毛孢子菌和镰刀菌的分类鉴定
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rDNA ITS序列测定：同源序列搜索的结果 与形态学鉴定结果一致 ◆RFLP分析：皮毛孢子菌的Cfr 13I RFLP带 型与阿 萨希毛孢子菌、皮瘤毛孢子菌的不 同；皮瘤毛孢子菌的NcoI RFLP带型与另 两者不一致
◆
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6
5 4 3
2
1 M
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◆
◆
近年来，镰刀菌引起的感染有不断上升的趋 势，尤其在真菌性角膜炎中镰刀菌已占主导 地位 常规的镰刀菌鉴定方法费时Байду номын сангаас烦琐，往往不
能满足临床需要
◆
实验目的
对临床分离的镰刀菌进行分类鉴定，了解致病 菌种的分布情况 ◆从分子生物学角度寻找快速鉴定常见镰刀菌的 方法，为临床早期诊断提供依据
◆
材料与方法
◆
毛孢子菌属大部分种的ITS序列在Genbank中 均可查到，所以可通过测定rDNA ITS序列来 鉴定毛孢子菌 ◆Cfr 13I、Nco I 可区分皮瘤毛孢子菌、皮毛孢 子菌和阿萨希毛孢子菌，但由于实验菌种有限， 两者是否可用于鉴定毛孢子菌其他的种尚有待 进一步验证
◆
结论
1. 形态学是鉴定毛孢子菌的基础 2. API 20C 有其鉴定的局限性 3. 温度试验可区分皮毛孢子菌与 阿萨希毛孢子菌 4. 限制性内切酶Cfr13I、NcoI有望应用于皮瘤毛孢 子菌、皮毛孢子菌与 阿萨希毛孢子菌的鉴定 5. 通过rDNA ITS的序列测定可辅助鉴定毛孢子菌种
多数水生，能在水中游动，腐生或 寄生，与医学关系不大
接合菌门 Zygomycota
虫霉目包括冠状耳霉和蛙粪霉 毛霉目包括根霉、毛霉、犁头霉、根毛霉
担子菌门 Basidiomycota
该门包括红酵母、隐球菌、掷孢酵母等
子囊菌门 Ascomycota
大部分真菌均属于此门，如曲霉、青霉、 链格孢、镰刀菌等
毛孢子菌和镰刀菌的 分类鉴定
真菌的分类
目前真菌界包括4个门： 壶菌门 Chytridiomycota 接合菌门 Zygomycota 担子菌门 Basidiomycota 子囊菌门 Ascomycota 半知菌 deuderomycetes （丝裂孢子真菌 Metoaporic fungi）
壶菌门 Chytridiomycota
实验菌株：北大一院真菌中心保存的30株镰 刀菌、12株非镰刀菌，同仁医院眼科研究所 提供的68株镰刀菌，共110株 ◆实验方法： 形态学实验 分子生物学实验
◆
形态学实验
对同仁医院68株分离自病人角膜的镰刀菌进行 形态学鉴定 ◆大培养——将受试菌株种于PDA平板，25℃培 养，观察菌落形态、色泽 ◆小培养——将受试菌株种于钢圈内PDA， 25℃ 培养，观察大、小分生孢子的形态，瓶梗类型， 厚壁孢子的有无等
2
1 M
Cfr13I酶切带型
NcoI酶切带型
M泳道为100bp ladder，1，3，5，7，9，11泳道依次为限制性 内切酶作用后的BMU00242，00706，01431，01463，02466， 00277的PCR扩增产物；2，4，6，8，10，12泳道依次为未经 限制性内切酶作用的BMU00242，00706，01431，01463， 02466，00277的PCR扩增产物
实验菌株
编 号
BMU00242 BMU00277 BMU00706 BMU01431
种 名
Trichosporon inkin Trichosporon cutaneum Trichosporon asahii Trichosporon asahii
标本
血液 标准株 皮屑 肝组织
来 源
美国UTHSCSA ATCC-28592 北大一院 北京军区总院
第二部分 镰刀菌的分类鉴定
概 述
镰刀菌属（Fusarium spp. ）在自然界广泛存在， 与人类关系密切，有些种能引起农作物的病害导 致严重减产，有些种能产生植物激素，刺激农作 物生长 ◆镰刀菌是条件致病菌，临床上常可引起角膜炎、 甲真菌病等浅部感染，在免疫低下病人还可引起 系统性感染甚至死亡
