病毒增殖培养
病毒的增殖
第二十八讲病毒的增殖教学目的：掌握病毒的增殖过程各阶段特点教学重点：病毒的增殖过程教学难点：病毒的增殖过程课时分布：1学时教学过程：病毒在活细胞中的繁殖既不象细菌一样进行二分分裂，也不象霉菌样通过形成孢子繁殖。
病毒细胞结构不完整。
仅由生物大分子构成。
缺乏代谢必需的酶系统与能量。
不可能合成自力的蛋白质与核酸。
从而决定了病毒是通过感染寄主细胞后。
控制宿主细胞的整套生物合成机构，利用它的合成材料，按照病毒的遗传特性，合成病毒的核酸与蛋白质。
然后组装成新的病毒粒子，故称增殖。
一、病毒的复制周期1、一步生长曲线：是病毒接种于敏感细胞后培养时，定时取样测定培养物中的病毒效价，以病毒效价对培养时间作图而得的病毒特征性的繁殖曲线。
潜伏期：是毒粒吸附于细胞到受染细胞释放子代毒粒的时期。
裂解量：平均每个感染细胞裂解时所释放的代毒粒的数目。
2、隐蔽期：病毒在受染细胞内消失到细胞内出现新的感染性病毒的时间。
3、病毒的复制周期定义：指病毒自吸附、侵入到释放的整个复制过程。
包括五个阶段：吸附、侵入、脱壳、大分子合成、装配与释放。
二、病毒的复制过程分五个阶段：（-）吸附是病毒感染细胞的第一步。
1、病毒吸附蛋白当病毒与寄生细胞混合时，由于运动（扩散、分子运动、静电引力）而吸附在敏感细胞的特异性受体上，病毒吸附蛋白能特异性地识别它。
无包膜毒粒的病毒吸附蛋白是核壳的组成部分，有包膜的则为包膜糖蛋白。
2、细胞受体受体是具有一定化学结构的球形体，位于宿主细胞表面。
不同寄主细胞，其受体的化学结构不同。
当寄主细胞发生突变而使受体结构发生改变，不再被某一种病毒所吸附，则寄主细胞获得了对该病毒的抗性。
如果病毒一方发生变异，吸附也不能发生，或病毒一方也发生变异，重新能吸附有抗性的寄主细胞。
（二）、侵入与脱壳侵入方式由宿主细胞的性质，尤其是表面结构所决定的。
1、噬菌体①尾部未端附着在敏感细菌表面，尾丝撒开并固着于细胞上。
②尾部产生溶菌酶水解细胞的肽聚糖，使细胞壁产生孔洞。
动物微生物-病毒的增殖和培养
详细描述
过滤分离法适用于从大量液体中提取病毒，通常使用孔 径大小适宜的滤膜，将病毒颗粒截留在滤膜上，而将其 他杂质通过滤膜过滤掉。该方法操作简便，但需要选择 合适的滤膜孔径以获得较高纯度的病毒。
蔗糖梯度离心法
总结词
利用不同浓度的蔗糖溶液形成的密度梯度，将病毒从混合物中分离出来的方法。
详细描述
蔗糖梯度离心法是一种常用的病毒纯化技术，通过在离心管中形成连续的蔗糖浓度梯度，将不同密度的病毒颗粒 分离。病毒颗粒在离心后会停留在相应的蔗糖密度层，从而达到纯化目的。该方法能够分离出较高纯度的病毒， 但操作较为繁琐，需要精确控制蔗糖浓度和离心参数。
复制周期
复制效率
不同病毒的复制效率有很大差异，有 些病毒可以在短时间内复制出大量的 子代病毒。
病毒的复制周期包括吸附、侵入、复 制、组装和释放等阶段。每个阶段都 需要一定的时间和能量来完成。
病毒的培养条件
01
02
03
培养基
病毒需要在适当的培养基 中才能生长和繁殖，如动 物细胞、昆虫细胞或细菌 等。
侵入
总结词
病毒进入宿主细胞内部的过程。
详细描述
在吸附完成后，病毒通过不同的方式进入细胞内部，如内吞、膜融合等。这一 过程需要病毒利用其自身的酶或诱导细胞内的信号转导途径来完成，以确保病 毒基因组能够进入细胞内部并开始复制。
脱壳
总结词
病毒基因组从其蛋白质外壳中释放出来的过程。
详细描述
在病毒进入细胞后，其蛋白质外壳会被细胞内的酶分解，使得病毒的核酸基因组得以释放。这一过程 对于病毒的复制是必须的，因为只有当基因组被释放出来后，才能利用宿主细胞的合成系统来复制病 毒的基因组和蛋白质。
详细描述
动物接种法是将病毒接种于易感动物，如小 白鼠、家兔、豚鼠等，观察其发病表现和病 理变化，以研究病毒的生物学特性和致病性。 这种方法可以模拟自然感染过程，但实验动 物感染病毒后可能出现死亡或发病，需要严 格控制实验条件和动物福利。
动物病毒细胞增殖的研究进展
动物病毒细胞增殖的研究进展目前，细胞培养在病毒学方面的研究最为广泛。
病毒和宿主细胞共同决定病毒适应细胞生长并增殖。
病毒首先通过特定的受体吸附于宿主细胞膜上，与受体结合后，进入宿主细胞内进行基因组的复制。
期间，病毒成功感染细胞除了需要病毒与受体结合，还依赖于膜融合、内吞、囊泡运输及核定位信号介导入核等多个过程。
细胞通过特异的病毒一受体相互作用来识别病毒，这些受体决定了细胞对病毒的敏感性。
