DNA多态性分析基础详解

γ— 线粒体 DNA的复制
δ— 参与核 DNA的合成（链的延长及其他）
忠实性：是保证生物信息准确传递的必要条件
机制 专一性识别碱基--合成控制：碱基对、酶、引物
3’-5’外切酸活性--校对控制：
2.基因表达
概念：将储存于DNA中的遗传信息转变成RNA和蛋白质分子，通
过这 些蛋白质分子的功能活动使生命体表现各种各样的生理功能 和千差万别的生物性状。
生物学意义
压缩DNA分子体积，有利于在细胞 中包装组蛋白对DNA分子完整性的 保护作用
统计数据
人类基因组DNA直线长2m 细胞核直径5um DNA分子被压缩了近一万倍
二、DNA的理化性质
DNA是生物大分子，因此具有高分子物质的一般性质
粘 性 较大 溶液的粘性与溶质分子的不对称性有关 两性电解质 DNA含有磷酸基团（-）和含氮碱基（+）
下，DNA双链间的氢键断裂，形成两条单链DNA分子的过程。
变化：溶液粘度降低,沉降速率增加,浮力密度上升,紫外线吸收增强
增色效应～随温度上升，DNA溶液的紫外线吸收增强，A260nm值 ♦ DNA对紫外线吸收强度与变性程度成正比 ♦ OD260值：双链DNA < 单链DNA < 单核苷酸
融链温度～随温度上升，一半DNA分子变性时的温度 (Tm值) ♦ Tm值与DNA分子中G/C含量呈线性关系 估计DNA的GC含量 ( G+C)% = (Tm—69.3)× 2.44 估算引物的Tm 值 Tm = 4 ( G + C ) + 2 ( A + T ) ♦ Tm值受介质中离子强度的影响 在高离子强度溶液中相对稳定（1mol/L NaCl）
串联重复序列----相对恒定的序列为重复单位，首尾相接 大卫星DNA（macrosatellite DNA） 主要在在非编码区
小卫星DNA ( minisatellite DNA ) 与染色体折叠压缩 微卫星DNA (microsatellite DNA） 和染色体配对有关 散在重复序列----相同序列的重复单位散在分布 短散布元件〈 500bp Alu序列 序列长平均250bp，含有Alu I酶切位点（AGCT）
♦ 大肠杆菌DNA聚合酶I—由polA基因编码的多功能酶
68kd C端2/3 5’-3’ 聚合酶活性—合成
103kd
N端1/3 3’-5’ 外切酶活性—校对作用
35kd
5’-3’ 外切酶活性—切除
♦ 真核生物DNA聚合酶—四种酶都具有5’-3’方向聚合作用
α— 参与核 DNA的合成（链合成的引发）
β— 具有外切酶的活性（修复、校对）
** 局部碱基序列具有同源性的DNA分子也能形成局部杂交产物。
杂交技术：在复性条件下，探针与靶DNA单链形成杂交双链 用以分析两核酸分子间的碱基互补程度
探 针：标记有失踪物的寡核苷酸片段
三、DNA的复制和基因表达
1.DNA的复制
概念：复制是指以原来的DNA为模
板合成相同DNA分子的过程
复制的基础--碱基互补原则
不对称末端
5’-自由的磷酸，3’-游离的羟基
生物学意义
1. 遗传信息的载体;
2. 构成DNA遗传标记的结构基础。
二级结构--两条DNA单链形成的双螺旋结构
双螺旋结构的特征
1. 两条单链逆向平行排列， 绕同一中心轴形成双螺旋 2. 两条单链间以氢键连接 碱基互补原则：A=T,C≡G ** 稳定性与G+C含量呈正比 ** 嘌呤和嘧啶相等: A+G=C+T
2.基因外DNA 功能不清，多拷贝或低拷贝形式；30%串联重复
3.重复序列 概念：在基因组中反复出现，在基因组中含有一个以上相同
顺序拷贝的DNA序列称为重复序列---DNA多态性基础 分类：反向重复序列----两个序列相同的拷贝在DNA上呈反向排列
重复序列间有间隔 位于基因调控区内 重复序列间无间隔 与基因的转录、复制有关
