枪头、试管、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、摇床培养箱、接种环、记号笔等二、实验方法2.1、样品稀释称取酒曲样品10g溶于90mL 无菌水中,在37摄氏度摇床（200r/min）培养箱中培养2-3个小时，使菌体充分扩散到无菌水中。
静置，取上清至富集培养基的锥形瓶中。
在37摄氏度摇床（200r/min）培养箱中培养一天，使菌体富集。
将富集后的菌液分别用无菌水梯度稀释至 1 ×10 ^-6倍。
2.2、分离分别取10^-2 、10^-3、10^-4 、10^-5 、10^-6菌液0.2ml均匀涂布在10个淀粉培养基上，在37摄氏度培养箱培养2天，平板培养基表面便形成了若干菌落。
实验一：淀粉酶产生菌的筛选及酶活力测定
实验一：淀粉酶产生菌的筛选及酶活力测定指导老师：辛XX生命科学学院XX级生物技术班 XX同组人：XX,XX,XX,XX摘要：目的：从以分离到的细菌、放线菌和真菌中筛选出能产生生理活性物质的菌株并测出淀粉酶活力。
方法：利用土壤制成菌液，将其涂抹在牛肉膏蛋白胨培养基上进行纯化，再用淀粉培养基培养，最后通过淀粉透明圈的大小来判断淀粉产生菌产淀粉的能力。
再使用分光光度计精确测量淀粉酶的酶活力。
关键词：淀粉酶；透明圈；酶活力；分光光度计我们从学校的花坛中采集一些土壤样本，拿到实验室中，进行淀粉产生菌的筛选。
土壤中含有大量的微生物，将土壤稀释液涂在不同类型的培养基上，在适宜的环境中培养，几天后在拼板上课长出细菌或者是其他的微生物，并繁殖形成菌落。
将初次筛选得到的微生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀粉酶的细菌才能够利用培养集中的淀粉成分来完成自身的生命活动，才能够生存。
故在淀粉培养基上长出的菌便是淀粉产生菌。
淀粉酶是指一类能催化分解淀粉分子中糖苷键的酶的总称，它能将淀粉水解成糊精等小分子物质并进一步水解成麦芽糖或葡萄糖，淀粉遇到碘变蓝，这种淀粉-碘复合物在660nm处有较大的吸收峰，可用分光光度计测定。
随着酶的不断分作用，淀粉长链被切断，生成小分子的糊精，使其对碘的蓝色反应逐渐消失，因此可以根据一定时间内蓝色消失的程度为指标来测定α-淀粉酶的活力。
因此可以根据淀粉培养基上透明圈的大小来判断所选菌株的淀粉酶活力。
1材料和方法1.1材料1.1.1实验材料长春师范学院家属楼前小菜园1.1.2实验药品碘液、2%可溶性淀粉、pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、标准糊精溶液、0.5mol/L乙酸、0.85%生理盐水。
1.1.3实验仪器培养皿、锥形瓶、高压灭菌锅、超净工作台、恒温水浴锅、分光光度计。
1.2方法1.2.1培养基的配置（1）分离培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基（牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、溶于1000mL蒸馏水中，再加入15g琼脂粉，pH调至7.2，121℃灭菌15min，待冷却至50℃左右时，于超净工作台倒平板）（2）筛选培养基：淀粉培养基（可溶性淀粉 20g, 硝酸钾 1g, 磷酸氢二钾 0.5g, 氯化钠 0.5g,硫酸镁 0.5g, 硫酸亚铁 0.01g, 琼脂 20g, 水 1000毫升，调整pH值到7.2～7.4。
《产淀粉酶菌的分离纯化》实验方案设计
《产淀粉酶菌的分离纯化》实验方案设计产淀粉酶菌株的分离纯化一、实验目的1. 掌握产淀粉酶菌种的分离纯化的原理和方法技术；2. 巩固十倍稀释法。
二、实验原理土壤是微生物生活的大本营，是寻找有重要应用潜力的微生物主要的菌源。
因此本实验选择从土壤中分离出产淀粉酶菌种，再进行纯培养。
主要运用富集培养技术，稀释涂布平板法和平板划线分离法及无菌操作技术获得我们所需要的产淀粉酶菌种。