◆
Trichosporon inkin（皮瘤毛孢子菌）
菌落 SDA 22℃ 10天 MEA 22℃ 4天 （ × 400）
Trichosporon cutaneum（皮毛孢子菌）
菌落 SDA 22℃ 10天 MEA 22℃ 4天 （ × 400）
Trichosporon asahii（阿萨希毛孢子菌）
讨论
阿萨希毛孢子菌以前归属于皮毛孢子菌（皮毛 孢子菌又名白吉利毛孢子菌—T. beigelii），由 Sugita 1994年命名 ◆皮毛孢子菌API结果不理想，原因在于API 20C AUX （1997年）新版鉴定系统菌种库中没有T. cutaneum（皮毛孢子菌） ◆阿萨希毛孢子菌与皮毛孢子菌的形态及糖同化 实验相似，区别两者最简单的方法是温度试验
菌落 SDA 22℃ 10天 MEA 22℃ 4天 （ × 400）
实验结果
——生理学实验
◆
皮毛孢子菌的API 20C结果无法读取，其 它菌的API结果与形态学鉴定一致
实验结果
——温度实验
皮瘤毛孢子菌 皮毛孢子菌 阿萨希毛孢子菌 30℃ + + + 37℃ + + 42℃ -
实验结果
——分子生物学实验
ITS1
ITS4 18S rDNA 5.8S rDNA 28S rDNA
真菌核糖体基因(rDNA)结构
第一部分 毛孢子菌的分类鉴定
概 述
毛孢子菌属（Trichosporon spp. ）属于担 子菌门无性型酵母菌，可引起皮肤感染、 肺部感染，阿萨希毛孢子菌甚至有播散性 感染的报道
实验目的
在形态学、营养生理学的基础上探讨 RFLP分析及rDNA ITS序列测定用于 区分不同的毛孢子菌种
BMU01463
BMU02466
Trichosporon asahii
Trichosporon asahii
标准株
痰
CBS.2479
北大一院
实验方法
形态学试验 ◆温度试验 ◆生理学试验
◆
rDNA ITS 测序 ◆ PCR-RFLP
◆
实验结果
——形态学
三种菌的菌落外观形态比较相似，呈白、黄 色、圆形，脑回状 ◆小培养镜下均可见到关节孢子，皮瘤毛孢子菌 还可见到鹿角菌丝，皮毛孢子菌及阿萨希毛孢 子菌可见到较多卵圆形的关节孢子
◆
12 11 10 9
8 7
6
5 4 3
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近年来，镰刀菌引起的感染有不断上升的趋 势，尤其在真菌性角膜炎中镰刀菌已占主导 地位 常规的镰刀菌鉴定方法费时Байду номын сангаас烦琐，往往不
能满足临床需要
◆
实验目的
对临床分离的镰刀菌进行分类鉴定，了解致病 菌种的分布情况 ◆从分子生物学角度寻找快速鉴定常见镰刀菌的 方法，为临床早期诊断提供依据
◆
材料与方法
◆
毛孢子菌属大部分种的ITS序列在Genbank中 均可查到，所以可通过测定rDNA ITS序列来 鉴定毛孢子菌 ◆Cfr 13I、Nco I 可区分皮瘤毛孢子菌、皮毛孢 子菌和阿萨希毛孢子菌，但由于实验菌种有限， 两者是否可用于鉴定毛孢子菌其他的种尚有待 进一步验证
◆
结论
1. 形态学是鉴定毛孢子菌的基础 2. API 20C 有其鉴定的局限性 3. 温度试验可区分皮毛孢子菌与 阿萨希毛孢子菌 4. 限制性内切酶Cfr13I、NcoI有望应用于皮瘤毛孢 子菌、皮毛孢子菌与 阿萨希毛孢子菌的鉴定 5. 通过rDNA ITS的序列测定可辅助鉴定毛孢子菌种
多数水生，能在水中游动，腐生或 寄生，与医学关系不大
接合菌门 Zygomycota
虫霉目包括冠状耳霉和蛙粪霉 毛霉目包括根霉、毛霉、犁头霉、根毛霉
担子菌门 Basidiomycota
该门包括红酵母、隐球菌、掷孢酵母等
子囊菌门 Ascomycota
大部分真菌均属于此门，如曲霉、青霉、 链格孢、镰刀菌等
毛孢子菌和镰刀菌的 分类鉴定
真菌的分类