产物：编码 R N A ～ snRNA, tRNA, rRNA 编码蛋白质 ～ 组蛋白、珠蛋白、生长激素
位置：同一个染色体上或不同染色体上 分类：多 基 因 家 族（rRNA基因家族）
散在基因家族（珠蛋白基因家族） 超 基 因 家 族（免疫球蛋白、组织相容性复合体）
6.转位因子：DNA分子内部或分子间可以移动的DNA片段
配 离子强度～足够盐浓度—中和DNA分子Байду номын сангаас带负电荷—利于复性 分子结构～简单序列的、小分子DNA--易发现互补序列-复性快 溶液浓度～高浓度DNA溶液较低浓度DNA溶液易复性
** 影响复性过程的主要因素：复性温度与溶液的离子强度。
杂交：在复性的条件下，来源不同、但具有碱基互补的DNA单链按碱
基 配对原则形成双链DNA分子的过程称作杂交。
由同一DNA序列可以得到不同的mRNA，从而编码多种
具有部分重叠序列的蛋白质的基因称为重叠基因
基因分类 结构基因：合成结构蛋白、催化生化反应的酶 调节基因：阻遏蛋白或激活蛋白，控制基因活性
◆ 既可以转录成RNA，又可以翻译成蛋白质
rRNA基因：产物是核糖体的核糖体RNA tRNA基因：产物是转移RNA
♦ 等电点低--中性或弱碱性溶液--带负电 电泳技术进行分离的分子基础
♦ 可以与金属离子（Na,K,Mg.Mn）结合成盐 DNA+盐（乙醇或异丙醇）DNA沉淀析出
♦ 可以和组氨酸结合 使DNA分子更具有稳定性
吸收紫外线 碱基含有共轭双链 ( 最大吸收波长260nm )
♦ 对DNA样品进行定量分析
1.DNA的变性 概念：在加热、溶液碱性、有机溶剂、二甲基亜砜、甲酰胺等条件
编码序列----外显子( n ) 10%~50%
插入序列----内含子(n-1) 50%~90% 决定基因长度
编 码 率----编码序列长度占整个基因序列的比例
外显子
内含子
转录：模板DNA
初级RNA
GT AG
GT
AG
成熟RNA
剪接方式：特定外显子+不同外显子---表达多种产物
表现为外显子/或 内含子---表现多种功能
方式：♦ 半保留复制
♦ 半不连续复制
过程：复制的起始
引物合成 DNA链延伸 5’-3’方向
DNA聚合酶 复制的终止 引物切除
缺口连接
双链解开
DNA聚合酶--催化脱氧核苷三磷酸聚合成DNA链的酶
条 件：必须有引物、复制模板、合成DNA的原料dNTP及微量
Mg2+
作 用：具有合成、切除和校对的综合功能
外界 物理因素 紫 外 线 嘧啶间诱导形成共价键→嘧啶二聚体（TT）
嘌呤间形成异常化学键 电离辐射 机理～构成基因的化学物质电离
结果～碱基破坏、核糖分解、DNA分子断裂 化学因素 烷 化 剂 烷基置换碱基的氢原子
---碱基被烷化，造成基因改变 类 似 物 替代正常碱基掺入DNA链中引起错配
5-溴尿嘧啶、2-氨基嘌呤
不同小卫星高度同源性---DNA指纹技术
4.假 基 因：与正常功能基因在核苷酸序列上相似，但不能转录或
转录后生成无功能基因产物的DNA序列。 突变：复制-失去调控；转录-拼接信号；翻译-终止信号 其他：丢失5’或3’端部分而失去活性—基因片段
5.基因家族：基因组中来源相同，结构相似，功能相关的一组基因
特点：保留原位的序列，新合成复本的插入，可以遗传 部位：不固定（内含子、基因侧翼序列、插入编码区 ）
7.端粒
存在于真核生物染色体末端，一段DNA和蛋白质形成的复合结构。 特点：仅存在于真核生物，富含G的寡核苷酸序列
多个串联重复序列组成，重复单位为 5bp-8bp（-TTAGGG-） 重复次数为800-3000次，总长度5～15kb。 作用：在端粒酶参与下，封闭染色体末端，维持染色体稳定性的作用 DNA复制：由于受DNA聚合酶特性限制，子代DNA链的最后
第一节 DNA分子结构与功能
一、DNA的分子结构
DNA是由4种核苷酸通过磷酸二酯键连接成的线性多聚体.