淀粉酶作用于淀粉时，打开了淀粉分子的糖苷键，从而使淀粉失去粘性，同时使其失去了与碘的显色反应能力，不再与碘结合，从而形成透明圈。
产淀粉酶菌株在选择培养基上培养后，会水解淀粉形成水解圈，加碘液染色后，水解圈尤为明显。
三、实验材料1. 菌种：从自然界筛选获得的淀粉酶产生菌种2. 土壤样品：从栽种土豆的菜园中采集土壤样品3. 培养基：淀粉液体培养基（50mL）：蛋白胨0.5g，NaCl 0.25g，牛肉膏0.25g，可溶性淀粉0.1g，蒸溜水50mL。
淀粉琼脂培养基(200mL)：蛋白胨2g，NaCl 1g，牛肉膏1g，可溶性淀粉0.4g，蒸溜水200mL，琼脂3-4g。
牛肉膏蛋白胨培养基(200mL)：蛋白胨2g，牛肉膏0.6g，NaCl 1g，琼脂3-4g，蒸馏水200mL，pH7.0-7.2。
4.其他用品：酒精灯、移液枪（20-200uL）、接种环、试管架、三角涂布棒（各一个），电子天平、三角烧瓶（5个）、试管（10支）、培养皿（15个）、1mL移液管（10支）、10mL移液管(1支)、无菌水（200mL）、微波炉、卢戈氏碘液。
四、试验方法1．样品采集用无菌报纸，在栽有土豆的菜园里，从不同的采样点采取土样约15g。
（注意应采取距地表2-3cm以下的土样）2．富集培养取土样10g，放入盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振动20min，使土样与水充分混合，使微生物分散开。
用一支1mL 的移液管移取1mL土样液，加入到盛有50mL淀粉液体培养基的三角瓶中进行富集培养，摇床110r/min，37℃，培养24h。
产淀粉酶菌种的筛选及酶活力检测
产胞外淀粉酶的菌株的筛选以及酶活力的测定一：实验原理异养型微生物在生存的时候，自己不能产生可以供机体使用的能源物质。
所以必须从体外获取这些能源物质。
某些异养型的微生物可以利用淀粉作为能源物质将其分解为葡萄糖让自己利用。
但是淀粉作为大分子的物质不能直接进入微生物的体内直接将其分解。
所以某些微生物会产生胞外淀粉酶，将自己周围的淀粉分解为葡萄糖。
再葡萄糖进行吸收利用。
本实验就是筛选出一种产胞外淀粉酶的高效菌株，并对其产生的胞外淀粉酶的酶活力进行初步检测。
二：实验器材，试剂1样品：发霉的面包，富含淀粉的土壤，2仪器：离心机，试管，紫外分光光度计，三角瓶，摇床，分析天平，定量移液器，药匙，培养皿，恒温水浴锅，恒温培养箱，超净工作台，接种环，接种针，酒精灯，高压灭菌锅，直尺，移液管，洗耳球。
3试剂：碘固体，DNS（3，5－二硝基水扬酸），1mg/ml的麦芽糖溶液，1%的淀粉标准溶液，PH为5.5的柠檬酸缓冲液。
4培养基：淀粉培养基：可溶性淀粉2g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl5g/L，琼脂20g/L，PH7.0。
种子培养基：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，pH7.0。
产酶培养基：可溶性淀粉2g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，氯化钠5g/L，pH7.0。
三：实验步骤1：初筛①若样品为富含淀粉的土壤，则称取土壤样品10g放在盛有90ml无菌水和8颗小玻璃珠的三角瓶中，放置在摇床上震荡30min后再进行七次梯度稀释，分别取第4,5,6,7次梯度稀释后的稀释液各1ml进行初步培养。
所用的培养基为淀粉培养基。
在37℃恒温培养箱中培养，直至培养基中长出明显的菌落。
②若样品为发霉的面包，则用接种环或接种针挑取部分的霉块。
将挑取的霉块浸泡在装有10ml无菌水的试管里震荡1min进行稀释。
取1ml稀释液进行初步培养。
所用培养基为淀粉培养基。
在37℃恒温培养箱中培养，直至培养基中长出明显的菌落。
自然界中产淀粉酶菌株分离纯化及酶活测定.
