分子诊断技术ppt课件

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基因芯片技术原理
大规模集成的固相杂交
基本原理是核酸分子杂交，即依据DNA 双链碱基互补配对、变性和复性的原理
以大量已知序列的寡核苷酸、 cDNA或基因片段作探针，检测 样品中哪些核酸序列与其互补， 然后通过定性、定量分析得出待 测样品的基因序列及表达的信息
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基因芯片的作用原理
经扩增和纯化大量获得; 选择已知病毒的一段基因序列，用人工方
法合成寡核苷酸，其长度以20个左右最为 常用，过短易出现非特异性杂交。
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核酸分子杂交探针的制备
常见的用于标记探针的示踪物质
放射性核素如：32P，35S，3H，125I等，杂交 后可通过放射自显影技术进行检测
非放射性物质如：生物素、地高辛和酶等， 杂交后可通过底物显色、化学发光等技术 进行检测
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核酸分子杂交示意图 核酸分子杂交 的程序
来自百度文库
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常用的核酸分子杂交技术
斑点杂交（spot blot hybridization）
凝胶电泳印迹转移杂交（Southern blot hybridization)
原位杂交（in-situ hybridization）
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疾病的诊断与治疗
遗传病相关基因的定位 肿瘤诊断 感染性疾病的诊断 耐药菌株和药敏检测
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聚合酶链反应
(polymerase chain reaction
reaction；PCR)
PCR是八十年代中期问世的一种体外模拟体内 DNA复制过程的技术，可在短时间内将待测特 异性DNA扩增百万倍以上，并具有简单、快速、 特异的特点，成为分子生物学发展史的又一个 里程碑。
基因芯片
基因芯片（或DNA Chip,或
Microarray）又称DNA微阵 列，是指固定在固相载体上的 高密度DNA微点阵。即将大量 靶基因或寡核苷酸片段有序地， 高密度地（点与点间距一般小 于500μm）排列在玻璃、硅 等载体上，称之为基因芯片。
DNA Microarray
上图显示大量的DNA探针，按照一 定的规律有序地排列在支撑物上， 每个探针与相对应的特异互补序 列结合后，即可发出荧光。利用 该芯片可同时获取大量信息。
PCR不仅可检测各种DNA病毒的核酸，还可经过 逆转录，检测各种RNA病毒的核酸，因而在各 型肝炎病毒的检测中，敏感性远超过分子杂交， 有着不可替代的作用。
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PCR 的常见类型
常规PCR 逆转录PCR（RT－PCR） 巢式PCR〔nested-PCR〕 原位PCR（in-situ PCR） 多重PCR
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核酸分子杂交技术的应用
核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的 特异性，因而该技术在分子生物学领域中 已广泛地使用于克隆基因的筛选、酶切图 谱的制作、基因组中特定基因序列的定性 等
在医学上，目前已用于多种遗传性疾病的 基因诊断，恶性肿瘤的基因分析，传染病 病原体的检测等领域中 。
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在适当温度、盐浓度下，双链能按硷基互 补配对原则(A-T,C-G)复性而重新成为双链 核酸。
用已知序列的单链核酸，经标记制成核酸 探针，与变性后的待测标本核酸进行杂交， 通过检测标记探针的信号，可判断标本是 否存在与探针互补杂交的同源核酸。
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核酸分子杂交探针的制备
制备探针的靶核酸可通过: 分离、切割病毒的特定核酸片段获得; 用重组技术，将该片段克隆到细菌质粒，
引物延伸时，由于聚合 酶具有的5’→3’‘核酸外切 酶作用，可把荧光报告基 团从探针上切下，因与淬 灭基团远离，发出的荧光 不被淬灭，随模板扩增和 游离荧光报告基团的增加 而增强，并和初始靶核酸 的量呈正相关。
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TaqMan法应用
起始模板的定量 基因型分析 目的基因定量 产物鉴定 单核苷酸多态性（SNP）分析
TaqMan 水解探针。由产荧光基团，荧光淬 灭基团，与扩增子有互补的特异核苷酸序 列组成。
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实时荧光定量PCR：水解探针法
退火 延伸 切割 聚合完成
该法也称TaqMan技术， 在PCR系统中，加入能和 靶核酸模板杂交的探针， 其5’端带有荧光报告基团， 发射的荧光被3’端带有的 荧光淬灭基团所吸收。
分子诊断技术
常见的核酸分子诊断技术
核酸分子杂交
( Nucleic acid molecular Hybridization)
基因芯片（ Gene Chip ）
聚合酶链反应( polymerase chain reaction reaction；PCR)
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核酸分子杂交的原理
双链核酸加热或经硷处理变性后，可解链 成两条互补的单链核酸。
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斑点杂交
Dot Bolt Hybridization for HBV DNA Quantitationin 5 μl of Patient Sera
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凝胶电泳印迹转移杂交
原位杂交
(Southernblot hybridization) (in-situhybridization ）
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Think You
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基因芯片的 制作方式
原位合成
原位光蚀刻合成 光导原位合成法 原位喷印合成
直接点样
针式点样 喷墨点样 分子印章法
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基因芯片技术流程
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基因芯片的应用
基因表达分析
分析基因表达时空特征 基因差异表达检测 发现新基因 大规模DNA测序
基因型、基因突变和多态性分析
������ 非对称PCR ������ 免疫PCR ������ 定量PCR ������ 随机引物PCR ������ 简并引物PCR ������ 锚定PCR
������ …
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实时荧光定量PCR荧光检测技术
SYBR Green I。是一种结合于所有dsDNA双 螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。