PCR-STR亲子鉴定1

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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
PCR-STR起源
进入20世纪90年代,Mullis和Saiki等学者发明 并改进的PCR 技术被用于法医DNA 分析,从而建立 了以PCR为基础的第二代DNA 分型技术。 利用STR-PCR分型技术,可将人类遗传信息数字 化,根据孟德尔遗传定律,子女的遗传信息来源其 生物学意义上的父亲、母亲。通过人类遗传基因分 析和现代化DNA检测技术可以确定父母和子女是否具 有血缘关系。在亲子关系的鉴定上,亲子关系的概 率可达到99.99%以上水平。
血型测试进行亲子鉴定就是通过对血型的检验比 对来确定亲子关系。依据孟德尔遗传定律,人类的 血型是按照遗传基因传给下一代,故一定血型的父 母所生子女也具有相应的血型。
用于血型检验来鉴别亲子关系的血型系统有: ABO 、MN 、Rh、Ss 、hp等21个血型系统 。 检验的血型系统越多,其准确性就越高,如果血 型检验的结果表示无遗传关系,可作出否定亲子关 系的结论,但结果存在遗传关系,也不能完全确定 是亲子关系
2. PCR-STR法的理论基础与原理
理论基础
人类基因组是一个结构十分稳定的体系,同时又 是一个变异的体系。在长期的进化过程中,基因组 DNA的序列不断发生变异。这些变异有些被保存下来, 导致了不同种族、群体和个体间基因组的差异和多态 性。 除同卵双生子外,没有两个个体基因组是完全相 同的。尽管遗传多态性的存在,但每一个人的染色体 必然也只能来自其父母,这就是DNA亲子鉴定的理论 基础 亲子鉴定是根据人类遗传学的理论和实践,从子 代和亲代的形态构造或生理机能方面的相似特点,分 析遗传特征,对可疑的父与子或母与子之间的亲生关 系进行判断,并作出肯定或否定的结论。
原理 不同个体中,STR核心序列的重复次数不 同。根据子代的两条DNA一条来自于父方一条 来自于母方,其子代某一特定DNA分子上STR核 心序列重复次数必定与父母相同。 根据微卫星DNA两端序列的保守性,设计 一对特异引物,利用PCR技术,扩增每个位点 的微卫星DNA序列,以检测、分析微卫星序列 多态性;并确定基因排布序列及表型,最终达 到成功鉴定的目的。
3.PCR-STR法
后来又发展出一些应用PCR的DNA分析技术的亲 子鉴定方法,近年来常用的是下面介绍的PCR-STR 法。
PCR-STR法亲子鉴定



1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、
PCR-STR简介和起源 PCR-STR法的原理与理论基础 PCR-STR法方法步骤 PCR-STR 法结果分析 PCR-STR技术的优点 PCR-STR 法应用实例 PCR-STR 法应用前景
(2)STR的产生机制
微卫星DNA重复顺序的产生则普遍认为是DNA复制 过程中滑动,或DNA复制和修复时滑动链与互补链碱 基错配,导致一个或几个重复单位的插入或缺失。 微卫星DNA自发突变率仅10-4~10-5,且核心序列 越小,突变率越低。
(3)STR多态性
因为STR具有高度的多态性,所以能广泛应用于 法医学实践。STR的多态性一般是指由于核心序列重 复次数不同而构成的长度多态性,而长度多态性检 测已被广泛应用于法医学个人识别和亲权鉴定。
(2)滴骨验亲 滴骨验亲法就是将生者的血液滴在死人的骨骸上, 若血液能渗透入骨则断定生者与死者有血源关系,否 则就没有。
三国时期的吴国人谢承所撰的《会稽先贤传》就记 载有以弟血滴兄骨骸之上认领长兄尸骨的事例; (《南史·豫章王综传》也记载有以子之血滴于父骨 之上验亲的事例;
至宋代,著名法医学家宋慈将滴骨验亲法收入《洗 冤集录》中。据从现代的观点来看,这种方法并不科 学,但开创了用血型鉴别血源关系的先河。
PRC扩增
比对示意图
方法二:Southern杂交法