尽管流感病毒、狂犬病毒、口蹄疫病毒等能够成功的使用细胞培养，但是很多病毒的宿主范围很窄，病毒甚至无法进行细胞培养。
本文通过以下方法：宿主细胞的选择、细胞连续传代、改变细胞培养条件、添加病毒保护剂、改变细胞结构，对动物病毒适应细胞培养增殖研究进行概述。
1 合适的宿主细胞病毒适应细胞的能力与病毒自然宿主、病毒原发器官和细胞类型有关。
例如，鸭肝炎病毒不能感染哺乳动物单层细胞；水貂流行性腹泻冠状病毒仅在貂肺细胞培养繁殖；马传染性贫血病毒常用马胚肾细胞系培养。
SARS病毒注射到鸡、火鸡、鹅、鸭和鹌鹑胚的尿囊腔中病毒不复制，不引起病变。
猪伪狂犬病毒虽然具有广泛的嗜性，能在多种细胞内繁殖，但敏感度不同，其中以兔肾细胞和猪肾细胞(原代和传代细胞系)最适于病毒的增殖，在PK15(猪源)、Vem(猴源)、BHK(鼠源)、CEF(鸡源)细胞中，该病毒在PK15上增殖速度最快。
Coria等用鸡传染性支气管炎病毒Beaudene株接种猫、狗、绵羊、鹅等14种非宿主动物肾细胞发现，培养的病毒滴度要远远低于接种鸡胚肾细胞的病毒滴度。
其中，在猫、狗、猪的肾细胞内采用直接荧光抗体方法检测不到病毒。
Lukert等通过比较在鸡胚、原代鸡胚肾细胞、肝细胞上感染鸡传染性支气管炎病毒的增殖情况发现，病毒在鸡胚上的敏感度最高，是肾细胞的12～40倍，肝细胞的500～1000倍。
鸡气管环上皮细胞对该病毒更敏感、更容易适应，鸡传染性支气管炎病毒肾变型分离株能够较容易的适应鸡胚肾细胞。
仙台病毒增殖及滴度测定(sendai virus)
一、SeV 鸡胚增殖1、从北京梅里亚维通购买零日龄SPF鸡蛋20枚。
2、放置37℃培养箱培养10天，每天鸡蛋旋转3次，并确保气孔朝上。
其中培养箱中要放置水，保持培养箱的湿度。
3、培养10天后，用照蛋器观察鸡胚发育情况，血管明显，表明鸡胚发育正常，用铅笔在鸡蛋上标注气孔。
4、发育完好的10日龄的鸡胚用于SeV 增殖，将鸡胚先用紫药水在气孔处擦拭，然后再用酒精棉擦拭第二遍。
5、用打蛋器在气孔上方打一个小洞，然后用1ml 的注射器，吸取约200ul SeV ，倾斜45度注射进鸡胚的尿囊液，然后用石蜡将注射空封闭。
6、将鸡胚放置37℃培养箱培养3天，进行SeV病毒的增殖。
7、将鸡胚放置4℃过夜，使血管收缩，以利于尿囊液的收取。
8、将鸡胚的气孔轻轻破碎，然后用细胞管，轻轻吸取上层的尿囊液，一般约10ml 左右。
9、将收集的尿囊液2000rpm 离心10min,弃沉淀。
10、吸取约50ul 用于血凝测试，剩余的放置-80℃冰箱冻存。
血凝试验测定方法：准备工作：需要准备阿氏液、生理盐水(0.9g NaCl+100ml蒸馏水) 灭菌30min、10ml的注射器、50ml的离心管、血凝板1、取50ml的离心管，加入约20ml的阿氏液，在10ml的注射器中的加入2ml的阿氏液，然后经鸡翅静脉取血，取血约2ml左右。
2、将鸡血加入到50ml的离心管中，反复混匀，防止鸡血凝结。
3、1500rpm 离心10min，小心去除上清液以及中间层在白细胞薄膜，将下层红细胞加入一定量的生理盐水，轻柔混匀(不要过于剧烈，以防红细胞破裂)，1500rpm 离心10min。
这样反复用生理盐水洗三遍。
4、回收洗好的红细胞，然后按照10%的稀释度加入生理盐水，配制成10%的红细胞悬液，4℃备用。
使用的时候，再稀释十倍，配制成1%的工作浓度。
5、用移液器向血凝板每孔中加入生理盐水50ul，然后用移液器取待测H1N1病毒50ul，加入第1孔，反复吹打6次后，吸出50ul加入第2孔，反复吹打，吸出50ul加入第3孔，如此联系稀释至第11孔后，吸出50ul弃去。
病毒的复制、增殖
双股DNA病毒 单股DNA病毒 单正股RNA病毒 单负股RNA病毒 逆转录病毒 双股RNA病毒
( dsDNA V ) ( ssDNA V ) ( +ssRNA V ) ( -ssRNA V ) ( 逆转+ssRNA V ) ( dssRNA V)
3.生物合成 biosynthesis
通过病毒基因组表达与复制来完成的，包括蛋白 质的合成与核酸的复制, 此阶段无完整病毒可见， 也不能用血清学检测出病毒的抗原，称为隐蔽期 发生在病毒核酸复制之前的转录称为早期转录， 产物为早期mRNA，翻译出早期蛋白；发生在病 毒核酸复制开始或之后的转录称为晚期转录， 产 物为晚期mRNA，翻译出晚期蛋白.
