单个核细胞分离.
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活细胞应在95%以上。
实验讨论
• 1. 注意事项①将稀释的血液加分层液上 时，一定要细心，动作要轻，使分离液 与血液的界面清楚，避免冲散分层液面 或与分层液混合影响分离结果。
• ②分离人和不同种类动物外周单个核血细胞要 使用不同比重的分层液，分离人血所用分层液 的比重以1.077±0.001为好；小鼠为1.088,而 马则为1.090。
Ficoll分层液
• 聚蔗糖-泛影葡胺:商品名为Ficoll ,其密度为 1.077±0.001。 主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一 种单次差速密度梯度离心的分离法。
其主要成分:2份浓度为6℅、密度为1.020 g/L聚蔗糖(商品名为Ficoll )与1份浓度为34℅、 密度为1.200 g/L泛影葡胺水溶液混合。
单个核细胞数／1毫升细胞悬液)＝
4个大方格内细胞总数 ───────── ×10 × 103×2(稀释倍数) 4
6.细胞活力检测
• 取2滴细胞悬液与1滴台盼蓝染液混匀，加盖玻 片，显微镜高倍镜观察。 细胞活力百分率=蓝色细胞数/100个单个细胞 数
结果判断
• 活细胞不着色，折光强，由于染料可渗入死亡 细胞被染成蓝色，体积略膨大。正常情况下，
• ③配制单个核细胞悬液所用的培养液要求等渗， 有缓冲作用，并Baidu Nhomakorabea细胞无毒性
方法评价
• 密度梯度离心法是一种分离单个核细胞的常用 方法，
• 用该方法不能除去其中的单核细胞。
临床意义
• 分离所得的单个核细胞可满足许多实验的需要， 可用于细胞的分类鉴定，及各种功能，也可用 于进一步纯化淋巴细胞，分离单个核细胞技术 是进行细胞免疫试验的重要技术之一。
单个核细胞的分离
实验目的
1．熟悉免疫细胞分离的常用方法。 2．掌握外周血单个核细胞分离方法的原理、 操作规程。
免疫系统
免疫器官 免疫细胞 免疫分子
外周血细胞成分
➢淋巴细胞 ➢单核细胞 ➢粒细胞 ➢红细胞和血小板
不同细胞密度不同
➢人的红细胞密度为1.093 ➢粒细胞密度为1.092 ➢单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为 1.075-1.090 ➢血小板：1.030~1.035
用1.077±0.001的分层液可将细胞分离
密度梯度离心(Ficoll)离心
试剂与器材
• 1 . 标 本 外 周 静 脉 血 加 EDTA-K2 抗 凝 ， 或 1000U/ml肝素抗凝血。
• 2.淋巴细胞分离液（聚蔗糖-泛影葡胺，比重 (1.077±0.001）有商品供应。
• 3.Hanks液 • 4.台盼蓝染液 • 5.器材 水平式离心机、显微镜、细胞计数板等。
• 3.用水平离心机以2000r/min离心20min，离心
后管内容物分为四层，上层为血浆（内含血小 板），中间层为分离液，底层为红细胞和多形 白细胞，在上、中层液体界面处可见到乳白色 浑浊的单个核细胞层
• 4.用毛细吸管轻轻插到白膜层，沿试管壁周缘 吸取该层单个核细胞，移入EP管，2000r /min 5min离心去血浆，
• 加 1mlHanks混匀，2000r/min离心5min，弃上
清液。
• 5.末次离心后，吸尽上清后，将细胞悬液体积 用Hanks还原至1ml，取一滴细胞悬液置血细 胞计数板内计数，计算单个核细胞的回收率。
×100%
单个核细胞回收率= 分离后细胞悬液ml×每毫升单个核细胞数 全血ml数×全血中每毫升单个核细胞数
操作方法
• 1.取静脉血放入抗凝管，摇匀，先作白细胞计数，然 后取1.5ml加入等量Hank液，混匀。
• 2.取1.5ml Ficoll分离液置于灭菌离心管内，用毛细吸 管将稀释血液3ml沿管壁徐徐加入离心管，使稀释血液 重叠于淋巴细胞分离液上（分层液与稀释血液体积比 例为1：2），二者之间有一明显的界面。
细胞分离基本原理
➢不同细胞密度不同 ➢不同细胞表面生物学特性不同 ➢不同细胞表面分化抗原不同
•人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）包括淋巴细胞和 单核细胞,是免疫学实验中常用的细胞群。
【实验原理】
人外周血单个核细胞的体积、形态和 比重与外周血其他细胞不同。因此利用一 种介于1.075～1.090之间而近于等渗的聚 蔗糖-泛影葡胺（ficoll-hypaque 比重 1.077±0.001 ）混合分离液作密度梯度离 心，离心后不同比重的血细胞在分离液中 呈梯度分布。从而分离出PBMC。