自然界中产淀粉酶菌株分离纯化及酶活测定淀粉酶（Amylase ）又称糖化酶，是指能使淀粉和糖原水解成糊精、麦芽糖和葡萄糖的酶的总称。
淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等α-1, 4-葡聚糖，水解α-1, 4-糖苷键的酶。
根据作用的方式可分为α-淀粉酶（EC 3. 2. 1. 1.）与β-淀粉酶（EC 3. 2. 1. 2. ）。
α-淀粉酶广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物；β-淀粉酶与α-淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断α-1, 4-葡聚糖链。
主要见于高等植物中（大麦、小麦、甘薯、大豆等），但也有报告在细菌、牛乳、霉菌中存在。
淀粉酶是一种用途极广的生物催化剂，广泛应用于造纸、食品、医药工业。
如饴糖、啤酒、黄酒、葡萄糖、味精、抗生素等行业；用于高质量的丝绸、人造棉、化学纤维退浆；制成不同品种的工业酶、医用酶、诊断酶等；在洗涤剂工业中，作为洗涤剂酶与碱性蛋白酶、脂肪酶一起添加于洗衣粉中制成多酶洗衣粉等具有极广泛的用途。
随着社会需求的增大，工业生产对淀粉酶的需求量越来越大，其在各领域应用广泛，急需寻找更高酶活的产酶菌株满足生产需要。
生淀粉酶是指对不经过蒸煮糊化的生淀粉颗粒能够表现出强水解活性的酶类。
70年代由于两次石油危机，引起各国学者从节能和有效利用天然资源出发，重视对生淀粉酶的研究。
研究大致分两个方面：一是探讨对生淀粉不经蒸煮，直接用于酒精发酵的可能性；另一则是从自然界中分离筛选能产生生淀粉酶的微生物，并进而研究生淀粉酶的酶学特性及其产生菌的徽生物学特性[1, 2]。
除动物自身的消化道可分泌一些淀粉酶外，淀粉酶的另外两大来源是植物和微生物能产生生淀粉酶的微生物较多。
Ueda [3, 4]，Mizokami [5]，Tamiguchi [6]，Kainuma [7]先后报道了Aspergillus awaraori，Rbizopus . sp．，Strepiococcus boris，Bacillus circulans，Chalara paradoxa等菌种均有产淀粉酶能力。
产淀粉酶细菌的筛选和选育 - 副本
微生物学实验报告第二模块产淀粉酶细菌的筛选和选育学院：生命科学学院班级：09级4班姓名：**学号：09090340产淀粉酶细菌的筛选和选育**生命科学学院 09级4班【摘要】从土壤中筛选、鉴定产淀粉酶菌株,并对菌株的分离筛选及诱变育种进行了研究。
利用淀粉平板透明圈法，从土壤中初步筛选出10株产淀粉酶菌株,通过比较淀粉酶菌落大小(C) 和水解圈大小(H)的比值,筛选出1株产淀粉酶活力较强的菌株。
依据菌种形态、生理生化特征和16SrDNA序列分析，将其鉴定为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）。
【关键词】淀粉酶分离鉴定诱变育种淀粉酶是能催化淀粉水解转化成葡萄糖、麦芽糖及其它低聚糖的一类酶的总称[1] 。
淀粉酶类大约占据了25 %的酶市场[2] ,在淀粉糖工业、食品工业、纺织工业、造纸工业以及酿酒行业中被广泛应用,几乎完全取代了淀粉加工中淀粉的化学水解[3]。
淀粉酶家族包括α-淀粉酶、β-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。
