实验一淀粉酶产生菌的分离和酶活性测定-附件

YUNNAN NORMAL U NIVERSITY

本科学生实验报告

学号：124120463 姓名：________________________

学院：生命科学学院专业、班级：12 级生物技术班

实验课程名称：_________ 酶工程实验一_______________________ 师：________ 吴倩_______________________________

云南师范大学教务处编印

实验一淀粉酶产生菌的分离及酶活性测定

一、目的要求

1、掌握从土壤中分离酶产生菌的方法，学会应用微生物生态知识分离产酶微生物。

2、掌握淀粉酶活性测定的原理，学会淀粉酶活性的测定方法。

二、基本原理

（一）淀粉酶产生菌的分离

1. 菌种的采集

①要获得产生某种酶的菌种，可从富含该酶作用底物的场所去采集。

②胞外酶的稳定性和最适反应条件通常和菌的最适生长条件一致，因此要筛选具有

某一特性的酶时，只要到相应的环境中采样即可。

2. 富集培养

①原理：采集到的样品中如果所需的菌很少，需要先经过富集培养，使所需的菌大

量繁殖，而不需要的菌则不生长或少生长，以利于筛选。

②富集的方法：控制培养的温度、pH和营养成分等。

3. 菌种的分离

①淀粉与碘液反应会形成蓝色化合物。

②淀粉酶能使淀粉分解为葡萄糖，而葡萄糖与碘反应不会形成蓝色化合物，结果可

使淀粉酶产生菌周围形成透明圈，从而筛选出淀粉酶产生菌。

（二）淀粉酶产生菌的发酵及葡萄糖标准曲线绘制

1. 原理：根据淀粉酶水解淀粉生成还原性糖，还原糖与3，5 -二硝基水杨酸共热

后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定的范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈比例关系，可利用比色法在540nm 进行测定。

2. 酶活定义：在一定pH5.5、37C条件下，每分钟内从底物溶液中分解释放

1卩mol葡萄糖所需要的酶量为一个酶活单位U/g。

酶活计算公式：酶活（U/g）=A X 5X K X N X 1000/（T X W）

A:样品的OD值（平均值）K:标准曲线的斜率

N:稀释倍数5:0.2毫升反应液转换为1毫升体积T:反应时间（min）1000:转换因子1mmol=1000 ^mol

W:葡萄糖的分子量（180.2g/mol）

3 绘制标准曲线

①先配制一系列浓度不同的标准溶液，用选定的显色剂进行显色，在一定波长下分

别测定它们的吸光度A。

②以A 为横坐标，浓度c 为纵坐标，则得到一条拟合度较好的直线，称为标准曲

线。

③然后使用用完全相同的方法和步骤测定被测溶液的吸光度，便可从标准曲线上找

出对应的被测溶液浓度或含量

三、器材

1试剂：

可溶性淀粉、碘、碘化钾、 HCI 、柠檬酸、Na2HPO4 12H2O 等

o 严并甘・

2培养基：

分离、纯化培 养基

3仪器：

① 平皿、 三角瓶、大试管、1mL 和10mL 移液枪、涂棒；

② 天平、超净工作台、培养箱、电冰箱、恒温调速摇瓶柜、离心机、恒温 水浴锅、紫外分光光度计、比色皿、记时器、高压灭菌锅。

四、操作步骤

（一）淀粉酶产生菌的分离

1. 培养基 的配制及灭菌

倒平板配制分离培养基

'高压灭菌30min 冷却至约50C

倒7块平板/140mL 1

=冷却备用

2. 制备土壤稀释液

① 称取土样1g ,放入9mL 无菌水试管中，摇动10min ,静置10min,制备得 到10-

1 土壤稀释液； ② 用无菌吸管吸出1mL 土壤悬液，加入盛有9mL 无菌水的大试管中，充分 混匀，制备得到10-

2 土壤稀释液； ③ 再从中吸出1mL 加入盛有9mL 无菌水的大试管中，混匀后得到10-

3 土壤 稀释

液；

④ 以此类推，分别制备得到10-4、10-5、10-6、10-7 土壤稀释液。

3. 涂布

用无菌吸管分别吸取10-3、10-4、10-5、10-6 和10-7 土壤稀释液各

0.1mL ，对号放入已经写好记号的平板中央，用无菌玻璃涂棒涂匀。 4. 培养纯化

②配置发酵培养基200mL/S （ 40mL/瓶' 最大的亍' 菌落接种于发酵培养基中

72h 。

2.葡萄糖标准曲线的制作

①精确称取0.100g 葡萄糖，用缓冲溶液定容至100ml ，制得浓度为1mg/ml 的葡萄糖的

标准溶液。标准曲线如下图表所示：

挑取其中透明圈较大的单菌落，划线于平板， 杂菌需再一次进行纯化直到获得纯培养）。 5.产淀粉酶微生物的鉴定

向平板内加入稀碘液数滴后进行观察

（二）淀粉酶产生菌的发酵及葡萄糖标准曲线绘制

1.淀粉酶产生菌的发酵

①分离培

可溶性淀粉：0.7g

KH2PO4 : 0.07g

琼脂 ：2.8g 37C 倒置培养2〜3d （如发现

的配制： 蛋白胨：0.7g

MgSO4?7H2 :0.02g

酵母膏：0.7g

CaCl2?2H2O : 0.08g

将纯培养得到的（透明圈 30 C 1

「50r/min 摇瓶发酵约

②待测酶液的制备:

a.将发酵液倒入离心管中离心，离心条件4000转/5分钟，将离心后的上清液倾入

试管中，稀释一定倍数测定其酶活力

b.底物溶液一2%®粉溶液（需当天配置）

称取2.0克可溶性淀粉，用约80mL缓冲液调匀，加热煮沸直到淀粉完全溶解；

冷却，并用缓冲液定容至100mL

注：如果测定所得OD fi不在有效值（0.2-0.8 ）范围内，则相应地降低或增大稀释倍数后再进行测定。

五、酶活测定注意事项注：

1. 试管上编号：贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落；

2. 移液枪的使用：向试管内加入待测酶液或DNS寸，枪头不要触碰管壁，也不要伸

入液面下，连续吸取同一种溶液时可以不用更换枪头！

3. 精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理；

4. 避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时；