湛江市科技攻关计划项目申报书(样本)

项目编号：

湛江市科技攻关计划

项目申报书

项目名称: 研制下调DAPK表达和抑制该激酶活性的双功能基因药物防治脑卒中承担单位:

通讯地址: 邮编:

项目责任人: 联系电话: 手机号码:

项目联系人: 蔡凤丙联系电话: 手机号码:

电子邮箱: 传真:

县(市、区)科技主管部门:

申报日期：

湛江市科学技术局

二○○九年制

填表说明

一、《申报书》各项内容要实事求是，逐项认真填写。表达要明确、严谨，字迹要清

楚易辨，外来语要同时用原文和中文表达。

二、填写内容应力求详尽，表述完整。内容过于简单，不能说明项目情况者，视《申

报书》无效。

三、填写合作单位，应征得对方同意，并表明合作的方式。填写了合作单位，但没有

盖合作单位章者，视《申报书》无效。

四、市科技项目只接受单位申报，不接受个人申请。项目的承担者是申报单位而非课

题组，申报单位负责项目的具体实施，承担相应的权利和义务。

五、主管单位应对项目申报单位及《申报书》内容真实性负责。

六、涉及国家安全、秘密的项目，申请另行处理。

纸，填写内容必须打印填入，按顺序单独装订成册，并标七、《申报书》一律使用A

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明页码，对于篇幅不够的栏目可以自行加页，申报书需报送书面材料一式三份并附电子文档。若申报项目未获批准，本《申报书》不退回。

一、承担单位及参加单位基本情况

二、项目责任人基本信息

三、申请项目基本情况表

四、项目情况

2、项目国内外发展现状与趋势：

临床上脑缺血可导致脑卒中，脑卒中是危害人类生命与健康的常见病和多发病，具有发病率高、致残率高、死亡率高和复发率高的特点。由于脑缺血导致的神经元损伤是导致中枢神经系统功能受损的重要原因，因此脑缺血的研究已成为当前防治脑卒中等脑血管疾病的热点之一。

中西医都对脑卒中进行了积极的研究，但至今缺乏疗效肯定的药物。现代医学认为脑卒中的病因和发病机理与血栓和血液动力学、血液流变性障碍有关。因此目前主要利用活血化瘀，益气通络和扩血管抗凝药物或药方改善局部血循及局部细胞代谢功能治疗脑缺血造成的脑卒中。诚然，利用这一指导思想治疗脑卒中取得了较好的效果。

但是目前的研究开发只集中在活血化瘀，益气通络和扩血管抗凝方面，而忽视了脑缺血引起神经细胞凋亡，导致神经元不可逆地丢失的现实。其实脑缺血损伤的主体实际是神经元，血栓和血液动力学、血液流变性障碍只是神经元所处的环境发生了改变，因而单纯改善神经元所处的微环境不能完全解决脑缺血造成的损伤。

大量研究表明，脑缺血造成脑血液供应障碍导致氧和营养物质缺乏,使神经细胞膜去极化,谷氨酸释放,大量的谷氨酸释放使神经元过度兴奋,最终造成神经元发生死亡｡脑缺血后神经元有两种死亡方式，除缺血中心区的急性神经元坏死之外，还在轻、中度缺血的区域出现选择性神经元缺失，这种神经元死亡称之为迟发性的神经元死亡，大量的研究表明，这种迟发性的神经元死亡的本质是细胞程序性死亡[1]。脑缺血可以引起神经细胞凋亡，导致神经元不可逆地丢失，因而抑制神经细胞凋亡是临床治疗脑缺血的一种策略。

脑缺血造成神经元凋亡时，Caspase是细胞凋亡机制中特异性细胞内信号途径的关键成分。其中Caspase-3是细胞凋亡的执行者，实验也证实，脑室内给予Caspase-3抑制剂可以阻止小鼠暂时性脑局灶缺血后神经元的死亡，缩小梗死体积。但研究表明脑

缺血导致的神经元死亡不仅有典型的凋亡，还有自噬死亡（即Ⅱ类程序性死亡），而这种死亡方式是不依赖Caspase激活。可见单纯施与Caspase抑制剂治疗也存在一定局限性。