α- 淀粉酶为内切酶，以无规则的方式切开淀粉分子内部的α-1，4糖苷键，而使淀粉生成糊精和低聚糖，是一种钙离子依赖性酶。
β-淀粉酶从非还原性末端顺次切下麦芽糖，为外切酶。
葡萄糖淀粉酶是一种作用于α-1，4糖苷键的外切酶，从非还原糖末端切下葡萄糖分子。
[4]诱变育种已成为菌种选育研究中最常采用的研究手段，近年来，原生质体融合，代谢调控，基因工程等较为定向的诱变育种方法出现，但这些方法成功用在生产上的例子很少。
而紫外诱变育种仍为最广泛采用的诱变育种方法，它不仅可以提高菌株的生产能力，而且还可以改进产品质量，扩大生产，简化工艺；同时，它还具有速度快，收效显著和方法简便等优点，因此在科学实验和生产上都得到了广泛的应用。
本试验应用淀粉平板透明圈法，筛选出了1株产淀粉酶较高的菌株，并对菌种的分离鉴定及紫外诱变育种进行了研究，探讨了该突变株的产酶最适培养条件，为生物工程和淀粉酶工程寻求了更为高效、经济的方法。
土壤中含淀粉酶细菌的分离实验报告
土壤中含淀粉酶细菌的分离摘要：本实验通过培养基的配制，常用器皿的准备及无菌水的配制为从土壤中分离出产淀粉酶细菌做了准备。
又通过加热和不加热分组来观察两组相同的分密度梯次的细菌的生长情况和菌落数。
还利用含淀粉酶细菌能够分泌淀粉酶，淀粉酶能够分解淀粉，淀粉能与碘试剂发生显色反应，含淀粉酶细菌菌落生长的地方不能放生显色反应而呈现透明圈，通过统计透明圈数来分析培养基浓度和温度对土壤中细菌菌落的形成的影响及土壤中有淀粉酶活性细菌占总细菌的比例。
关键词：培养基土壤微生物菌种分离含淀粉酶细菌1、前言土壤中生活着许许多多的不同种类的、数量庞大的微生物，是微生物多样性的重要场所，它们对自然界物质的转化和循环起着极为重要的作用，对农业和环境保护有着不可忽视的影响。
早在十九世纪中期，农业化学和细菌学的形成和发展为研究土壤中物质转化的微生物学过程开辟了道路。
二十世纪五十年代，人们对土壤只能够诸营养元素循环的各个环节的微生物学过程进行了深入的研究，论证了土壤微生物对增强土壤肥力的作用。
新中国成立后，国家开展了对土壤微生物的教学和科学研究，文革后国家给予力支持，二十年来的奋力研究取得骄人的成绩。
现如今，生物技术迅猛发展，一些仅在实验室里制备用于研究的细菌已经可以工业化大规模生产，可以利用该生物的有机体或其产物，将物料转化为商业性产品，在食品、轻工、医药及农林等方面广泛应用。
本实验是从土壤中筛选可以生产淀粉酶细菌为目的，利用物理和化学方法探究稀释度对细菌菌落形成的影响，以及用不同的处理方式反映出高温加热对含有高活性淀粉酶细菌的比例产生影响。
2、材料与方法2.1 材料2.1.1 培养基配制的材料与试剂材料：土豆200g ，葡萄糖20g ，琼脂粉2% 6g ，淀粉1% 3g ，废报纸，棉花，纱布，棉绳试剂：无菌水2.1.2 玻璃器皿无菌培养皿，无菌吸管，试管十支，移液管两支2ml，圆底培养皿十个，玻璃珠20颗，三角瓶50ml，具塞三角瓶2.1.3 样品新鲜土壤2.2 方法2.2.1 PDA溶粉的培养基制备把土豆削皮，切成边长1-2cm，称取60g倒入大三角瓶中，加600ml水并在电炉上煮沸20min，边加热边振荡以免烧糊，趁热在纱布上过滤，在滤液中添加6g葡萄糖，再加入3g1%的淀粉和6g2%的琼脂粉，加热熔化，定容至250ml，然后用制作好的棉塞塞住瓶口，再用旧报纸包一层包扎好，在灭菌后把培养基放入养箱中培养24小时。
《产淀粉酶菌的分离纯化》实验方案设计
《产淀粉酶菌的分离纯化》实验方案设计一、实验目的1. 学习进行微生物的分离纯化技术；2. 了解产淀粉酶菌的特性及其分布情况；3. 掌握酶活性的测定方法。
