现代分子生物学课件-第五章

图 5-6 λ 噬菌体可 以作为克隆载体
Ampr
1)限制酶切 2)DNA重组 无DNA插入
TcBaidu Nhomakorabea
有DNA插入
Ampr
Tcr
转化
Ampr
Tcs
外源DNA
Ampr Tcr
无菌落 筛选重组子 阳性菌落
Ampr Tcs
提取DNA 电泳
Ampr Tcs
重组DNA
5. 2. 3 聚合酶链反应技术（PCR） 首先将双链 DNA 分子加热分离成两条 单链， DNA 聚合酶以单链 DNA 为模板并 利用反应混合物中的四种 dNTP 合成新生 的DNA互补链。 因 为 DNA 聚 合 酶 需 要 有 一 小 段 双 链 DNA 来启动（“引导”）新链的合成， 所以，新生 DNA 链的起点由寡核苷酸引 物在模板 DNA 链两端的退火位点所决定。
1964
1965
1966
Nirenberg，Ochoa，Khorana，Crick等人破译了全部遗传密码。
1967
1970 1972-1973 1975-1977 1978 1980 1981 1982
第一次发现DNA连接酶
Smith，Wilcox 和Kelley分离了第一种限制性核酸内切酶，Temin和 Baltimore从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。 Boyer ， Berg 等人发展了 DNA 重组技术，于 72 年获得第一个重组 DNA分子，73年完成第一例细菌基因克隆。 Sanger 与 Maxam 和 Gilbert 等人发明了 DNA 序列测定技术， 1977 年 完成了全长5387bp的噬菌体φx174基因组测定。 首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。 美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以被专利化。 Palmiter和Brinster获得转基因小鼠，Spradling和Rubin得到转基因 果蝇。 美、英批准使用第一例基因工程药物 ——胰岛素，Sanger等人完成 了入噬菌体48,502bp全序列测定。
一种分子被放置到电场中，它就 会以一定的速度移向适当的电极。我 们把这种电泳分子在电场作用下的迁 移速度，叫做电泳的迁移率，它与电 场强度和电泳分子本身所携带的净电 荷数成正比，与片段大小成反比。
生理条件下，核酸分子中的磷酸基团 呈离子化状态，所以，DNA和RNA又被 称为多聚阴离子（polyanions），在电场 中向正电极的方向迁移。 由于糖 - 磷酸骨架在结构上的重复性 质，相同数量的双链DNA几乎具有等量 的净电荷，因此它们能以同样的速度向 正电极方向迁移。
转化是一个自然存在的过程。细菌处于容易吸收 外源DNA状态叫感受态，用理化方法诱导细胞进入感 受态的操作叫致敏过程。 重组DNA转化细菌的技术操作关键就是通过化学 方法，人工诱导细菌细胞进入一个敏感的感受态，以 便外源DNA进入细菌内。 这项技术始于Mandel和Higa 1970年的观察，他们 发现细菌经过冰冷的CaCl2溶液处理及短暂热休克后， 容易被 λ 噬菌体 DNA感染，随后 Cohn 于 1972 年进一 步证明质粒DNA用同样的方法也可进入细菌。
5 分子生物学研究法（上）
——DNA、RNA及蛋白质操作技术
从20世纪中叶开始，分子生物学 研究得到高速发展，除了基础理论的 重大突破，主要原因之一是研究方法， 特别是基因操作和基因工程技术的进 步。
基因操作主要包括DNA分子的 切割与连接、核酸分子杂交、凝胶 电泳、细胞转化、核酸序列分析以 及基因人工合成、定点突变和 PCR 扩增等，是分子生物学研究的核心 与基本技术。
转化原理：
将快速生长中的大肠杆菌置于经0℃预处理的低渗 氯化钙溶液中，使细胞膨胀，细胞膜通透性发生变 化，易与外源 DNA 相粘附并在细胞表面的复合物。
42℃下做短暂热刺激，复合物便会被细胞所吸 收。在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表 达，就可涂布于选择性培养基中分离转化子。
细菌转化及蓝白斑筛选：图5-5
由于在 PCR 反应中所选用的一对 引物，是按照与扩增区段两端序列 彼此互补的原则设计的，因此每一 条新生链的合成都是从引物的退火 结合位点开始并朝相反方向延伸的。