Host cell DNA
RNase H
DNA
Reserse transcriptase
DNA DNA
Viral proteins and glycoproteins
Diagram of retrovirus New virus particles
完整的病毒为一个感染单位又称毒粒 病毒在细胞外环境中不起作用，它们只能 在活的易感细胞内增殖，属基因水平的寄 生物。 病毒进入细胞内，以病毒核酸编码信息指 令感染细胞合成病毒特异性大分子，最终 产生子代病毒。
病 毒 的 基因结 构
由于病毒的基因结构不同，不同病毒感染 易感细胞后其结构不同，即细胞损伤或死 亡、细胞无损或共存 从单细胞的微生物到动、植物均可被病毒 感染，这些病毒的基因组千差万别，但仍 有共同点（如遗传密码） 病毒与宿主关系的许多信息从研究噬菌体 获得
replication
Retrovirus: HIV
（１）逆转录酶； （２）复制中间体（replicative intermediate, RI）； +RNA—DNA
病毒的复制增殖过程
病毒的复制增殖过程病毒不具有能独立进行代谢的酶系统，因此只有进入活的易感宿主细胞内，由宿主细胞提供合成病毒核酸与蛋白质的原料，如低分子量前体成分、能量、必要的酶等，病毒才能增殖。
病毒增殖的方式不是二分裂，而是自我复制。
即以病毒核酸为模板，在DNA多聚酶或RNA多聚酶及其他必要因素作用下，合成子代病毒的核酸和蛋白质，装配成完整病毒颗粒并释放至细胞外。
病毒复制(replication )—般可分为吸附、穿入、脱壳、生物合成及装配与释放5个阶段，称为复制周期(replication c ycle) °病毒经过复制产生大量的子代病毒，而此时，宿主细胞的生物合成则受到不同程度的抑制和破坏。
一、病毒复制周期吸附(adsorption )吸附于宿主细胞表面是病毒感染的第一步。
吸附主要是通过病毒体表面的配体蛋白与易感细胞表面特异性受体相结合。
不同细胞表面有不同受体，它决定了病毒的不同嗜组织性和感染宿主的范围，如小RNA病毒衣壳蛋白特定序列能与人及灵长类动物细胞表面脂蛋白受体结合，而腺病毒衣壳触须样纤维能与细胞表面特异性蛋白相结合。
有包膜病毒多通过表面糖蛋白结构与细胞受体结合，如流感病毒HA糖蛋白与细胞表面受体唾液酸结合发生吸附；人类免疫缺陷病病毒(HIV)包膜糖蛋白gp120的受体是人Th细胞表面CD4分子；EB病毒则能与B细胞CD21受体结合。
无受体细胞不能吸附病毒，也不能发生感染。
细胞含受体数不尽相同，最敏感细胞可含10万个受体。
吸附过程可在几分钟到几十分钟内完成° 穿入(penetration )病毒与细胞表面结合后，可通过胞饮、融合、直接穿入等方式进入细胞。
胞饮类似吞噬泡，细胞内陷将病毒包进细胞浆内，无包膜病毒多以胞饮形式进入易感染动物细胞内。
融合是指病毒包膜与细胞膜融合，包括病毒融合蛋白与细胞第二受体的作用，如HIV与CCR5的结合。
融合后再将病毒的核衣壳释放至细胞浆内。
还有少数无包膜病毒在吸附时某些蛋白衣壳的多肽成分发生改变，从而可直接穿过细胞膜。
名词解释病毒的增殖
名词解释病毒的增殖病毒的增殖，是指病毒在寄主细胞内繁殖和增加数量的过程。
病毒是一类非细胞生物，无法自主生长和繁殖，需要寄生在寄主细胞内完成其生命周期。
病毒的增殖过程是一个复杂而精密的机制，涉及到多个环节和调控因子。
病毒入侵寄主细胞后，首先要进入细胞内部。
病毒通常通过与细胞膜相互结合或利用细胞内的胞吞作用等方式进入细胞内。
一旦病毒成功进入细胞内，它会释放出自己的核酸（DNA或RNA）和一些必要的蛋白质，以便进行复制和转录。
这些病毒蛋白质和核酸将开始调控细胞内的机制，以促使自身的表达和复制。
在病毒增殖的过程中，病毒核酸的复制起着关键作用。
通过病毒自身编码的酶或利用细胞内的酶，病毒核酸得以实现复制。
病毒的DNA或RNA在细胞内得到复制后，将形成更多的病毒基因组，为进一步的繁殖提供基础。
随着病毒复制过程的进行，病毒基因组和蛋白质逐渐积累。
