临床微生物学与检验第三章细菌感染的病原学诊断

50
第四节 细菌的非培养检测方法
三、细菌毒素的检测 （一）内毒素
内毒素的测定，主要用于确诊病人是否发生 革兰阴性细菌感染。另外，还可用于检测注射用 液和生物制品有无内毒素污染。
方法：鲎试验。
阳性，而不发酵乳糖的细菌为阴性。本试验 主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定。
2020/10/28
31
第三节 细菌的分离培养和鉴定
4．七叶苷水解试验 主要用于D群链球菌与其他链球菌的鉴别。
5．甲基红试验 主要用于鉴别大肠埃希菌与产气肠杆菌。
6．V―P试验 本试验常与甲基红试验一起使用，因为前者阳性的 细菌，后者通常为阴性。
8 ． CAMP试验 在链球菌中，只有B群
链球菌CAMP试验阳性， 故可作为特异性鉴定。
2020/10/28
40
第三节 细菌的分离培养和鉴定
（五）抑菌试验 1． O/129抑菌试验
用于弧菌科的属间鉴别，弧菌属、邻单胞菌属 对O/129敏感，而气单胞菌属耐药。 2．杆菌肽试验 用于A群链球菌与非A群链球群的鉴别。 3．奥普托欣（Optochin）试验 主要用于肺炎链球菌与其他链球菌的鉴别。
革兰阳性球菌
革兰阴性杆菌
2020/10/28
10
第二节 细菌的形态学检查
2．抗酸染色 （acid-fast stain） 可将细菌分为两大类： 即-抗酸性细菌 -非抗酸性细菌
2020/10/28
11
第二节 细菌的形态学检查
3．荧光染色 （1）荧光染色法敏感性强，效率高而且容易观察
结果，在临床细菌鉴定中有很大的实用价值。 （2）主要用于结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、白
2020/10/28
34
第三节 细菌的分离培养和鉴定
4．尿素分解试验 主要用于肠杆菌科中变形杆菌属细菌的鉴定。
5．苯丙氨酸脱氨酶试验 主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。变形杆菌属、
普罗菲登斯菌属和摩根菌属细菌均为阳性，肠 杆菌科中其他细菌均为阴性。
6．氨基酸脱羧酶试验 主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。
2020/10/28
2020/10/28
23
第三节 细菌的分离培养和鉴定
5．特殊培养基 （special medium） 疱肉培养基、 巯基乙醇酸纳培养基
2020/10/28
24
第三节 细菌的分离培养和鉴定
（三）培养基的选择 根据标本来源和可能存在的
病原菌，确定选用各种分离培养 基。伊红美蓝/麦康凯用于筛选 革兰阴性杆菌。
二、染色标本 （一）常用染料 1．碱性染料：碱性复红、结晶紫、美蓝等 2．酸性染料：有伊红、刚果红等 3．复合染料（中性染料）及荧光染料：复合染料有
瑞氏染料（伊红美蓝）、姬姆萨染料（伊红天青） 等；荧光染料有荧光标记的抗体
2020/10/28
9
第二节 细菌的形态学检查
（二）常用的染色方法 1．革兰染色（gram stain）
2020/10/28
43
第四节 细菌的非培养检测方法
一、免疫学检测 （二）抗体检测
抗体的量常随感染过程而增多，表现为效价的 升高。因此用已知的细菌或其特异性抗原检测病人 血清中有无相应抗体及其效价的动态变化，可作为 某些传染病的辅助诊断。主要适用于抗原性较强的 致病菌和病程较长的感染性疾病。
2020/10/28
2020/10/28
25
第三节 细菌的分离培养和鉴定
（三）培养基的选择 从血液、骨髓中
分离病原菌用血液增 菌培养基
2020/10/28
26
第三节 细菌的分离培养和鉴定
二、分离及培养 （一）细菌的分离
1．平板划线分离法 2．斜面接种法 3．液体接种法
4．穿刺接种法 5．倾注平板法 6．涂布接种法
2020/10/28
2020/10/28
16
第三节 细菌的分离培养和鉴定
一、培养基的种类和选择 培养基（culture medium）
是由人工方法配制而成的， 专供微生物生长繁殖使用 的混合营养物制品。
2020/10/28
17
第三节 细菌的分离培养和鉴定
