现代药理学研究方法组作业

现代药理学研究方法作业

3110103759 药学1101班邵鑫

1、简述常用的检测凋亡的药理学研究方法？

（1）双重荧光素染色

细胞发生凋亡时,胞膜的通透性增加,但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间。根据这一特点,可采用荧光素染色、流式细胞仪检测来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。YOPRO-1(YP)是一种膜不通透型DNA交联荧光染料。在细胞凋亡的早期,当细胞膜通透性发生微小变化时,YP可进入细胞核而与DNA结合,产生绿色荧光。碘化丙啶(PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但能够透过凋亡中、晚期的细胞和死细胞的细胞膜而使细胞核染色。应用YP与PI联合染色可将细胞区分为正常细胞(YP-/PI-)、早期凋亡细胞(YP+/PI-)、中晚期凋亡细胞和坏死细胞(YP/PI)。

（2）DNA断裂

当细胞凋亡或坏死时,核内DNA均发生断裂,高分子量DNA减少,小分子量DNA片段增多并且出现在胞质内。但凋亡细胞DNA断裂点有规律地发生在核小体之间,出现长度为180~200bp的DNA片段,电泳时呈现阶梯状条带;而坏死细胞的DNA断裂点无规律性,产生的杂乱片段在电泳时呈现模糊的连续性条带。利用此特征可以确定群体细胞的凋亡,并可与坏死细胞相区别。

（3）原位末端检测技术

此技术是指将细胞(或组织)固定后,应用标记的脱氧尿苷三磷酸(dUTP)在原位检测DNA裂解点的技术。DNA片段原位末端检测技术又可分为两种:脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)和原位切口平移(,ISNT)技术。TUNEL法的作用原理是,在细胞凋亡时,染色质DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3c-OH端,在脱氧核糖核苷酸末端转移酶的作用下,将脱氧核糖核苷酸(多为dUTP)与荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3c-OH端,可通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。

（4）连接介导的PCR检测DNA梯形片段

当凋亡细胞数量少以及检测样品量小(如活体组织切片)时,无法直接应用琼脂糖电泳观察凋亡细胞核DNA的变化。Clontech公司的LM-PCRLadderAssayKit 借助特异性接头,通过LM-PCR专一性地扩增核小体的梯形片段,从而可提高凋亡检测的灵敏度。亦可采用LM-PCR对凋亡细胞进行半定量分析。

（5）膜联蛋白Ⅴ法

磷脂酰丝氨酸(PS)正常位于细胞膜的内侧,但在细胞凋亡的早期,PS可从细胞

膜的内侧翻转到细胞膜表面。膜联蛋白?(Annexin?)是一种相对分子质量为35~36ku的Ca依赖性磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力特异性结合。因此,应用膜联蛋白?法可鉴定早期细胞凋亡。将膜联蛋白?用荧光素(FITC,PE)或biotin标记,以标记膜联蛋白?的作为荧光探针,利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测凋亡的细胞。

（6）半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性检测

继线粒体$7m变化之后,线粒体膜通透性增强,外膜可容许蛋白质通过,而内膜通透性变化不大。这时,正常位于线粒体双层膜间隙中的可溶性蛋白质会释放至胞浆。因此SIMPs的检测可为细胞凋亡的发生提供佐证。其中,细胞色素C作为一种信号物质在细胞凋亡中发挥着重要的作用。正常情况下,它存在于线粒体内、外膜之间的腔隙中,凋亡信号的刺激使其从线粒体释放至细胞质与凋亡蛋白质激活因子1结合,形成细胞色素C/Apa-f1复合物,从而启动caspase级联反应。应用原位免疫荧光技术可检测细胞色素C和凋亡诱导因子,还可提供更精确的蛋白质的亚细胞定位信息。