二、实验原理1. 淀粉酶的作用原理：淀粉酶是一种酶，能够分解淀粉为糖类，在微生物领域中，主要用来测定产淀粉酶菌的酶活性。
2. 微生物的分离纯化：通过微生物分离鉴定方法可以筛选出产淀粉酶菌，并进行分离纯化，其中包括表面接种法、液体菌种鉴定法等。
三、实验步骤1. 采样：采取合适的方法选择样品进行采取，如土壤样品、水样、废弃物等；2. 培养：将采取的样品进行接种并培养于适宜的菌种培养基中，环境条件应符合产淀粉酶菌的生长需求；3. 分离：通过常规分离方法进行分离，如表面接种法，可将菌落形态清晰的约8-10个菌落分别转移到其它培养基上，进行单菌落质量检查，然后进行挑选；4. 鉴定：对于产淀粉酶菌的鉴定有多种方式，如细菌形态、生理生化反应等；5. 纯化：将鉴定出的产淀粉酶菌进行分离纯化，可采用多种方法，如悬浮液稀释、柠檬酸-NaOH柱层析，以及聚丙烯酰胺凝胶电泳等。
四、实验注意事项1. 实验操作要严格遵守微生物的安全操作规范；2. 实验过程中要严格控制温度、湿度等环境条件，以保证产淀粉酶菌的正常生长；3. 实验设备、试剂应做好消毒处理；4. 对实验中出现的不明菌落应及时进行鉴定和处理；5. 实验后要做好设备及消毒剂的清洗工作。
五、实验结果分析1. 产淀粉酶菌分离纯化后可进行酶活性测定，得出具体的酶活性值；2. 酶活性值与产淀粉酶菌的菌种、产生淀粉酶的量等因素相关；3. 实验结果可反映出产淀粉酶菌的分布情况及其产酶的峰值期等信息。
六、实验拓展1. 可通过实验数据，筛选产酶量高的淀粉酶菌进行进一步研究开发；2. 可实验条件、测定方法等进行改进，提高产淀粉酶菌的分离纯化效率及酶活性测定准确度。
七、实验结论通过对产淀粉酶菌的分离纯化和酶活性测定，可以研究淀粉酶的特性及其在工业、农业等方面的应用，为淀粉酶的开发应用提供物质基础。
淀粉酶活力测定实验报告
淀粉酶活力测定实验报告淀粉酶活力测定实验报告实验三、淀粉酶活性的测定实验报告实验四、淀粉酶活性的测定一、实验目的:1、了解α - 淀粉酶和β - 淀粉酶的不同性质及其淀粉酶活性测定的意义;2、学会比色法测定淀粉酶活性的原理及操作要点。
二、实验原理:淀粉酶存在于几乎所有植物中，特别是萌发后的禾谷类种子，淀粉酶活力最强，其中主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。
根据α-淀粉酶和β-淀粉酶特性不同，α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化;β-淀粉酶不耐热，70? 15min 则被钝化。
测定时，使其中一种酶失活，即可测出另一种酶的活性。
淀粉在淀粉酶的催化作用下可生成麦芽糖，利用麦芽糖的还原性与3,5-二硝基水杨酸反应生成棕色的3-氨基-5-硝基水杨酸，测定其吸光度，从而确定酶液中淀粉酶活力(单位重量样品在一定时间内生成麦芽糖的量)。
三、实验用具:1、实验设备研钵,具塞刻度试管,离心管，分光光度计，酸度计，电热恒温水浴锅，离心机，电磁炉。
2、实验材料与试剂(1)0.1mol/l pH5.6的柠檬酸缓冲液:A液:称取柠檬酸20.01g，定容至1000ml;B液:称取柠檬酸钠29.41g，定容至1000ml;取A液55ml与B液145ml混匀。