(一)培养基的组成成分 1．营养物质
蛋白胨、肉浸液、牛肉膏、糖类、醇类、血液、 无机盐类、鸡蛋和动物血清生长因子 2．凝固物质 琼脂、明胶、卵白 3．抑制剂和指示剂
2020/10/28
14
第二节 细菌的形态学检查
7.墨汁染色: 一般用于新型隐球菌
检查
2020/10/28
15
第三节 细菌的分离培养和鉴定
一、培养基的种类和选择 培养基的组成成分、培养基种类、培养基的选择
二、分离及培养 细菌的分离、细菌培养方法
三、生化反应和鉴定 碳水化合物的代谢试验 蛋白质和氨基酸的代谢试验 碳源和氮源利用试验
35
第三节 细菌的分离培养和鉴定
（三）碳源和氮源利用试验 1．枸橼酸盐利用试验
用于肠杆菌科中菌属间的鉴定。 2．丙二酸盐利用试验
肠杆菌科中属间及种的鉴别。
2020/10/28
36
第三节 细菌的分离培养和鉴定
（四）各种酶类试验 1．氧化酶试验
主要用于肠杆菌科细菌与假单胞菌的鉴别。 2．过氧化氢酶试验（触酶试验）
用于革兰阳性球菌的初步分群。
2020/10/28
37
第三节 细菌的分离培养和鉴定
3．硝酸盐还原试验 本试验在细菌鉴定中广泛应用。肠杆菌科细
菌均能还原硝酸盐为亚硝酸盐；铜绿假单胞菌、 嗜麦芽假单胞菌等假单胞菌可产生氮气；有些厌 氧菌如韦荣球菌等试验也为阳性。
2020/10/28
38
第三节 细菌的分离培养和鉴定
喉棒状杆菌及痢疾志贺菌等的检测。
2020/10/28
12
第二节 细菌的形态学检查
4.鞭毛染色 可观察到菌体上有无鞭毛、鞭毛的位置及数
量，在细菌鉴定中，特别是非发酵菌的鉴定中 很重要。 5.异染颗粒染色
用于白喉棒状杆菌染色。
2020/10/28
13
第二节 细菌的形态学检查
6.芽胞染色： 绿色部分 为芽胞
2020/10/28
18
第三节 细菌的分离培养和鉴定
（二）培养基种类 1．基础培养基（based medium） 2．营养培养基（nutrient medium） 3．鉴别培养基（diferential medium） 4．选择培养基（selective medium） 5．特殊培养基（special medium）
44
第四节 细菌的非培养检测方法
二、分子生物学检测 （一）核酸杂交
DNA可进行变性、复性、杂交。我们利用这一 特性，制备特定序列DNA片段，进行标记后用作 探针，在一定条件下，按照碱基互补配对原则与 标本中已变性的细菌DNA进行杂交，通过检测杂 交信号确定是否发生杂交反应，从而鉴定标本中 有无相应的病原菌基因。
4．脂酶试验 主要用于厌氧菌的鉴别。
5．卵磷脂酶试验 主要用于厌氧菌的鉴定。
6． DNA酶试验 在革兰阳性球菌中只有金黄色葡萄球菌产生 DNA酶，在肠杆菌科中沙雷氏菌和变形杆菌 产生此酶。
2020/10/28
39
第三节 细菌的分离培养和鉴定
7 ．凝固酶试验 作为鉴定葡萄球菌致病性的重要指标，也
是葡萄球菌鉴别时常用的一个试验。
平板等
2020/10/28
21
第三节 细菌的分离培养和鉴定
3．鉴别培养基（diferential medium） 糖发酵管、克氏双糖铁 琼脂（KIA）、伊红-镁 蓝琼脂和动力-吲哚-尿素 （MIU）培养基等。
2020/10/28
22
第三节 细菌的分离培养和鉴定
4．选择培 （selective medium） SS琼脂使致病的沙门菌、 志贺菌容易分离到
2020/10/28
49
第四节 细菌的非培养检测方法
（三）生物芯片技术 1. 通过微加工技术和微电子技术在固体芯片 表面构建微型生物化学分析系统。 2. 对细胞、蛋白质、DNA以及其他生物组分的 准确、快速、大信息量的检测。 3. 常用的生物芯片分为二大类：即基因芯片和 蛋白芯片。
2020/10/28
27
第三节 细菌的分离培养和鉴定
（二）细菌培养方法 1．需氧培养法 2．二氧化碳培养法 3．厌氧培养法
2020/10/28
28
第三节 细菌的分离培养和鉴定
三、生化反应和鉴定 （一）碳水化合物的代谢试验
1. 糖（醇、苷）类发酵试验 是鉴定细菌最主要和最基
本的试验，特别对肠杆菌科 细菌的鉴定尤为重要
2020/10/28
45
第四节 细菌的非培养检测方法
二、分子生物学检测 （一）核酸杂交