实验讨论
• 1. 注意事项①将稀释的血液加分层液上 时，一定要细心，动作要轻，使分离液 与血液的界面清楚，避免冲散分层液面 或与分层液混合影响分离结果。
• ②分离人和不同种类动物外周单个核血细胞要 使用不同比重的分层液，分离人血所用分层液 的比重以1.077±0.001为好；小鼠为1.088,而 马则为1.090。
Ficoll分层液
• 聚蔗糖-泛影葡胺:商品名为Ficoll ,其密度为 1.077±0.001。 主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一 种单次差速密度梯度离心的分离法。
其主要成分:2份浓度为6℅、密度为1.020 g/L聚蔗糖(商品名为Ficoll )与1份浓度为34℅、 密度为1.200 g/L泛影葡胺水溶液混合。
单个核细胞数／1毫升细胞悬液)＝
4个大方格内细胞总数 ───────── ×10 × 103×2(稀释倍数) 4
6.细胞活力检测
• 取2滴细胞悬液与1滴台盼蓝染液混匀，加盖玻 片，显微镜高倍镜观察。 细胞活力百分率=蓝色细胞数/100个单个细胞 数
结果判断
• 活细胞不着色，折光强，由于染料可渗入死亡 细胞被染成蓝色，体积略膨大。正常情况下，
• ③配制单个核细胞悬液所用的培养液要求等渗， 有缓冲作用，并Baidu Nhomakorabea细胞无毒性
方法评价
• 密度梯度离心法是一种分离单个核细胞的常用 方法，
• 用该方法不能除去其中的单核细胞。
临床意义
• 分离所得的单个核细胞可满足许多实验的需要， 可用于细胞的分类鉴定，及各种功能，也可用 于进一步纯化淋巴细胞，分离单个核细胞技术 是进行细胞免疫试验的重要技术之一。
单个核细胞的分离
实验目的
1．熟悉免疫细胞分离的常用方法。 2．掌握外周血单个核细胞分离方法的原理、 操作规程。
免疫系统
免疫器官 免疫细胞 免疫分子
外周血细胞成分
➢淋巴细胞 ➢单核细胞 ➢粒细胞 ➢红细胞和血小板
不同细胞密度不同
➢人的红细胞密度为1.093 ➢粒细胞密度为1.092 ➢单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为 1.075-1.090 ➢血小板：1.030~1.035
用1.077±0.001的分层液可将细胞分离
密度梯度离心(Ficoll)离心
试剂与器材
• 1 . 标 本 外 周 静 脉 血 加 EDTA-K2 抗 凝 ， 或 1000U/ml肝素抗凝血。
• 2.淋巴细胞分离液（聚蔗糖-泛影葡胺，比重 (1.077±0.001）有商品供应。
• 3.Hanks液 • 4.台盼蓝染液 • 5.器材 水平式离心机、显微镜、细胞计数板等。
• 3.用水平离心机以2000r/min离心20min，离心
后管内容物分为四层，上层为血浆（内含血小 板），中间层为分离液，底层为红细胞和多形 白细胞，在上、中层液体界面处可见到乳白色 浑浊的单个核细胞层
• 4.用毛细吸管轻轻插到白膜层，沿试管壁周缘 吸取该层单个核细胞，移入EP管，2000r /min 5min离心去血浆，
• 加 1mlHanks混匀，2000r/min离心5min，弃上
清液。
• 5.末次离心后，吸尽上清后，将细胞悬液体积 用Hanks还原至1ml，取一滴细胞悬液置血细 胞计数板内计数，计算单个核细胞的回收率。
×100%
单个核细胞回收率= 分离后细胞悬液ml×每毫升单个核细胞数 全血ml数×全血中每毫升单个核细胞数
操作方法
• 1.取静脉血放入抗凝管，摇匀，先作白细胞计数，然 后取1.5ml加入等量Hank液，混匀。
• 2.取1.5ml Ficoll分离液置于灭菌离心管内，用毛细吸 管将稀释血液3ml沿管壁徐徐加入离心管，使稀释血液 重叠于淋巴细胞分离液上（分层液与稀释血液体积比 例为1：2），二者之间有一明显的界面。
细胞分离基本原理
➢不同细胞密度不同 ➢不同细胞表面生物学特性不同 ➢不同细胞表面分化抗原不同
•人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）包括淋巴细胞和 单核细胞,是免疫学实验中常用的细胞群。
【实验原理】
人外周血单个核细胞的体积、形态和 比重与外周血其他细胞不同。因此利用一 种介于1.075～1.090之间而近于等渗的聚 蔗糖-泛影葡胺（ficoll-hypaque 比重 1.077±0.001 ）混合分离液作密度梯度离 心，离心后不同比重的血细胞在分离液中 呈梯度分布。从而分离出PBMC。