(2)1%可溶性淀粉溶液:1g淀粉溶于100ml 0.1mol/l pH5.6的柠檬酸缓冲液;(3)1%3,5-二硝基水杨酸试剂:称取3,5-二硝基水杨酸1g、NaOH 1.6g、酒石酸钾钠30g，定容至100ml水中，紧盖瓶塞，勿使CO2进入;(4)麦芽糖标准溶液:取麦芽糖0.1g溶于100ml水中;(5)pH 6.8的磷酸缓冲液: 取磷酸二氢钾6.8g,加水500ml使溶解，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8，加水稀释至1000ml即得。
(6)0.4mol/L的NaOH溶液;(7)1%NaCl溶液。
(8)实验材料:萌发的谷物种子(芽长约1cm)四、操作步骤1、酶液提取:取6.0g浸泡好的原料，去皮后加入10.0mL 1%的NaCl 溶液，磨碎后以2000r/min 离心10min，转出上清液备用。
土壤淀粉酶产生菌的分离纯化及相关性质测定
土壤淀粉酶产生菌的分离纯化及相关性质测定摘要：为了了解土壤中微生物的种类和特征并从中分离出淀粉酶产生菌，对其进行纯化和培养，并测定其产生的淀粉酶的活性以及对其进行生理生化试验，了解其代谢特征，需要进行一系列的实验，并在此过程中掌握分离纯化微生物、微生物液体培养法、透明圈法测定淀粉酶活力以及生理生化试验的操作方法和原理。
主要实验过程如下：从土壤中筛选淀粉酶产生菌后进行复筛，接着进行种子培养，所得发酵液用于淀粉酶活力的测定以及生理生化反应。
关键词：土壤淀粉酶产生菌分离纯化发酵培养透明圈法生理生化试验正文：1、土壤淀粉酶产生菌的分离与纯化1.1 实验原理在自然条件下，微生物常常在各种生态系统中群居杂聚。
为了研究某种微生物的特性，或者大量培养和利用某一种微生物，必须事先从有关的生态环境中分离出所需的菌株，获得纯培养。
获得纯培养的方法称为微生物的纯种分离法，也即是从含有多种杂居在一起的微生物材料中，通过稀释分离、划线分离、单孢子分离等方法，使它们分离成为单个个体并在固定培养基的固定地方繁殖成为单个菌落，从单个菌落中挑选所需纯种。
不同微生物可用不同培养基和不同培养条件进行单菌分离获得纯种，纯种再经繁殖培养后，可用于进一步研究形态、生理等欲从含有多种微生物的样品中直接辨认出，并且取得某种所需微生物的个体进行纯培养，那是困难的。
由于微生物可以形成菌落，而每个单一菌落常常是由一种个体繁殖而成。
不同微生物的菌落是可以识别和加以鉴定的。
因此将样品中不同微生物个体在特定的培养基上培养出不同的单一菌落，再从选定的某一所需菌落中取样，移植到新的培养基中去，就可以达到分离纯种的目的。
这就是纯种分离法的原理。
在微生物的分离和纯种培养过程中，必须使用无菌操作技术。
所谓无菌操作，就是在分离、接种、移植等各个操作环节中，必须保证在操作过程中杜绝外界环境中的杂菌进入培养的容器。
淀粉是有葡萄糖通过α-1,4糖苷键构成的直链淀粉和α-1,6位有分支的直链淀粉组成的。
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YUNNAN NORMAL U NIVERSITY
本科学生实验报告
学号：124120463 姓名：________________________
学院：生命科学学院专业、班级：12 级生物技术班
实验课程名称：_________ 酶工程实验一_______________________ 师：________ 吴倩_______________________________
云南师范大学教务处编印
实验一淀粉酶产生菌的分离及酶活性测定
一、目的要求
1、掌握从土壤中分离酶产生菌的方法，学会应用微生物生态知识分离产酶微生物。