1. 探针的种类 （1）全染色体DNA探针 （2）染色体克隆片段DNA探针 （3）质粒DNA探针 （4）rRNA基因探针 （5）寡核苷酸探针
2020/10/28
46
第四节 细菌的非培养检测方法
2．核酸杂交在临床细菌检测中的应用 （1）细菌分类鉴定 （2）细菌快速鉴定 （3）细菌耐药性的检测 （4）细菌毒素的检测 （5）细菌流行病学调查
2020/10/28
32
第三节 细菌的分离培养和鉴定
（二）蛋白质和氨基酸的代谢试验 1．明胶液化试验
主要用于肠杆菌科细菌的鉴别。
2．吲哚(靛基质)试验 主要用于肠杆菌科细 菌的鉴定。
2020/10/28
33
第三节 细菌的分离培养和鉴定
3．硫化氢试验 培养基：醋酸铅培养基 应用：主要用于肠杆菌 科中属及种鉴别
ຫໍສະໝຸດ Baidu
2020/10/28
19
第三节 细菌的分离培养和鉴定
1．基础培养基 含有基础生长所需的基本
营养成分，最常用的是肉浸 液，俗称肉汤（broth），主 要成分含牛肉浸液和蛋白胨。
2020/10/28
20
第三节 细菌的分离培养和鉴定
2．营养培养基（nutrient medium） 最常用的是血琼脂平板、巧克力血
无动力：细菌呈现布朗运动，只在原地颤动而无 位置的改变
2020/10/28
7
第二节 细菌的形态学检查
3.有些病原菌通过不染色标本的动力检查可作 出初步鉴定 如疑似霍乱患者，镜下观察到来回穿梭似 流星状运动的细菌，制动试验阳性，可初步 推断为“疑似O1群霍乱弧菌”。
2020/10/28
8
第二节 细菌的形态学检查
７.对于烈性传染病标本运送时更要特别严格，必须 按规定包装，由专人运送
８.厌氧性标本应放在专门的运送瓶或试管内运送， 有时可直接用抽取标本的注射器运送
2020/10/28
5
第二节 细菌的形态学检查
1.包括不染色标本检查法和染色标本检查法 2.镜检可以了解有无细菌及大致的菌量 3.根据细菌形态、结构和染色性有助于对病原菌的
初步识别和分类 4.通过形态学检查可得到初步诊断，对临床早期诊
断和治疗疾病有一定的参考意义
2020/10/28
6
第二节 细菌的形态学检查
一、不染色标本 1.细菌不经染色直接镜检，主要用于检查生活状态
下细菌的动力及运动状况 2.常用的方法有压滴法和悬滴法
有动力：可看到细菌自一处移至另一处，有明显 的方向性位移
第三章 细菌感染的病原学诊断
褚云卓
2020/10/28
1
本章内容
第一节 标本的采集和处理原则 第二节 细菌的形态学检查 第三节 细菌的分离培养和鉴定 第四节 细菌的非培养检测方法
2020/10/28
2
５.病人标本中可能含有大量致病菌，必须注意安全 防护
６.标本切勿污染容器的瓶口和外壁，容器必须包装 好，防止送检过程中倒翻或碰破流出
2020/10/28
47
第四节 细菌的非培养检测方法
（二）聚合酶链反应 （ polymerase chain reaction,PCR ）
1. 特异性DNA体外扩增技术 2. 特异、灵敏、快速、操作简便 3. 广泛应用于细菌的鉴定
2020/10/28
48
第四节 细菌的非培养检测方法
PCR在临床细菌检测中的应用 1. 细菌的快速检测 2. 细菌毒素的检测 3. 细菌耐药性的检测 4. 细菌流行病学调查
2020/10/28
29
第三节 细菌的分离培养和鉴定
2．氧化―发酵试验（O/F试验） 主要用于肠杆菌科细菌与非发酵菌的鉴
别，前者均为发酵型，而后者通常为氧化型 或产碱型。也可用于葡萄球菌与微球菌间的 鉴别。
2020/10/28
30
第三节 细菌的分离培养和鉴定
3．β―半乳糖苷酶试验（ONPG试验） 迅速及迟缓分解乳糖的细菌ONPG试验为
2020/10/28
41
第四节 细菌的非培养检测方法
一、免疫学检测 抗原检测、抗体检测
二、分子生物学检测 核酸杂交、聚合酶链反应、生物芯片技术
三、细菌毒素的检测 内毒素、外毒素
四、动物实验
2020/10/28
42
第四节 细菌的非培养检测方法
一、免疫学检测 （一）抗原检测
免疫荧光技术是利用免疫学特异性反应与荧光 示踪技术相结合的显微镜检查手段。既保持了血清 学的高特异性，又极大地提高了检测的敏感性，在 细菌鉴定方面占有重要地位。常用的方法有直接 法、间接法和免疫荧光菌球法。