步骤: ① 样本的选择 ② DNA的提取 ③ PCR扩增 ④ 琼脂糖凝胶电泳 ⑥ 转膜—进行Southern杂交(探针设计)—洗膜—晾 干—包(用保鲜膜)—压X光片(-20度—-70度保存3到 7天)—冲洗—观察杂交图谱(全自动条带分析系统)
注:探针设计将微卫星DNA核心序列(CA)n串联起来,— PCR扩增(加入P32标记的dNTP) —电泳—挖胶—回收试剂盒回收 DNA片段—导入载体形成重组DNA分子—导入大肠杆菌—选择白 斑—一部分培养保存,一部分提取质粒DNA—测序—作为探针
(4)理想的STR基因座
从实用价值考虑,用于法医DNA分型的理想STR基 因座应具备以下特点: ① 等位基因片段长度在95bp--5OObp范围,最好在 400bp以下; ② 具有较高的杂合度及个人识别能力,一般杂合 度在0.70以上,DP>0.90; ③ 具有规律的四核苷酸或五核苷酸重复序列,阴 影带出现率较低,较少或没有插入等位基因; ④ 等位基因数为10~12个,等位基因易于区分; ⑤ 突变率低,不超过0.2 ; ⑥ 具有高度种属特异性。
2. PCR-SNP
指在两条同源染色体上,同源DNA序列长度相等,但个别 核苷酸不同而产生的个体差异,也称单核苷酸多态性 (SNP)。 人类基因组中存在着广泛的多态性,最简单的多态形式是 发生在基因组中的单个核苷酸的替代,即单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphisms, SNPs)。SNP通常是一 种二等位基因的,即二态的遗传变异SNP的数量大、分布广, 在组成人类基因组的30亿个碱基中,平均每1000个就有一个 SNP。SNP作为第三代遗传标记,在复杂疾病的基因定位、 关联分析、个体疾病易感性分析与药物基因组学的研究中发挥 着愈来愈重要的 作用。
以上述原则为依据,美国联邦调查局(FBI)推荐 用于建设国家DNA 数据库(combined DNA in—dex system,C0DIS)的13个STR 基因座,作为PCR—STR 的常用检测基因座,也成为目前法医STR分型的基 础位点。 即D3S1358、THO1、 D21S11、D18S51、 D5S818、D13S317、 D7S820、D16S539、 CSF1PO、VWA、 D8S1179、TPOX、FGA.
8 . PCR-STR 法应用实例
20 世纪90 年代,DNA 分析技术开始应用于人 类的亲缘关系研究。随着DNA 序列分析技术的日趋 成熟和广泛应用。 利用PCR-STR进行序列分析也逐渐应用到家畜 及野生动物的亲缘关系分析及个体识别上。

国际上关于亲子鉴定和DNA身份识别的两个最著名实例均与美国前总统 克林顿有关 A 当矢口否认有任何不轨行为的总统被要求抽取血样以核对莱温斯基裙 子上的污渍来源时,他只得承认错误以避免陷入更尴尬的境地; B 后来黑人妇女威廉斯声称其13岁独生子丹尼的父亲是克林顿时,克林 顿毫不犹豫地抽血化验,最后经DNA检测证明威廉斯所生的黑白混血儿并 非克林顿的私生子,由此足见这一技术的可靠
7 . STR-PCR技术的优点



传统的血清方法能检测红细胞血型、白细胞血型、血 清型和红细胞酶型等,这些遗传学标志为蛋白质(包括糖 蛋白)或多肽,容易失活而导致检材得不到理想的检验结 果。 此外,这些遗传标志均为基因编码的产物,多态信息 含量(PIC)有限,不能反映DNA编码区的多态性,且这些 遗传标志存在生理性、病理性变异(如A型、O型血的人受 大肠杆菌感染后,B抗原可能呈阳性。因此,其应用价值 有限。 DNA检验可弥补血清学方法的不足,故受到了法医物证 学工作者的高度关注。
(2)染色体多态性鉴定
染色体多态性,又称异态性,是指正常人群 中常见的各种染色体形态的微小变异(如:随体 增大、重复或缺失,着丝粒区的荧光强度变异 等)。 这种多态是可以遗传的。这项技术就是利用其 形态来鉴定亲子关系,这要靠技术人员的主观判 断,其准确率也不尽如人意。
(3)DNA鉴定 鉴定亲子关系目前用得最多的是DNA分 型鉴定,包括:序列多态性和长度多态性。 如:人的血液、毛发、唾液、口腔细胞及骨 头等都可以用于亲子鉴定,十分方便。 常用方法有DNA指纹法、SNP-PCR法、PCRSTR法等。