2、掌握淀粉酶活性测定的原理，学会淀粉酶活性的测定方法。
二、基本原理
（一）淀粉酶产生菌的分离
1. 菌种的采集
①要获得产生某种酶的菌种，可从富含该酶作用底物的场所去采集。
②胞外酶的稳定性和最适反应条件通常和菌的最适生长条件一致，因此要筛选具有
某一特性的酶时，只要到相应的环境中采样即可。
2. 富集培养
①原理：采集到的样品中如果所需的菌很少，需要先经过富集培养，使所需的菌大
量繁殖，而不需要的菌则不生长或少生长，以利于筛选。
②富集的方法：控制培养的温度、pH和营养成分等。
3. 菌种的分离
①淀粉与碘液反应会形成蓝色化合物。
②淀粉酶能使淀粉分解为葡萄糖，而葡萄糖与碘反应不会形成蓝色化合物，结果可
使淀粉酶产生菌周围形成透明圈，从而筛选出淀粉酶产生菌。
（二）淀粉酶产生菌的发酵及葡萄糖标准曲线绘制
1. 原理：根据淀粉酶水解淀粉生成还原性糖，还原糖与3，5 -二硝基水杨酸共热
后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定的范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈比例关系，可利用比色法在540nm 进行测定。
2. 酶活定义：在一定pH5.5、37C条件下，每分钟内从底物溶液中分解释放
1卩mol葡萄糖所需要的酶量为一个酶活单位U/g。
酶活计算公式：酶活（U/g）=A X 5X K X N X 1000/（T X W）
A:样品的OD值（平均值）K:标准曲线的斜率
N:稀释倍数5:0.2毫升反应液转换为1毫升体积T:反应时间（min）1000:转换因子1mmol=1000 ^mol
W:葡萄糖的分子量（180.2g/mol）
3 绘制标准曲线
①先配制一系列浓度不同的标准溶液，用选定的显色剂进行显色，在一定波长下分
别测定它们的吸光度A。
②以A 为横坐标，浓度c 为纵坐标，则得到一条拟合度较好的直线，称为标准曲
线。
③然后使用用完全相同的方法和步骤测定被测溶液的吸光度，便可从标准曲线上找
出对应的被测溶液浓度或含量
三、器材
1试剂：
可溶性淀粉、碘、碘化钾、 HCI 、柠檬酸、Na2HPO4 12H2O 等
o 严并甘・
2培养基：
分离、纯化培 养基
3仪器：
① 平皿、 三角瓶、大试管、1mL 和10mL 移液枪、涂棒；
② 天平、超净工作台、培养箱、电冰箱、恒温调速摇瓶柜、离心机、恒温 水浴锅、紫外分光光度计、比色皿、记时器、高压灭菌锅。
四、操作步骤
（一）淀粉酶产生菌的分离
1. 培养基 的配制及灭菌
倒平板配制分离培养基
'高压灭菌30min 冷却至约50C
倒7块平板/140mL 1
=冷却备用
2. 制备土壤稀释液
① 称取土样1g ,放入9mL 无菌水试管中，摇动10min ,静置10min,制备得 到10-
1 土壤稀释液； ② 用无菌吸管吸出1mL 土壤悬液，加入盛有9mL 无菌水的大试管中，充分 混匀，制备得到10-
2 土壤稀释液； ③ 再从中吸出1mL 加入盛有9mL 无菌水的大试管中，混匀后得到10-
3 土壤 稀释
液；
④ 以此类推，分别制备得到10-4、10-5、10-6、10-7 土壤稀释液。
3. 涂布
用无菌吸管分别吸取10-3、10-4、10-5、10-6 和10-7 土壤稀释液各
0.1mL ，对号放入已经写好记号的平板中央，用无菌玻璃涂棒涂匀。
4. 培养纯化
②配置发酵培养基200mL/S （ 40mL/瓶' 最大的亍' 菌落接种于发酵培养基中
72h 。