整个 PCR 反应的全过程，即 DNA 解链（变性）、引物与模板 DNA 相 结合（退火）、 DNA 合成（链的延 伸）三步，可以被不断重复。经多 次循环之后，反应混合物中所含有 的双链 DNA 分子数，即两条引物结 合位点之间的 DNA 区段的拷贝数， 理论上的最高值应是2n。
引物设计一般遵循下列原则：
(1)引物长度以15~30 bp为宜。 (2) 引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象， 引物G+C含量宜在45~55%左右。 (3)引物内部不应形成二级结构，两个引物之间尤其在3'末端不 应有互补链存在。
(4)引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性。要求在引物 设计时采用计算机进行辅助检索分析。
在凝胶电泳中，加入溴化乙锭 （ethidium bromide，EtBr）染料对核 酸分子进行染色，然后放置在紫外光 下观察，可灵敏而快捷地检测出凝胶 介质中 DNA 的谱带部位，即使每条 DNA 带中仅含有 0.05 g 的微量 DNA ， 也可以被清晰地检测出来。
溴化乙锭是一种具扁平分子的核酸染 料，能插入到 DNA 或 RNA 分子的相 邻碱基之间，并在300 nm波长的紫外 光照射下发出荧光。
(5)引物3‘末端碱基:原则上要求引物3’末端与模板 DNA一定要 配对。 (6)引物5'末端碱基:PCR反应物5'末端碱基并没有严格的限制， 只要与模板DNA结合的引物长度足够，其5'末端碱基可以不与 模板DNA匹配而呈游离状态。
琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为 0.2~50kb之间。 聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到 1000个碱基对之间。 凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的 大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨 能力就越强。
表5-2 琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分 辨DNA片段的能力
凝胶类型及浓度 0.3%琼脂糖 0.7%琼脂糖 1.4%琼脂糖 4.0%聚丙烯酰胺 10.0%聚丙烯酰胺 20.0%聚丙烯酰胺 分离DNA的大小范围（bp） 50 000~1 000 20 000~1 000 6 000~300 1 000~100 500~25 50~1
（2）DNA连接酶
图5-2 DNA连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体。 a. DNA的粘性末端; b. DNA的平末端; c. 化学合成的具有EcoRI 粘性末端的DNA片段。
（3）分子克隆的载体
仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和 DNA 连接酶进行DNA的切割和重组，还不能满足基 因工程的要求，只有将它们连接到具备自主复 制能力的DNA分子上，才能在寄主细胞中进行 繁殖。 具备自主复制能力的DNA分子就是分子克隆 的载体（ vector ）。病毒、噬菌体和质粒等小 分子量复制子都可以作为基因导入的载体。
基因工程是指在体外将核酸 分子插入病毒、质粒或其它载体 分子，构成遗传物质的新组合， 使之进入原先没有这类分子的寄 主细胞内并进行持续稳定的繁殖 和表达。
基因工程技术是核酸操作技术的一 部分，只不过它强调了外源核酸分子在 另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状 表达。 事实上，这种跨越物种屏障、把来 自其它生物的基因置于新的寄主生物细 胞之中的能力，是基因工程技术区别于 其它技术的根本特征。
图5-8 PCR指数扩增时循环次数与DNA产物数量的比较。
主要步骤：
将含有待扩增 DNA 样品的反应混合 物放置在高温（ >94℃）环境下加热 1分钟，使双链DNA变性，形成单链 模板DNA。
然后降低反应温度（约 50℃）， 致冷1分钟，使寡核苷酸引物与两条 单链模板DNA发生退火作用并结合 在靶DNA区段两端的互补序列位置 上。
图5-3 重组DNA操作过程示意图
目的基因的表达
5. 2 DNA基本操作技术
5. 2. 1 核酸凝胶电泳技术