病毒蛋白质具有特定的功能，如帮助病毒组装、促进病毒颗粒的形成以及干扰宿主细胞的正常功能。
这些蛋白质在病毒增殖过程中扮演着重要的角色，它们能够与细胞内的分子相互作用，从而实现病毒的繁殖和扩散。
一旦病毒完成了其内部的复制、转录和翻译等过程，它将开始组装成完整的病毒颗粒。
这个过程涉及到病毒蛋白质的自组装以及与病毒基因组的结合。
细胞内的胞吞或胞吐过程可以帮助病毒颗粒离开寄主细胞，并以不同的方式传播到其他细胞或宿主体内。
病毒的增殖是一个快速而高度有序的过程，它必须严密地控制每个环节的时机和数量，以保证病毒能够高效地繁殖。
在病毒增殖过程中，许多调控机制参与其中，包括细胞因子、信号转导通路以及病毒自身编码的蛋白质等。
这些因子相互作用，形成一个复杂的网络，以保证病毒的复制和繁殖在适当的时间和条件下进行。
病毒增殖不仅对于病毒本身具有重要意义，也对宿主细胞和宿主体具有重要影响。
病毒增殖过程中，病毒会耗尽宿主细胞的资源，并破坏宿主细胞内部的正常机制。
一些病毒还能够抑制宿主的免疫系统，使得宿主更容易受到感染和疾病的侵袭。
病毒的增殖
病毒的增殖1.同学们大家好，欢迎来到微生物检验技术微课堂，本次课我们学习病毒的增殖。
2.病毒的增殖又称为病毒的复制，是指病毒在宿主细胞中繁殖的过程，由于病毒的结构非常简单，缺乏能够独立代谢的酶系统，所以它只能够借助宿主细胞的代谢系统来进行增殖。
那么病毒的增殖是在病毒的核酸进入宿主细胞后，生物活性才能够启动，病毒以自身的基因为模板，借助宿主的细胞器和酶系统，并由宿主细胞来提供原料、能量等等，然后再按照一定的程序复制出病毒的基因组，同时转录，翻译出相应的病毒蛋白，最终装配释放出子代病毒。
3.我们把这个过程可以人为的分为吸附，穿入、脱壳、生物合成和装配释放五个相互联系的阶段。
我们把这个过程称为复制周期。
4.接下来我们来详细了解病毒增殖的过程，病毒增殖的第一步是对易感细胞的吸附，病毒通过它表面结构当中的吸附蛋白与宿主易感细胞表面的特异性的受体进行结合，这种结合是不可逆的，但有高度的特异性，所以这种病毒和宿主细胞结合的特异性，就决定了病毒宿主的范围和组织的噬性，我们把它称之为病毒组织选择性。
比如说人类免疫缺陷病毒HIV它会通过包膜表面的刺突蛋白gp 120与受体的CD4分子进行一个特异性的结合，因此HIV它只会感染带有CD4分子的T细胞，我们知道CD4分子主要是表达在CD4T淋巴细胞表面，所以HIV它主要攻击的对象就是CD4阳性的T淋巴细胞，这时候病毒就完成了增殖的吸附过程。
5.病毒增殖的第二步就是穿入过程，病毒与细胞表面结合吸附于易感细胞后就开始了穿入过程，穿入的方式随着病毒种类的不同而会不同，一般来说无包膜的病毒通过细胞膜内陷以包饮的方式将衣壳吞入，而有包膜的病毒则通过包膜与宿主细胞膜融合以后再进入到细胞内，当然还有一些病毒可以直接穿透细胞膜而进入宿主细胞内。
6.病毒增值的第三步就是脱壳过程，病毒必须要在穿入细胞以后先脱去蛋白衣壳，再将核酸游离释放出来以后才能够发挥作用，脱壳的过程包括去除包膜、衣壳蛋白和基质蛋白，大多数的病毒在穿入的过程中，一边脱衣壳，一边释放病毒核酸，只有少数的病毒在进入宿主细胞以后再进行脱壳。
病毒学教学材料病毒的增殖
病毒的增殖病毒的增殖是病毒侵入寄主细胞后，利用宿主细胞的成分和生物合成机构，以病毒核酸为模版来合成病毒本身成份，并装配成新的子代病毒子的过程。
这一过程不同于细胞性生物的繁殖（二分裂或有丝裂等），故称为增殖成复制，而有别于繁殖。
对于病毒增殖过程和生物合成的研究，不仅关系到病毒病的防治，而且涉及生命起源和肿瘤学等重大理论和实践课题。
有关生命本质及其起源的研究，必须从非细胞形态的生命物质开始。
在这方面，病毒是最理想的模型。
例如，在有适当的前体和酶的存在条件下，提纯的病毒RNA或DNA甚至可在试管内增殖。
同样，病毒RNA可在试管内于细菌的核蛋白体上译制病毒蛋白质。
病毒核酸和病毒蛋白质也可在试管内装配成为完整的病毒子等。
又有人认为，病毒可有以“附加基因”的方式，结合入细胞遗传物质，成为生物进化的原因。
肿瘤，就其本质来讲，是细胞基因突变的结果。