2.葡萄糖标准曲线的制作
①精确称取0.100g 葡萄糖，用缓冲溶液定容至100ml ，制得浓度为1mg/ml 的葡萄糖的
标准溶液。
标准曲线如下图表所示：
挑取其中透明圈较大的单菌落，划线于平板， 杂菌需再一次进行纯化直到获得纯培养）。
5.产淀粉酶微生物的鉴定
向平板内加入稀碘液数滴后进行观察
（二）淀粉酶产生菌的发酵及葡萄糖标准曲线绘制
1.淀粉酶产生菌的发酵
①分离培
可溶性淀粉：0.7g
KH2PO4 : 0.07g
琼脂 ：2.8g 37C 倒置培养2〜3d （如发现
的配制： 蛋白胨：0.7g
MgSO4?7H2 :0.02g
酵母膏：0.7g
CaCl2?2H2O : 0.08g
将纯培养得到的（透明圈 30 C 1
「50r/min 摇瓶发酵约
②待测酶液的制备:
a.将发酵液倒入离心管中离心，离心条件4000转/5分钟，将离心后的上清液倾入
试管中，稀释一定倍数测定其酶活力
b.底物溶液一2%®粉溶液（需当天配置）
称取2.0克可溶性淀粉，用约80mL缓冲液调匀，加热煮沸直到淀粉完全溶解；
冷却，并用缓冲液定容至100mL
注：如果测定所得OD fi不在有效值（0.2-0.8 ）范围内，则相应地降低或增大稀释倍数后再进行测定。
五、酶活测定注意事项注：
1. 试管上编号：贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落；
2. 移液枪的使用：向试管内加入待测酶液或DNS寸，枪头不要触碰管壁，也不要伸
入液面下，连续吸取同一种溶液时可以不用更换枪头！
3. 精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理；
4. 避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时；
5. 实验结果的记录与分析
六、实验报告
（二）葡萄糖标准曲线绘制 ①葡萄糖标准曲线的制作 葡萄糖标准曲线
OD
+ 系列1 -- 线性（系列
严*—量含糖萄葡
0D的平均值=(A+B /2=(0.332+0.289)/2=0.3105
根据酶活计算公式：
酶活(u/g) = ((A X K+b) X N X 1000/(T X W))x 5
A:样品的OD值(平均值)K:标准曲线的斜率
N :稀释倍数5:0.2毫升反应液转换为1 毫升体积
T:反应时间(min) 1000:转换因子1mmol=1000 gol
W:葡萄糖的分子量(180.2g/mol)
代入数据可得：
酶活( u/g)=( (A X K+b)X N X1000/(T X W))X 5 =((0.3105X0.9479+0.126)X 1X1000/(15X180.2)) X5 = 0.7775
3、思考题：请你建立一个“筛子”，从土壤中筛选出能产生植酸酶的微生物。
答：采集土样(除土层表面枯枝、杂草和砂石，收集距表层5cm~10cmt壤)
将采集的土样进行10 -1 ~10 -6 梯度稀释后，分别涂布于改良的含溴甲酚绿的植酸钙平板初筛培养基上，在30E的恒温箱中培养3d,然后观察菌落周围是否形成透明水解圈。
因为培养集中含有水溶性较差的植酸钙，因而含植酸钙的平板上会呈现浑浊态。
若菌株代谢产生植酸酶，植酸钙被酶降解，在菌落周围形成透明水解圈，可起到一定指示作用。
此外可选取溴甲酚绿、溴甲酚紫、中性红及刚果红等4 种常用染色剂添加至平板初筛培养基中，在加深培养基背景色的同时，以增强植酸钙水解后形成的透明圈可见性。