自从琼脂糖（ agarose ）和聚丙烯酰胺 （ polyacrylamide ）凝胶被引入核酸研究以 来，按分子量大小分离 DNA 的凝胶电泳技 术，已经发展成为一种分析鉴定重组 DNA 分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验 手段。
表5-1 重组DNA技术史上的主要事件
年 份 1869 1957 19591960 1961 事 件
F Miescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离DNA。 A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。 Ochoa发现RNA聚合酶和信使RNA，并证明mRNA决 定了蛋白质分子中的氨基酸序列。 Nirenberg破译了第一个遗传密码； Jacob和Monod提 出了调节基因表达的操纵子模型。 Yanofsky 和 Brenner 等人证明，多肽链上的氨基酸序 列与该基因中的核苷酸序列存在着共线性关系。 Holley 完成了酵母丙氨酸 tRNA 的全序列测定；科学 家证明细菌的抗药性通常由“质粒”DNA所决定。
提供转化 DNA 的菌株叫作供体菌株， 接受转化 DNA 的细菌菌株则被称为受体 菌株。
转化(transformation) 特指以质粒DNA或以它为载体构建的重 组子导入细菌的过程。
转染 (transfection) 是指噬菌体、病毒或以它作为载体构成 的重组子导入细胞的过程。
转导 (transduction) 以噬菌体为媒介，将外源DNA导入细菌 的过程。 上述概念往往容易混淆。
图5-4 溴化乙锭染料的化学结构及其对DNA分子的插入作用。 由于插入了溴化乙锭分子，在紫外光照射下，琼脂糖凝胶 电泳中DNA的条带便呈现出橘黄色荧光，易于鉴定。
5.2.2 细菌转化与目标DNA分子的增殖
所谓细菌转化，是指一种细菌菌株 由于捕获了来自另一种细菌菌株的 DNA 而导致性状特征发生遗传改变的生命过 程。
2001
（1）限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶能够识别 DNA 上的特定 碱基序列并从这个位点切开DNA分子。 第一个核酸内切酶 Eco RI 是 Boyer 实验室在 1972 年发现的，它能特异性识别 GAATTC 序 列，将双链 DNA 分子在这个位点切开并产生
具有粘性末端或平端的小片段。
图5-1 几种主要DNA内切酶所识别的序列及 其酶切末端。
5. 1 重组DNA技术回顾
三大成就：
第一，在 20 世纪 40 年代确定了遗传信息的携 带者、即基因的分子载体是 DNA 而不是蛋白 质——解决了遗传的物质基础问题； 第二， 50 年代提出了 DNA 分子的双螺旋结构 模型和半保留复制机制 —— 解决了基因的自 我复制和世代交替问题；
第三， 50 年代末至 60 年代，相继提出了 “中心法则”和操纵子学说,成功地破译 了遗传密码 —— 阐明了遗传信息的流动 与表达机制。
1983
1984 1986 1988 1989 1992 1994 1996 1997 2000
获得第一例转基因植物。
斯坦福大学获得关于重组DNA的专利。 GMO首次在环境中释放。 Watson出任“人类基因组计划”首席科学家。 DuPont公司获得转肿瘤基因小鼠—“Oncomouse”。 欧共体35个实验室联合完成酵母第三染色体全序列测 定(315kb)。 第一批基因工程西红柿在美国上市。 完成了酵母基因组(1.25×107bp)全序列测定。 英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。 完成第一个高等植物拟南芥的全序列测定 （(1.15×108bp)。 完成第一个人类基因组全序列测定(2.7×109bp)。
最后，将反应混合物的温度上升到 72℃左右保温 1- 数分钟，在 DNA 聚 合酶的作用下，从引物的 3'- 端加入 脱氧核苷三磷酸，并沿着模板分子 按 5'→3' 方向延伸，合成新生 DNA 互 补链。
聚合酶链式反应示意图。（a） 起始材料，双链 DNA ；（ b ） 反应混合物加热后发生链分离， 降温使引物结合到待扩增靶 DNA 区段两端的退火位点上； （ c ） Taq 聚合酶以单链 DNA 为 模板在引物的引导下利用反应 混合物中的 dNTPs 合成互补的 新链 DNA ；（ d ）将反应混合 物再次加热，使旧链和新链分 开；（e）合成新的互补链DNA； （f）重复b；（g）重复 c、、、、、、