目前真菌界包括4个门： 壶菌门 Chytridiomycota 接合菌门 Zygomycota 担子菌门 Basidiomycota 子囊菌门 Ascomycota 半知菌 deuderomycetes （丝裂孢子真菌 Metoaporic fungi）
壶菌门 Chytridiomycota
实验菌株：北大一院真菌中心保存的30株镰 刀菌、12株非镰刀菌，同仁医院眼科研究所 提供的68株镰刀菌，共110株 ◆实验方法： 形态学实验 分子生物学实验
◆
形态学实验
对同仁医院68株分离自病人角膜的镰刀菌进行 形态学鉴定 ◆大培养——将受试菌株种于PDA平板，25℃培 养，观察菌落形态、色泽 ◆小培养——将受试菌株种于钢圈内PDA， 25℃ 培养，观察大、小分生孢子的形态，瓶梗类型， 厚壁孢子的有无等
2
1 M
Cfr13I酶切带型
NcoI酶切带型
M泳道为100bp ladder，1，3，5，7，9，11泳道依次为限制性 内切酶作用后的BMU00242，00706，01431，01463，02466， 00277的PCR扩增产物；2，4，6，8，10，12泳道依次为未经 限制性内切酶作用的BMU00242，00706，01431，01463， 02466，00277的PCR扩增产物
实验菌株
编 号
BMU00242 BMU00277 BMU00706 BMU01431
种 名
Trichosporon inkin Trichosporon cutaneum Trichosporon asahii Trichosporon asahii
标本
血液 标准株 皮屑 肝组织
来 源
美国UTHSCSA ATCC-28592 北大一院 北京军区总院
第二部分 镰刀菌的分类鉴定
概 述
镰刀菌属（Fusarium spp. ）在自然界广泛存在， 与人类关系密切，有些种能引起农作物的病害导 致严重减产，有些种能产生植物激素，刺激农作 物生长 ◆镰刀菌是条件致病菌，临床上常可引起角膜炎、 甲真菌病等浅部感染，在免疫低下病人还可引起 系统性感染甚至死亡
◆
Trichosporon inkin（皮瘤毛孢子菌）
菌落 SDA 22℃ 10天 MEA 22℃ 4天 （ × 400）
Trichosporon cutaneum（皮毛孢子菌）
菌落 SDA 22℃ 10天 MEA 22℃ 4天 （ × 400）
Trichosporon asahii（阿萨希毛孢子菌）
讨论
阿萨希毛孢子菌以前归属于皮毛孢子菌（皮毛 孢子菌又名白吉利毛孢子菌—T. beigelii），由 Sugita 1994年命名 ◆皮毛孢子菌API结果不理想，原因在于API 20C AUX （1997年）新版鉴定系统菌种库中没有T. cutaneum（皮毛孢子菌） ◆阿萨希毛孢子菌与皮毛孢子菌的形态及糖同化 实验相似，区别两者最简单的方法是温度试验
菌落 SDA 22℃ 10天 MEA 22℃ 4天 （ × 400）
实验结果
——生理学实验
◆
皮毛孢子菌的API 20C结果无法读取，其 它菌的API结果与形态学鉴定一致
实验结果
——温度实验
皮瘤毛孢子菌 皮毛孢子菌 阿萨希毛孢子菌 30℃ + + + 37℃ + + 42℃ -
实验结果
——分子生物学实验
ITS1
ITS4 18S rDNA 5.8S rDNA 28S rDNA
真菌核糖体基因(rDNA)结构
第一部分 毛孢子菌的分类鉴定
概 述
毛孢子菌属（Trichosporon spp. ）属于担 子菌门无性型酵母菌，可引起皮肤感染、 肺部感染，阿萨希毛孢子菌甚至有播散性 感染的报道
实验目的
在形态学、营养生理学的基础上探讨 RFLP分析及rDNA ITS序列测定用于 区分不同的毛孢子菌种
BMU01463
BMU02466
Trichosporon asahii
Trichosporon asahii
标准株
痰
CBS.2479
北大一院
实验方法
形态学试验 ◆温度试验 ◆生理学试验
◆
rDNA ITS 测序 ◆ PCR-RFLP
◆
实验结果
——形态学
三种菌的菌落外观形态比较相似，呈白、黄 色、圆形，脑回状 ◆小培养镜下均可见到关节孢子，皮瘤毛孢子菌 还可见到鹿角菌丝，皮毛孢子菌及阿萨希毛孢 子菌可见到较多卵圆形的关节孢子