6 . PCR-STR 法结果分析
电泳分离片段后,通过放射自显影技术检测单链DNA 片段的放射性带,就可以直接读出DNA的核苷酸序列。 如果小孩的遗传位点和被测试男子的位点超过3个不一 致,那么该男子便100%被排除血缘关系之外,即他绝对 不可能是孩子的父亲。如果孩子与其父母亲的位点都吻合, 我们就能得出亲权关系大于99.99%的可能性,即证明他 们之间的血缘亲子关系。 若有1~2个位点不同,要考虑是否发生了基因突变, 这是要对多个STR序列位点进行鉴定。
1.PCR-STR简介和起源
(1) STR STR是短串联重复序列(short tandem repeat) 的简称,又称简单重复序列SSR,或微卫星 DNA(micro-satellite)。 STR是一类广泛存在于真核生物基因组中的DNA 串联重复序列,它由2-6 bp的核心序列组成,通 常重复15-60 次,片段大小一般为100-300 bp。 STR主要由于核心序列的重复次数不同而具有 高度多态性,是个体的特征,遵循孟德尔共显性 遗传规律传递,绝大多数不受选择压力的影响,且 较均匀地分布人类全基因组。
PCR-STR法亲子鉴定
一、亲子鉴定定义 二、原始的亲子鉴定方法 三、现代的亲子鉴定方法
一、亲子鉴定的定义
亲子鉴定就是利用 医学、生物学和遗传学 的理论和技术,子代和 亲代的形态构造或生理 机能方面的相似特点, 分析遗传特征,判断父 母与子女之间是否是亲 生关系。
二、原始的亲子鉴定方法
(1)外貌对比 由于遗传的原因,父子、母子、兄弟姐 妹之间的长相、肤色等一般都会有某些相似 的地方,通过外貌长相的对比来确定亲子关 系恐怕是最原始的方法,但这样方法只是一 种猜测、判断,作为一种参考,不具有权威 性。
(3)滴血验亲
滴血验亲法又称合血验亲法,就是将小孩的血 与大人的血液放在一起,如果能融在一起,就是父 母亲生的,否则就不是亲生的。 这种认样方法曾在中国 宋代的法医著作里里记载过。 这种方法没有科学依据,亲 子关系的血液不一定能融合, 而非亲子关系的血倒有可能 融合
三、现代的亲子鉴定方法
(1)血型测试
膜使DNA释放到提取缓冲液中DNA释放后,尽量确保 DNA的完整性
②分离纯化 (去除杂质包括大量的RNA、蛋白质、多
糖、单宁和色素等)
③SSR(Simple Sequence Repeat) 引物设计 根据
CMD(Cotton Marker Database)已公布的序列来设计 相对SSR引物。
④PCR扩增 ⑤琼脂糖凝胶电泳 ⑥挖胶 ⑦回收试剂盒、回收DNA片段 ⑧与特定质粒形成重组DNA分子 ⑨导入大肠杆菌,筛选白斑 ⑩提取质粒DNA ⑪DNA测序、比对
1.DNA指纹法
DNA指纹法的技术原理,又称RFLP DNA指纹分析 技术,将生物检材中细胞核的DNA分离出来,用特定 的限制性内切酶消化,后经电泳分离,Southern印 迹转移,再用已知序列小卫星DNA探针根据碱基互补 原则进行杂交,用放射自显影等技术显示出一系列 不等距离,相互间隔的多条电泳谱带组成的高度多 态性图谱,实质为DNA的限制性片段长度多态性 (RFLP)图像,因各人不同(同卵双生除外),比 对结果类似指纹。
5 . PCR-STR法方法步骤 样本的选择
DNA检测样本很多。一般来说,人体的任何 组织或分泌物都可以做。 DNA样品收集主要采 用抽少量静脉血或者 末梢血或者收集口腔 上皮细胞。此外,我 们也可以进行头发、 组织、血迹、胎儿的 绒毛等特殊样本的 DNA鉴定。
方法一:DNA测序法 步骤: ①材料处理 破碎细胞壁以释放细胞内容物破坏细胞
PCR-STR技术有如下优点:
1、模板DNA片段短,扩增效率高,灵敏度高; 2、检材量少,仅需1~5ng的模板DNA; 3、可使用快速的制备模板DNA; 4、扩增结果易于分析,不需要放射性标记; 5、可检测部分降解或陈旧性的生物材料,尤其适 于检测血痕、精液斑、唾液、毛发、指甲、骨骼 等; 6、个人识别机率和非父的排除率高。
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