病毒至少是肿瘤病因中的一个重要因素。
目前发现的脊椎动物肿瘤病毒已经超过30种，而有致肿瘤特性的病毒约有150多种。
最近证明，RNA致瘤病毒可借反录酶的作用，在细胞内复制出含有病毒信息的DNA，结合入细胞DNA，改变细胞的遗传性，干扰细胞的正常生命活动而导致细胞恶性变。
最近发现“缺损病毒”，没有完整的病毒子构造，可能只有核酸的片段残留在细胞中，与细胞染色体结合而逐代传递，成为细胞恶性变的原因。
病毒性疾病的化学预防和化学治疗，已被证明是完全可能的，实践中也已取得初步成果。
目前发现的一些不见于正常细胞而为病毒增殖所必需的核酸合成酶和其他蛋白质，为病毒病的的化学防治提供了进一步的可能性。
而对病毒生物合成各环节的深入了解，则为选择适当药物，切断病毒增殖周期，阻碍病毒增殖而达到防治目的，创建现实的基础。
第一节病毒的增殖场——细胞病毒由于缺乏自身增殖所需的完整酶系统，增殖时必须依靠宿主细胞合成核酸和蛋白质，甚至直接利用宿主细胞的某些成分，这就决定了病毒在细胞内专性寄生的特性。
活细胞是病毒增殖的唯一场所，也是病毒生物合成所需的能量和材料的主要供应者。
动物病毒学-第2章病毒的增殖
第二章病毒的增殖我们知道，病毒颗粒体现的是病毒静止和不活动的形式。
病毒的真实情况只能在它们与细胞间的反应时期才能够清楚地认识到。
病毒体在细胞外是处于静止状态，基本上与无生命的物质相似，当病毒进入活细胞后便发挥其生物活性。
由于病毒缺少完整的酶系统，不具有合成自身成份的原料和能量，也没有核糖体，因此决定了它的专性寄生性，必须侵入易感的宿主细胞，依靠宿主细胞的酶系统、原料和能量复制病毒的核酸，借助宿主细胞的核糖体翻译病毒的蛋白质，病毒这种增殖的方式叫做“复制（Replication）”。
病毒在活细胞内，以其基因为模板，在酶的作用下，分别合成病毒基因及蛋白质，再组装成完整的病毒颗粒，这种方式称为复制（replication)。
从病毒进入宿主细胞开始，经过基因组复制和病毒蛋白合成，至释放出子代病毒的全过程，称为一个复制周期。
病毒的复制周期主要包括吸附、穿入、脱壳、生物合成、装配和释放六个连续步骤。
早在20世纪40～50年代，不少学者以噬菌体为研究模型，获得了病毒增殖的初步认识。
随着哺乳动物细胞培养技术的发展，对动物病毒的转录、翻译和核酸复制基本机理以及基因表达和调控的研究已取得了很大的进展。
动物病毒的增殖过程，可分为三个时期：隐蔽期，早期和后期。
所有病毒的增殖都可以分为六个连续阶段，即吸附、穿入、脱壳、生物合成、装配和释放。
【吸附和穿入、脱壳、生物合成、装配和释放四个连续步骤】病毒增殖各阶段中的差异，特别是在生物合成、装配和释放中的差异，在疾病的病理发生上和对病毒感染的预防、诊断及治疗方面的影响是最有意义的值得研究的问题。
在研究病毒增殖或增殖时还要注意，病毒的增殖是一个连续不断的进行性的过程，直至把细胞的内容物全部耗尽。
不同科属的病毒各有其独特的方式。
第一节病毒的一步生长曲线所谓病毒的一步生长曲线即以感染时间为横坐标，病毒效价为纵坐标，绘制出的病毒特征曲线。
病毒效价：待测样品中病毒数量通常以单位体积病毒悬液的感染单位数目来表示（IU/mL），称为病毒效价。
病毒培养技术
悬浮培养
通过振荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮于培养液内 的培养方法，主要用于一些在振荡或搅拌下能生长繁殖的细 胞，如生产单克隆抗体的杂交瘤细胞。
微载体培养
微载体直径应为60～105nm，无毒性，透明，颗粒密度与培 养液密度相近似，略重于液体，低速搅拌即能悬浮，不吸收 培养液和化学反应，表面光滑、硬度小、有弹性，易于细胞 吸 附 在 表 面 ， 如 DEAE—SephadexA-50 、 Cytodexl 、 Cytodex2、Cytodex3等。
有些病毒不产生CPE。 病毒收获：CPE达80％时收获，反复冻融多次使病毒释放，
然后离心除去细胞碎片，上清病毒液-20℃保存。 病毒毒价：TCID50、中和试验、AGP效价、HA
疫苗制造工艺流程
