保留时间漂移

一．飘移的保留时间
Q：我的色谱峰保留时间在漂移，这是什么问题？
A：这是一个有趣的问题，可能有不同的原因，让我们一个一个来看。

大多数人通常假设保留时间的漂移是平衡问题。

如果你在使用未修饰的硅胶柱做正相色谱，那么这是最可能发生的问题。

正相色谱的保留时间容易受到硅胶表面吸附的水含量的影响，然后是溶解在流动相中的水的作用。

因为水在正己烷或二氯甲烷等试剂中的溶解度非常低，所以色谱柱平衡需要很长时间。

我曾见过使用非常干燥的正己烷平衡一星期后保留时间仍然漂移的情况，所以建议避免使用非常干燥的试剂。

通常解决硅胶和水的平衡问题的办法就是使用与水“半饱和”的试剂。

制备方法是把1体积的疏水试剂用水饱和后，再与相同体积的“干燥”试剂混合。

这个方法可以极大的加快平衡时间。

在反相色谱中，平衡通常会很快。

几个（5－10）柱体积的流动相通常就足够平衡了，但这也不是全部情况。

值得注意的是在离子对色谱中，使用离子对试剂平衡色谱柱。

典型的离子对试剂使用浓度在2－5个umol/L或者更少，它们吸附在反相色谱柱填料表面，表面浓度在0.5-2 mmol/m2。

1根250*4.6mm的色谱柱有大约3g表面积330 m2/g的填料，这意味着一根色谱柱有大约1000 m2的表面积，完全平衡需要2mol的浓度2 umol/L的试剂，这虽然是极端状况，但如果用几百毫升的流动相去平衡色谱柱也是很正常的。

因此在保存色谱柱时，用有机溶剂代替离子对试剂保存过夜是不明智的，因为离子对试剂被清除后，第二天你又要花很长时间去平衡。

Q：所有这些现象都有共同的因素：流动相含有低浓度的强吸附试剂。

这是保留时间漂移最常见的原因么？
A：我想就是那样的，其它的现象不多见。

但是强吸附剂也可能源于样品。

这种情况下它们在重复进样中会慢慢累积，从而改变色谱柱的化学性质。

举个例子，药品中的赋形剂。

我们可以通过观察保留时间变化的速率来得知杂质是从流动相中引入还是从样品中引入。

实验如下：
1．进样几次，例如，4次一共1小时进样。

2．走相同量的流动相，不进样。

3．重复第一步
4．做一个关系图，保留时间
a.对时间的关系
b.对进样次数的关系
如果第一个图得到一条平滑的曲线，那么流动相是引入杂质的原因。

如果第二个图得到一条平滑的曲线，那么杂质的来源是样品。

Q：还是其它保留时间漂移的原因么？
A：是的，如果流动相的组成随着时间改变，那么就有可能导致保留时间漂移。

如果你没有使用仪器的在线混合装置，那么流动相的组分可能在缓慢的蒸发。

当你用氦气流喷射流动相的方法赶气泡的时候，你必须控制喷射的速率最小。

此外，一个经常被忽视的原因就是键合相的水解。

制造商通常会指定一个PH范围，超出范围可能导致键合相“不稳定”。

这个范围通常是PH2-8或9。

然而，人们会有很多原因不
得不接近这个极限。

这不是一个明显的分界线，因为水解也会取决于其他因素如温度或有机溶剂，但是缓慢的水解会在这个极限上发生。

要保持固定相的水解稳定性，最好是在中性PH值，低温下3-5左右，等度条件好于梯度条件。

当等度条件下发生水解时，键合相通常会自我吸附，达成一种区域平衡。

然而，在使用高浓度的有机溶剂时，例如在梯度洗脱或者冲洗色谱柱的过程中，这种平衡被打破，键合相会被冲洗出色谱柱。

Q：我会记住的。

温度能导致保留时间漂移么？
A：是的，温度通常是有可能的。

如果你的样品是自动分析过夜或者过了周末的，那么你得到的保留时间漂移的结果可能和实验室温度变化有关。

在许多地方，室温的设置在晚上或者周末通常是不一样的。

通常来讲，1℃的变化导致保留时间漂移大约1%到2%。

这个可以联系最后一个导致保留时间漂移的原因－色谱柱返压的增加。

增加的返压表明色谱柱被污染，但是仅仅是污染的塞板还足以影响保留时间。

压力会让流动相通过塞板时产生比正常情况大的摩擦，导致流动相受热，这个增加的温度会导致保留时间的漂移。

此外还有其他的一些原因，但是极少发生。

在反相色谱上发生平衡很慢的现象是由于流动相中有机溶剂比例太少。

高键合覆盖率、“完全封端”的C18没有被流动相良好的“湿润”。

这会导致一些现象，如流动相和固定相失去联系造成的“疏水塌陷”，这是由于固定相之间的相互吸附，从而导致可用于和样品相互作用的表面积的减少。

这时候立即用一定量柱体积的有机溶剂冲洗可以使色谱柱再生，最好是在你的流动相中加入有机调节剂。

这类现象在所有没有被封端的固定相上很少发生，甚至不会遇到。