RNA甲基化修饰(3)——m6A调节果蝇性别分化和神经功能

m6A调节果蝇性别分化和神经功能| 案例解析

标题：m6A modulates neuronal functions and sex determination in Drosophila

m6A调节果蝇性别分化和神经功能

发表时间：2016年12月

发表期刊：Nature

IF：40.1

机构：德国美因茨大学

1、前言

RNA修饰在表观转录调控中十分重要，其中m6A修饰在许多哺乳动物中广泛存在。许多真核生物中都存在m6A修饰，包括人、小鼠、斑马鱼甚至酵母。许多研究表明大量的m6A修饰落在了RRACH motif（R, purine; H, non-guanine base）内，另外终止密码子和3’ UTR区域也有大量的m6A修饰。RNA甲基化修饰参与许多转录后调控，包括mRNA 前体剪切，mRNA降解和翻译，其中的“reader”酶YTH家族起到十分重要的作用。RNA 甲基化转移酶（methyltransferase）能够催化腺苷酸N6位发生甲基化，包括METTL3、METTL14、WTAP、Vir等。而去甲基化酶包括FTO和ALKBH5。

已知在小鼠胚胎干细胞中将METTL3敲除（knockout）后能够阻止其发生分化，MELLT3基因功能缺失对小鼠胚胎干细胞的发育具有致死做用。同样在果蝇中，METTL3的同源蛋白Ime4被敲除后也具有亚致死作用，由于NOTCH信号通路受损从而影响果蝇的生育能力。在模式植物拟南芥中，METTL3同源蛋白Ath-MTA被敲除后，其发育也会受到很大影响。另外，Ime4基因对酵母的减数分裂也有很重要的作用。种种迹象表明，m6A修饰对生物早期性器官发育以及早期的胚胎发育至关重要。近几年的结构生物学研究表明，

METTL3和METTL14会形成杂络物行使催化作用，但是生物体内的作用机制至今仍然未知。参与RNA甲基化的酶包括：

2.果蝇神经系统存在较高的m6A修饰

昆虫整个生命周期包括胚胎期、幼虫期（一龄幼虫→三龄幼虫）、蛹期以及成虫期。作者先检测了野生型果蝇各个时期的m6A整体的甲基化水平，使用质谱法对Ime4、dMettl14和fl(2)d三种蛋白相对表达水平做了一个热图。从热图中我们可以发现在胚胎早期尤其是2小时后m6A水平处于一个很高的水平，之后开始下降。在三龄幼虫期，m6A水平开始上升，在蛹期又达到了一个高峰后逐渐下降。果蝇成虫期的头部以及卵巢中m6A水平也一直维持相对较高水平。

系统进化树分析表明，果蝇的METTL3同源蛋白Ime4有两种密切相关的蛋白CG7818和CG14906。在果蝇的SR2+细胞（embryonic-derived Schneider）中敲低Ime4和CG7818后，m6A水平下降70%而敲低CG14906却没有任何影响。由于CG7818与METTL14结构上具有很大的保守性和相似性，作者将CG7818重新命名为dMettl14。同样fl(2)d和Vir基因与WTAP和KIAA1429高度同源，敲低后对果蝇的m6A水平也会产生较大的影响。

在哺乳动物尤其是人体内中，RNA甲基化转移酶METTL3和METTL14会形成杂络物，而WTAP和KIAA1429也是重要的组成部分。在果蝇甲基化转移酶中同时发现了Vir、fl(2)d 和Ime4。作者对果蝇的fl(2)d敲低后，Ime4和dMettl14的interaction显著降低。

基因定位实验表明参与m6A甲基化的酶都位于细胞核内且都在胚胎早期发育阶段处于

高表达水平。另外胚胎晚期，这些酶在神经外胚层也有较高的转录水平。

3.YT521-B介导m6A调控mRNA可变剪切

作者使用MeRIP-seq，从812个基因中鉴定了到了1120个m6A的peak。其中92%的peak都含有RRACH motif。此外，其他类型的序列或motifs也含有较高的m6A水平，这表明这些motifs可能也对甲基化转移酶具有特异性。

此外，与其他真核生物类似，在果蝇体内start codon和stop codon区域存在很高的m6A甲基化修饰。

接下来，作者针对SR2+细胞系中与m6A相关的各种酶敲低后进行了转录组测序，这些酶包括Ime4、CG6422、dMellt14、YT521-B以及Fl(2)d。从上图a中我们可以明显看

到，MA-plot显示不同敲低条件下，SR2+细胞系中的基因表达发生了显著的差异（p<0.05）。图b表示不同敲除条件下三个生物学重复基因表达的spearman相关系数表。图c则是剪切模式的spearman相关系数表。

其中作者发现Fl(2)d敲低后效果最为明显，超过2000个基因表达显著差异。敲低Ime4和dMettl14后，通过上面的韦恩图可以发现SR2+中差异表达基因数量小于Fl(2)d（milder effects）。

GO功能富集分析表明，这些差异表达的基因涉及各种功能如阴离子转运、细胞粘附等。尽管SR2+细胞系并不是直接起源于神经系统，但是许多差异基因都富集到了neuronal functions上，如axon guidance和synapse activity。

通过表达量盒形图发现，基因较低组的细胞中整体表达水平显著高于control组。接下来，对SR2+细胞系中的Ime4和dMettl14这2个基因进行双敲低（double knockdown）。韦恩图显示至少15%的基因都有m6A的peak。

Ime4和dMettl14双敲后，m6A甲基化水平仍然发生了轻微但是仍然显著的差异。这个结果表明每个转录本可能拥有独立的m6A peak位点。

文章还发现在基因剪切事件上，双敲的结果与2种酶单独敲的结果低还是存在显著差异的。在任意一种酶的敲低实验中，fl(2)d这个基因都行使十分重要的作用。通常情况下，不同酶敲低都会对基因5’的剪切以及内含子保留等行为产生影响，这种情况同样也存在于人细胞系中。

YTH家族蛋白是一种十分重要的reader酶。果蝇中，CG6422和YT521-B属于YTH 家族的同源蛋白。蛋白细胞定位实验表明CG6422位于细胞质中，受精后在胚胎期2小时达到最大值，接下来持续下降并且在幼虫期和蛹期一直维持较低的水平。然而，蛋白细胞定位实验表明YT521-B位于细胞核中，并且在胚胎的神经系统已经成虫的大脑中处于较高的转录水平。