病毒性细胞疫苗制造工艺流程
病毒性组织疫苗制造工艺流程
细菌疫苗和类毒素制造工艺流程
寄生虫疫苗制备的工艺流程
3. 细胞培养要素
•培养液 •血清 •细胞接种量 •pH •温度 •无菌条件 •培养器皿清洁度
RPMI-1640、199、 DMEM、F12
血清
• 成分：必需氨基酸、促进细胞生长和贴壁的成分。α-珠蛋 白和白蛋白能促进细胞生长；白蛋白具有毒作用；糖蛋白、 a2-球蛋白和β脂蛋白G2能促进细胞贴壁。
（1）原代细胞(primary cell)
指由新鲜组织经剪碎和胰酶消化制备的细胞，如CEF细胞。
（2）细胞株(cell strain) 又称二倍体细胞
指自继代培养的细胞中选育出具有特殊生物学性质和标记的 细胞。这类细胞且能保持原来的二倍染色体数目，能连续传很 多 代 (50 ～ 100 代 ) ， 但 为 有 限 生 命 ； 没 有 肿 瘤 原 。 如 PKl5 、 BHK21和Vero （3）传代细胞（continued cell line）\ 细胞系(cell line)
第三章病毒的增殖
噬菌体的一步生长曲线
（噬 菌 斑 数）
吸附期
潜伏期
裂解期
噬菌体复制（繁殖） 的三个阶段： 1、吸附期
游离的噬菌体吸附到宿主细胞
2、潜伏期
从噬菌体吸附到细胞到释放 出新噬菌体的最短时期
3、裂解期
随着菌体不断破裂，新噬菌体 数目增加，直到最高值
（一）、一步生长曲线（one step growth curve）
隐蔽期病毒在细胞内存在的动力学曲线呈线性函数，而非指数关系， 从而证明子代病毒颗粒是由新合成的病毒基因组与蛋白质经装配成 熟，而不是通过双分裂方式产生的。
（一）、一步生长曲线（one step growth curve）
是研究病毒复制的一个经典试验，最初是为研究噬菌体的复 制而建立，以后推广到动物病毒和植物病毒复制研究中。
吸附
侵入
脱壳
早期：病毒特异性酶的合成 病毒核酸复制 病毒结构蛋白质合成 病毒大分子合成
装配
成熟 释放
（二）、一步生长曲线（one step growth curve）
1939年，Max Delbruck & Emory Ellis：
该实验标志着分子病毒学、分子生物学和分子遗传学 的建立，Max Delbruck因此荣获1969年Nobel Prize 1、用噬菌体的稀释液感染高浓度的宿主细胞 2、数分钟后，加入抗噬菌体的抗血清 3、将上述混合物大量稀释 4、保温培养并定期检测培养物中的噬菌体效价 5、以感染时间为横坐标，病毒的感染效价为纵坐标， 绘制出病毒特征性的繁殖曲线
隐蔽期（eclipse period）
不同病毒的隐蔽期长短不同 例如，DNA动物病毒的隐蔽期为5～20min， RNA动物病毒为2～10 h。
病毒培养方法
病毒培养方法病毒培养是一种重要的实验技术，它对于研究病毒的生物学特性、病毒感染机制以及病毒致病性等方面具有重要意义。
在进行病毒培养时，需要严格控制培养条件，以确保病毒的生长和增殖。
本文将介绍常见的病毒培养方法，希望能够对病毒研究工作者有所帮助。
首先，选择适当的宿主细胞是进行病毒培养的关键。
不同的病毒对宿主细胞有不同的特异性，因此需要根据病毒的特性选择合适的宿主细胞进行培养。
常用的宿主细胞包括Vero细胞、HEK293细胞、HepG2细胞等，研究人员可以根据自己的实验需要选择合适的宿主细胞。
其次，培养基的选择也是影响病毒培养效果的重要因素。
培养基中含有的营养物质、生长因子和抗生素等成分都会影响病毒的生长和增殖。
一般来说，培养基应该含有足够的营养物质，能够满足病毒的生长需求。
同时，为了防止细菌和真菌的污染，可以在培养基中添加适量的抗生素。
接着，病毒的感染和培养需要在无菌条件下进行。
在进行病毒感染时，需要确保操作台面、培养箱和培养器具等都经过严格的消毒处理，以防止外源性的细菌和真菌的污染。
在感染宿主细胞后，需要将细胞培养在恰当的温度和湿度条件下，以促进病毒的生长和增殖。
最后，病毒的收获和纯化也是病毒培养过程中的关键步骤。
