植物组织培养试验

《植物组织培养技术》实验指导

实验一组培室设备参观及器皿的洗涤和灭菌

一、目的要求：

1．通过参观，了解组织培养室的几个主要组成部分和各部分应有的基本设备以及有关仪器的用途与功能。

2．通过实际操作，学会洗涤剂的配制和各种器皿的清洗和灭菌方法。

二、材料用具：

高压灭菌锅、烘箱、超净工作台、双筒解剖镜、酸度测定仪、空调机、控温仪、百分之一与万分之一天平、电炉、玻璃器皿（试管、三角瓶、移液管、漏斗、烧杯、容量瓶、试剂瓶、量筒酒精灯），以及镊子、解剖刀、解剖针、手术剪，肥皂、洗衣粉、重铬酸钾、浓硫酸等。三、说明：

在进行各类具体的组培实验前，首先了解组培室的结构及主要设备的用途和性能是十分必要的，总体上的了解有利于以后各实验的进行以及正确的使用各种仪器和设备。

植物组织培养是一项十分细致的工作，为了保证植物外植体不受污染，第一关就是要对各种器皿进行清洗和消毒，使它们保持无菌状态，

做这些工作同样有一套科学的方法和需要熟练的技巧，因此每个学生必须学好这套基本功。

四、方法和步骤：

首先在老师带领下参观组培室，并听取讲解，然后配制洗液，称取工业用重铬酸钾40克，溶解在500ml在水中，然后徐徐加入450ml 粗制浓硫酸（或废硫酸）配好的溶液呈红色，铬酸洗液是一种强氧化剂，去污能力强，但玻璃器皿上沾有油脂、凡士林、石蜡等则用此液无效，铬酸洗液可反复使用，直到溶液呈青褐色为止。此溶液腐蚀性强，洗涤时需注意。

每人清洗部分玻璃器皿，方法：清水洗净→泡入洗衣粉水溶液中进行洗刷→清水反复冲洗→蒸馏水淋一遍→烘干备用。

然后清洗部分较脏的玻璃器皿，方法：采用先碱后酸，即用洗衣粉洗刷后冲洗干净→晾干→侵入酪酸洗液，浸泡时间视器皿的肮脏程度而定→清水反复冲洗干净→蒸馏水淋洗一遍→烘干备用。

带有石蜡或胶布的器皿：先将其除去，再用常规洗涤，石蜡用水煮沸数次即可去掉，胶布粘着物则需用洗衣粉液煮沸数小时，再用水冲洗，凉干后浸入洗液，以后的步骤同前。

对器皿和用具进行高压灭菌，即用手提式高压灭菌锅，在1.1个大气压下保持15~20分钟。解剖刀、手术剪、解剖针、镊子等用具在接

种前还要用百分之七十的酒精棉球擦一下，再用酒精灯的火焰灭菌，冷却后即可应用。

五、作业：试阐述为什么要对器皿和用具进行严格的洗涤和灭菌？

实验二母液的制备及培养基的配制、灭菌

一、目的要求：

通过掌握培养基对母液制备及常用培养基的配制和灭菌方法，为植物组织培养准备合适的营养条件。

二、材料用具：

高压灭菌锅、冰箱、普通及精密天平、电炉、铝锅、玻璃器皿（烧杯、量微、容量瓶、移液管、试剂瓶、三角瓶、漏斗），化学试剂(CaCl2·2H2O，KNO3，MgSO4·7H2O，

NH4NO3，KH2PO4，Na2—EDTA，FeSO4·7H2O，MgSO4·4H2O，Zn SO4·7H2O，H3BO3，KI，NaMoO4·2H2O，CuSO4·5H2O，CoCl2·6H2O，甘氨酸，盐酸硫胺素，盐酸吡哆醇，烟酸，肌醇，蔗糖，琼脂，若干种生长调节物质及天然复合物，HCL,NaOH,酒精)，以及称量纸、药匙、玻璃棒、精密度纸，瓶盖用纸，线绳或橡皮筋、铅笔、标签纸。

三、说明：

植物材料培养要获得成功，并正常生长，培养基的组成成分是一个决定性因素，不同植物要求不同的培养基，因此，在进行大量工作之前，对不同培养基应进行分析、比较、试验，选择或发展出一个符合试验材料需要的适宜培养基。

大多数植物组织培养所用的培养基由无机营养物、碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物等。

四、方法和步骤：

（一）母液的制备

母液的配制是按所使用药品的类别，而分别配成大量元素、微量元素、维生素和铁盐等。配制母液时特别要注意无机盐成分在一起，可能产生的化学反应，如Ca2+和SO2-4,Ca2+,Mg2+和PO3-4一起溶解后，会产生硫酸钙或磷酸钙的不溶物沉淀，因此不能配在一起作母液贮存，应分别配制和保存。

配制母液时要用双重蒸馏水等纯度较高的水，药品应采用化学纯或分析纯级，药品的称量及定容都要准确，各种药品先以少量蒸馏水使其充分溶解，然后按培养基上的排列顺序混合。

现以Murashige和Skoog(1962)培养基为例叙述如下：根据各种药品的特点，母液可配成4种。

表1 MS培养基母液的配制

成分 规定用量/mg.L -1

储备液扩大倍数

称取量/ mg

母液定溶体积/ml

配1LMS 培养基吸取量/ml

母液Ⅰ 大量元素 KNO 3 1900 20 38000

1000

50

NH 4NO 3

1650

20 33000 MgSO 4·7H 2O 370

20 7400

KH 2PO 4

170

20 3400 CaCl 2·2H 2O 440

20

8800

母液Ⅱ 微量元素 MnSO 4·4H 2O 22.3 200 4460

1000

5

ZnSO 4·7H 2O 8.6 200 1720 H 3BO 3 6.2 200 1240 KI

0.83

200 166 Na 2MoO 4·2H 2O 0.25 200 50

母液Ⅲ 铁盐 Na 2-EDTA

37.3

200 7460 1000

5

FeSO 4·7H 2O 27.8

200

5560

母液Ⅳ 有机物质 甘氨酸 2.0 200 400

1000

5

盐酸硫胺素（Vit.B 1） 0.1

200

20

盐酸吡哆醇（Vit.B 6） 0.5

200

100

烟酸（Vit.B 3） 0.5

200

100

肌醇

100

200

20000

1 大量元素和微量元素母液的配制

按规定用量,称取所需的各种药品，在配制时为减少工作量，可以把几种药品（如大量元素或微量元素）配在同一母液中（见表1）.但由于各种药品的混合，可能发生反应，生成沉淀物，以致母液失效.为避免类似现象发生，在大量元素、微量元素和维生素及氨基酸的母液配制时，可采用如下2种做法加以解决：①将要配在同一母液的大量元素、微量元素和维生素及氨基酸等化合物，按“表1”所列药品的先后顺序溶解药品，待前一种药品完全溶解后再加入后一种化学药品，以此类推；②使每种成份分别完全溶解，再把它们彼此混合. 2 铁盐母液的配制