(7)流式细胞术

流式细胞术是检测细胞凋亡的有力工具,具有检测的细胞数量大、可定量分析群体细胞的凋亡以及可同时进行其他相关分析的特点。DNA含量分析是流式细胞术检测细胞凋亡的常用方法。细胞凋亡时,细胞膜的通透性增加,使广泛断裂的DNA小片段不能完全封闭于细胞中,检测前对细胞的固定和洗、染处理更加剧细胞膜破裂,促进了DNA片断从细胞内逸出。因此,凋亡细胞DNA含量减少,与荧光染料的结合减少,故细胞DNA荧光强度降低,在DNA直方图上显示在G0/G1峰前出现凋亡细胞峰。一般在细胞固定后用任何一种能与DNA结合的染料染色均可,但一般常用PI,因为检测它的荧光波长是目前流式细胞仪所常备的。DNA含量测定对于检测细胞凋亡具有一定的局限性,其特异性不很高。主要由于亚G0/G1峰的细胞数目只代表了核碎片的数目,并不代表凋亡细胞的数目,非整倍体细胞、机械损伤的细胞亦可出现亚G0/G1峰。

4、根据SFDA新药报批要求，请设计用于评价阿尔兹海默病新药临床前药理学研究方案？

设计阿尔兹海默症的动物模型：

1）选择性胆碱能神经毒素所致的动物模型

向大鼠脑室注射特异性的胆碱毒1-乙基-1-(2-羟乙基)-氯化氮丙啶(ＡＦ64Ａ),大鼠会出现胆碱能系统和记忆功能损害。ＡＦ64Ａ,1-乙基-1-(2-羟乙基)-氯化

氮丙啶是一种胆碱能神经元特异性的突触前损伤神经毒素。其结构与胆碱相似,能选择性地作用于高亲和力胆碱转运(ＨＡＣｈＴ)系统,同时在其体内积聚部位产生毒素作用。评价:该模型可以模拟大脑皮层、海马等脑区胆碱能神经系统损害和记忆认知行为的改变,但不能形成Ａβ沉积、ＮＦＴｓ等组织病理学改变。2）以ｔａｕ蛋白过度磷酸化为特征的模型

通过ＡＬＺＥＴ微型渗透泵向大鼠侧脑室灌注ＯＡ(一种磷脂酸酶抑制剂),ＯＡ选择性抑制丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酯酶1Ａ和2Ａ,引起大鼠脑内出现类似老年性痴呆病理改变的双螺旋细丝(ＰＨＦ)样的磷酸化ｔａｕ蛋白和Ａβ淀粉样沉积斑块[15],能造成ＡＤ模型。评价:由于ＯＡ选择的抑制蛋白磷酸酯酶1Ａ和2Ａ的和提高ＰＫＣ的活性,并能同时表现出ＡＤ标志性的病理改变———老年斑和神经纤维缠结。该模型主要适用于:①研究ＡＤ发病的病理机制,Ａβ和ｔａｕ在ＡＤ病变中的相互作用;②验证现有ＡＤ治疗方法和药物的疗效。

3）快速老化小鼠(ＳＡＭ)模型竹田俊男通过对ＡＫＲ/Ｔ

自然变异小鼠进行交延代培养得到一种自然快速老化小鼠,该家族诸多品系中的ＳＡＭ-Ｐ/8可作为ＡＤ模型。ＳＡＭ-Ｐ/8在2月龄就出现学习记忆功能减退,并随着年龄的增加而加重,处于一种低紧张、低恐怖的痴呆状态。同时ＳＡＭ-Ｐ/8具备ＡＤ的多种特征,诸如皮质萎缩、皮质和海马锥体神经细胞数目下降、ＰＡＳ阳性颗粒和Ａβ样颗粒(β-ＣＩＧＳ)广泛沉着[13]。评价:该模型是一种比较理想的衰老模型,与自然衰老动物模型相比,其病理特征更加明显,可广泛用于增强学习记忆功能及促智药物的研究。

利用建立好的小鼠模型即采用磁共振影像学分析或者行为学实验来验证、评价新药临床前药理学研究。