在病毒感染后，需要定期观察细胞的形态变化和病毒滴度的增加情况，一旦病毒滴度达到一定水平，就可以进行病毒的收获和纯化。
收获病毒时，可以通过离心、过滤等方法将病毒颗粒从培养基中分离出来；而在纯化病毒时，则需要利用差速离心、梯度离心等技术将病毒颗粒从杂质中分离出来，以获得纯净的病毒制备物。
总之，病毒培养是一项复杂而又重要的实验技术，它需要研究人员在实验操作中严格控制各项条件，以确保病毒的生长和增殖。
通过选择合适的宿主细胞、培养基，以及在无菌条件下进行感染和培养，最终可以获得高滴度、纯净的病毒制备物，为病毒研究提供可靠的实验材料。
希望本文所介绍的病毒培养方法能够对研究人员有所帮助，促进病毒研究的进展。
病毒的增殖过程
病毒的增殖过程病毒缺乏自身增殖所需的完整的酶系统，增殖时必须依靠宿主细胞合成核酸和蛋白质，甚至直接利用宿主细胞的某些成分，这就决定了病毒在细胞内专性寄生的特性。
活细胞是病毒增殖的唯一场所，也是病毒合成所需能量和材料的主要供应者。
病毒增殖的过程大致可分为：吸附与侵入、脱壳、病毒成分的合成以及装配与释放等4个主要阶段。
一、吸附和侵入病毒的吸附分两步进行。
首先，病毒与细胞以静电引力相结合。
这种吸附是非特异性的和可逆的。
病毒可在细胞表面任何部位吸附，不具有任何选择性。
单纯的稀释或冲洗以及应用抗病毒血清或高浓度盐类和一定的pH环境，都可使病毒从吸附物上重新解脱出来。
病毒吸附的第二个阶段，呈不可逆性结合。
此时，病毒蛋白与细胞膜表面特定的受体特异结合。
受体与病毒的结合，需要具备一定的粒子浓度，以减少静电干扰。
这种特异性结合与温度及能量的关系不大。
可逆与不可逆的两阶段吸附过程，可能并非所有病毒的共同规律。
有些病毒一经吸附于敏感细胞，就再不能解脱。
而另一些病毒，如正粘病毒及负粘病毒，即使进入了不可逆的结合阶段，病毒粒子仍可由细胞上分离，并吸附另一细胞。
这是由于这些病毒具有神经氨酸酶，该酶可切断细胞受体多糖链上的神经氨酸。
侵入与吸附是一个连续的过程。
不过，侵入是一个依靠能量的过程。
目前发现病毒侵入细胞有3种方式：①病毒直接转入胞浆；②细胞吞饮病毒；③病毒囊膜同细胞膜融合。
无囊膜病毒以前两种方式侵入，囊膜病毒常以第三种方式进入。
小RNA病毒是以第一中方式侵入细胞的典型例子。
多瘤病毒进入胞浆是第二种侵入方式的例子。
囊膜病毒以第三种方式侵入细胞。
二、脱壳病毒脱壳包括脱囊膜和脱衣壳两个过程。
在囊膜病毒（痘病毒除外），脱囊膜的过程就是上述侵入的过程。
在没有囊膜的病毒，则只有脱衣壳的过程。
病毒核衣壳的进一步裂解，也就是衣壳的脱落和核酸的逸出，主要发生在细胞浆内。
吞饮泡和溶酶体可能起着将完整核衣壳送入这些部位的作用。
某些病毒，例如呼肠孤病毒，并不发生完全的脱壳，而是在脱掉外层衣壳后，以整个核心进行核酸的转录和复制过程。
第三章：病毒的增殖
一,吸
附
病毒与细胞表面特异性受体发生碰 撞 , 病毒附着于细胞受体而引起的 病毒感染的第一阶段. 病毒感染的第一阶段.
病毒吸附分两步进行: 病毒吸附分两步进行: 可逆吸附 : 病毒与细胞以静电引力相结合 , 可逆吸附: 病毒与细胞以静电引力相结合, 是一种非特异性的吸附. 是一种非特异性的吸附. 与细胞和病毒的浓度成正比 ; 也与溶液中的 与细胞和病毒的浓度成正比; Ca2+,Mg2+, 和 Na+ 等离子有关 ( 促进或抑 等离子有关( 制作用) 制作用 ) ; 单纯的稀释或冲洗以及应用抗病 毒血清或高浓度的盐类和一定的pH环境都可 毒血清或高浓度的盐类和一定的 环境都可 使病毒重新解脱.解脱的病毒具备感染性. 使病毒重新解脱.解脱的病毒具备感染性.
五,装配和释放
1.装配:新合成的病毒核酸和病毒蛋白在感染 .
细胞内组装成完整的病毒颗粒的过程. 细胞内组装成完整的病毒颗粒的过程. 无囊膜病毒壳体与核酸结合形成的核衣壳 即为成熟的病毒; 即为成熟的病毒;囊膜病毒需要在核衣壳外加上 包膜. 包膜. 病毒的装配效率很低, 往往只有不到50% 病毒的装配效率很低 , 往往只有不到 的子代病毒成份能组装成完整的病毒粒子. 的子代病毒成份能组装成完整的病毒粒子.