1.DNA的基本结构单位
碱基 A
G
C
T
核苷
核苷酸 脱氧核苷酸=碱基+脱氧核糖+磷酸
dNTP dNDP dNMP
2.DNA的分子结构
一级结构--DNA分子中核苷酸的排列顺序
链接方式
3’,5’磷酸二酯键连接 戊糖和磷酸构成多聚核苷酸对骨架 含氮碱基突出于骨架上
重复单位 15bp-30bp
2bp-6bp
重复次数 数次至数百次
10bp-60次
序列总长 100bp-20kd
300bp
序列特征 核心序列
单拷贝
多态原因 VNTR
STR
形成机制 不等交换，重组
复制滑动
主要分布 近端粒处，着丝点
内含子、间隔DNA
有特定的基因座定位 有特定的基因座定位
核心序列----富含G/C或A/T的保守序列
某些因素影响下→DNA分子共价键断裂→小片段DNA的过程：DNA降 解
2.DNA的复性
概念：当撤除变性因素后，原变性的两条互补DNA单链通过碱基配对
又 重新缔合成为双链结构的过程叫复性。
** 加热后变性的DNA在温度降低过程中的复性有称为退火。
影响：温度影响～最适为Tm以下25℃，过高不易复性；过低碱基错
复 制
转录
DNA
RNA 翻译
蛋白质
逆转录
阶段：转录～DNA分子作为模板直接指导RNA分子的合成过程
翻译～RNA分子上的核苷酸序列信息转变成蛋白质中氨基酸
四、DNA的损伤与修复
1.DNA损伤----是指DNA双螺旋结构出现的任何改变 体内 复制错误 DNA复制错配率10-1，10-2
自发损伤 碱基脱嘌呤～A或G被切下来→导致突变 碱基脱氨基～C 脱氨成为 U→U与A配对
线粒体基因组：线粒体内包含的全部DNA分子，16569bp ** 每个细胞平均有800个线粒体 ** 每个线粒体含有10个DNA拷贝
一、人类核基因组DNA 1.基因与基因有关序列
基因组成：包括合成有功能的多肽链或RNA所必需的全部序列
真核生物---断裂基因
基因中编码序列被若干个插入序列分隔的不连续的镶嵌结构
◆ 只转录产生相应RNA，而不翻译成蛋白质
相关序列 前导序列和尾随序列---能被转录，但不被翻译 启 动 子：RNA聚合酶与DNA结合起始部位 位置：基因转录起点上游（5’-1kb) 作用：能与RNA酶结合，调控基因表达 增 强 子：调节基因产物与DNA结合的部位 位置：基因上游，促进基因转录活性 作用：促进转录活性，增强启动子
DNA多态性分析基础
人类DNA遗传标记----法医物证学应用研究的热点 ♦由常量检材到微量检材 ----微量检材的检验 ♦由蛋白质水平到DNA水平 ----陈旧检材的检验、取材的广泛性 ♦实现了仅能否定到高概率肯定 ----提高了法庭证据的可靠性
人类DNA遗传标记----特定的座位上出现等位基因 ♦出现在编码区或非编码区 ♦表现为序列多态性或长度多态性
同源性高达80%，但具有种属特异性
人类Alu序列长300bp（130bp+31bp+130bp）
长散布元件 〉6-7kb Kpn序列 约6500bp
卫星DNA
发现：DNA主带以外有多个小的卫星带 分类：大卫星---根据浮力密度不同
1.687 Ⅰ卫星DNA（25-48bp） 1.693 Ⅱ卫星DNA（5bp-ATTCC-） 1.697 Ⅲ卫星DNA（5bp-ATTCC-） 1.700 Ⅳ卫星DNA（隐蔽的卫星DNA) α卫星DNA 171bp 灵长类特有 β卫星DNA 68bp 富含GC γ卫星DNA 220bp
成分：GC含量少于主带中的DNA 特征：DNA呈串联重复形式
各类型家族成员序列G/C含量近似 具有相同的浮力密度
但是重复序列特征有明显差异
所有串联重复DNA序列都称为---卫星DNA
根据重复序列长度和序列特征分类
小卫星DNA
微卫星DNA
（minisatellite DNA ） （microsatellite DNA）
2.DNA修复 切除修复—恢复正常结构
重组修复---损伤可以保留
第二节 人类基因组
基因组概念
广义概念：一个生物体的所有基因或遗传物质 狭义概念：一大组基因、一个染色体或几个染色体的基因
** 基因组包含基因序列(20-30%) + 非基因序列(70-80%)
基因组构成
核 基 因 组：单倍体细胞内的全部DNA分子，3×109 bp 体细胞～22对常染色体和1对性染色体 性细胞～22条常染色体和1条型染色体 ** 每个细胞含相同的基因组拷贝（特殊除外） ** 平均每个细胞含有6～10pg的DNA
配对原则的意义
1.复制的分子学基础 遗传信息传给子代 2.转录的分子学基础 RNA合成的模板 –蛋白质 3.DNA多态性分析的分子学基础 DNA遗传多态性
三级结构---超级螺旋结构 结构特征
真核生物DNA三级结构--核小体 140bpDNA双链缠绕组蛋白8聚体 60bp的连接链（结合有组蛋白H1）