死亡相关蛋白激酶（death-associated protein kinase,DAPK）是Caspase上游信号通路激酶，也是程序性死亡的执行者。研究显示，DAPK与许多程序性死亡通路有着密切联系，不仅能以p19ARF依赖的方式激活经典的P53-caspase凋亡途径诱导细胞凋亡，还能以细胞自噬方式诱导细胞死亡｡这都暗示着DAPK可能是多种信号诱导凋亡的一个会合点[2]。

各种研究表明，DAPK在发育中的个体[7]和成年个体[8]的大脑皮层颗粒细胞和海马神经元增殖区广泛表达。在胚胎发育的22天和出生后7天时,DAPK的mRNA表达到最高水平,而脑发育在这两个时期的特点是细胞凋亡[7]｡这提示DAPK在脑发育中调控神经元凋亡扮演着重要角色｡

DAPK不仅在神经元发育起着重要作用，而且在其他因素诱导神经细胞凋亡中也起

着凋亡执行者的功能。研究表明，DAPK在C

2和C

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-神经酰胺引起的大鼠海马神经元[9]

和PC12[10]凋亡起关键作用｡最近研究发现，神经突起生长导向因子1（Netrin-1）的受体UNC5H作为一种依赖性的受体，在缺乏Netrin-1的情况下也能够激活DAPK触发凋亡，UNC5H通过死亡结构域的相互作用抑制DAPK自身磷酸化而增强DAPK激酶活性[5]。在脑缺血大鼠模型中发现损伤的组织区域,DAPK的mRNA表达水平升高[15]。前脑区域瞬时脑缺血实验也发现，神经元的DAPK转录mRNA增强[7]｡报道进一步表明，脑缺血损伤1周后，海马区域的DAPK表达持续上调，造成神经细胞大量丢失，神经细胞持续死亡从数小时到数天[11]。可见续发的神经细胞死亡是DAPK的激活造成的，因此，将DAPK 作为干涉的靶酶，下调DAPK的表达或抑制DAPK激酶活性，将会阻断神经细胞持续死

亡的链式破坏作用。已有研究表明，抑制DAPK的活性可以减轻脑缺氧造成的脑损伤[11,12]。

另有研究发现DAPK参与神经退行性病变和癫痫发作造成的神经细胞死亡过程[13]。大脑中的CaMKK(CaM-regulation protein kinase kinase)是一种神经元存活的关键酶，在急性神经退行性病变的治疗中，CaMKK的级联反应可减轻神经元损伤。联合使用酵母双杂交技术，大脑溶胞产物的免疫沉淀分析和磷酸转移酶实验等证明，CaMKK是DAPK 的一个潜在的酶作用底物。DAPK下调CaMKK的活性是一个早期激活事件，而且CaMKK 的抑制可能导致神经细胞凋亡的发生[14]。提示DAPK也可作为治疗神经退行性病变的一个潜在作用靶位点。

各种实验结果显示，DAPK参与多种死亡信号诱导的神经细胞凋亡过程，而脑卒中治疗的一大策略是减少神经元凋亡。这一发现为以DAPK作为靶目标,通过抑制DAPK活性而抑制神经元凋亡提供理论基础｡以DAPK作为靶目标抑制神经元凋亡有着重要意义,可以在凋亡信号发生的初期阻断之，并可以抑制不依赖Caspase引发的细胞自噬过程（属Ⅱ类程序性死亡）｡

DAPK诱导神经细胞凋亡必须依赖于它的酶催化活性[2]，以DAPK为靶酶筛选该酶的抑制剂非常吸引人。目前有两种方式来抑制DAPK活性，第一种方式是利用DAPK的C-末端17个氨基酸残基多肽产生抑制作用的性质，由于亲水的多肽不易跨越细胞膜和分子量大小的原因限制了它的利用[2]。第二种是利用DAPK的晶体结构去设计催化位点的化学抑制剂[15]。

基因疗法是目前一种新的治疗策略，其中靶基因和基因载体选择是基因疗法成功的关键。既然DAPK的羧基末端多肽可以抑制激酶活性，就可以考虑将编码该肽段的基因序列装载入载体中，导入宿主细胞表达抑制DAPK的活性，这样可以解决亲水的多肽