4,痘病毒:较为特殊 ,痘病毒:
外层囊膜在胞膜或吞饮泡膜上被融合 外层囊膜在胞膜或吞饮泡膜上被融合, 在胞膜或吞饮泡膜上被融合 病毒核心进入胞浆内, 病毒核心进入胞浆内 , 核心借助自身衣壳 上的依赖DNA的RNA聚合酶合成 的 聚合酶合成mRNA, 上的依赖 聚合酶合成 , 进一步译制出一些早期蛋白质, 进一步译制出一些早期蛋白质 , 这些蛋白 脱壳酶, 质中有脱壳酶 质中有 脱壳酶 , 该酶反过来帮助病毒核心 进一步脱壳. 进一步脱壳.
病毒—病毒的增殖
病毒的复制周期
以培养时间为横坐标,以噬菌斑数为纵坐 标,绘制成的曲线为一步生长曲线。
可分以下阶段： 潜伏期 裂解期 稳定期
噬菌斑: 概念：将少量噬菌体与大量敏感菌混合培养在
营养琼脂中，在平板表面布满宿主细胞的 菌苔上,可以用肉眼看到一个个透明的不长 菌的小圆斑，称为噬菌斑。(每个噬菌斑一 般是由一个噬菌体粒子形成的。) 应用: 噬菌斑可用于检出、分离、纯化噬菌体 和进行噬菌体的计数。
噬菌体繁殖
1.噬菌体复制 概念
2.噬菌体增殖 过程
④装配： DNA分子的缩合——通过衣壳包裹DNA而形成头部——尾
丝及尾部的其它部件独立装配完成——头部与尾部相结合——最 后装上尾丝，至此，一个个成熟的形状、大小相同的噬菌体装配完 成。
噬菌体繁殖
1.噬菌体复制 概念
2.噬菌体增殖 过程
⑤释放： ▪裂解：多以裂解细胞的方式释放。 ▪分泌：噬菌体穿出细胞，细胞并不裂解。 通常情况下，一个噬菌体通过上述五个过程能合 成100——300个噬菌体。烈性噬菌体的这种生 长繁殖方式也称为一步生长
噬菌体繁殖
1.噬菌体复制 概念
2.噬菌体增殖 过程
根据噬菌体与宿主的关系： 烈性噬菌体：指感染宿主细胞后，能够使宿 主细胞裂解的噬菌体. 温和噬菌体（或溶源性噬菌体）：噬菌体感 染细胞后，将其核酸整合（附着）到宿主的 核DNA上，并且可以随宿主DNA的复制而 进行同步复制，在一般情况下，不引起寄主 细胞裂解的噬菌体。
微生物学及操作技术
病毒的增殖
目录页 CONTENTS PAGE
病毒的复制周期 噬AGE
病毒的复制周期
1
• 一步生长曲线
1.一步生长曲 线
病毒感染敏感宿主细胞后，病毒核酸进入细胞，通过其复制与表达 产生子代病毒基因组和新的蛋白质，然后由这些新合成的病毒组分装配 （assembly）成子代毒粒，并以一定方式释放到细胞外。
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病毒增殖培养
(一)目的:
1. 学习如何使病毒感染细胞。
2. 了解受病毒感染之细胞与正常细胞的不同。
3. 观察并认识细胞病变效应CPE。
4. 认识假性狂犬病病毒。
5. 学习摇摆振荡器的使用方法。
(1)组织培养:
将人或动物的组织或打散的细胞以人工培养基培养，称为组织培养或细胞培养。
病毒可在活细胞中生长并且大量増殖，是培养病毒最常用的方法。
常用的有初代细胞(primary cell) 如胚肾、猴肾、胎盘羊膜、鸡胚细胞，细胞株(cell line) 如HeLa、Hep-2、KB及MDBK细胞。
大多数病毒增殖后，细胞可出现病变，变圆、空泡、溶解、脱落、坏死或融合，随病毒不同各异。
有些病毒可形成包涵体。
以上变化，普通显微镜就能看到。
(2)鸡胚培养:
鸡胚是天然的活组织，不少病毒能在鸡胚的适宜部位生长繁殖，是分离培养病毒的有效方法。
常用的接种途径有尿囊腔（流感病毒、腮腺炎病毒）、羊膜腔（流感病毒的初次分离）、绒毛尿囊膜（天花、牛痘、单纯疱疹病毒）、卵黄囊（里奥病毒）。
病毒在鸡胚内繁殖后，有些可使鸡胚死亡，鸡胚和胚膜充出血，有的可使绒毛尿囊膜出现病毒斑(Avian Poxvirus)，有的可取尿囊液作血球凝集试验测定病毒的存在。
(3)动物接种:
不少病毒可感染实验动物而增殖。
常用的动物有小白鼠、家兔、猴、鸡及猪等。
不同病毒选择动物种类与接种途径的选择，因病毒种类而不同。
神经性病毒可行脑内接种，呼吸道病毒可由鼻腔接种，此外还有腹腔、角膜、泄殖腔等接种途径。
接种后的动物需逐日观察，注意发病情况。
死亡后解剖检验病变。