脂肪酶的微生物生产技术综述

脂肪酶的微生物生产技术综述
By 夏远川
脂肪酶是一种普遍存在于动植物和微生物体内的酶，也是最早研究的酶类之一，早在1834年就有关于兔胰腺脂肪酶活性的报道。

[1]
脂肪酶是一类特殊酯键水解酶，一般用于催化水解和合成反应，在油水界面上，它催化三酰甘油的酯键的水解，生成甘油一酯、甘油二酯或直接生成甘油和脂肪酸。

[2]脂肪酶还可催化酯类化合物的醇解、酯化、酯交换等反应，且不需要辅酶，在工业生产和研究工作中均有广泛应用。

[3]
脂肪酶按作用时的适应温度可分为高温脂肪酶、中温脂肪酶、低温脂肪酶；按适宜pH可分为碱性脂肪酶、中性脂肪酶、酸性脂肪酶。

脂肪酶的主要工业应用方向：
1、洗涤工业：在洗涤剂中添加脂肪酶可使洗涤剂对脂质类污渍的去除效果大大提高，并可减少表面活性剂及无机助剂（尤其是三聚磷酸钠）的用量，大大减少洗涤剂带来的环境污染。

用于洗涤剂的脂肪酶为碱性脂肪酶，在碱性范围内有活性、活性不受表面活性剂影响、对氧系漂白剂稳定、热稳定性好，并且由于大多数加酶洗涤剂都适当配有蛋白酶，因此用于洗涤剂的脂肪酶还应具抗蛋白酶降解的能力。

[4]
1988年，丹麦NOVO公司将碱性脂肪酶应用于洗涤剂中并推向市场。

1992年，这家公司构建了商业上第一株产脂肪酶菌株。

[1]
2、食品工业：油脂改性是食品加工过程中的一个重要环节，脂肪酶可通过催化酯交换、酯转移、水解等反应，改变油脂的的物理化学性质，使便宜的、营养价值低的油脂升级为昂贵的、营养价值高的油脂；此外脂肪酶还可用于合成广泛应用于食品工业的糖酯类产品、合成不带副产物或毒性物质的芳香味酯类化合物、合成抗坏血酸酯类抗氧化剂如异抗坏血酸等。

[5]
3、造纸工业：使用脂肪酶处理纸浆可减少胶黏物（绝大多数胶黏物都含有大量酯键）对造纸毛毯网间空隙的堵塞，提高纸机的运行效率和成纸品质，并降低环境污染，减少废水处理的负荷。

此外脂肪酶脱墨技术在废纸利用方面也起到非常大的作用，与传统脱墨技术相比脱墨效果更好环境污染更低，具有很大的优势。

[6]
4、皮革生产：脂肪酶应用于制革和毛皮加工过程中的脱脂，相对于传统的脱脂方法具有脱脂均匀、脱脂废液中的油脂更易分离回收、减少甚至不使用表面活性剂、降低生产成本、提高成品质量等诸多优点，将碱性脂肪酶与脱脂剂在碱性条件下进行毛革两用皮革的脱脂，可大大提高脱脂效果。

[7]
此外脂肪酶在饲料工业、生物表面活性剂、化妆品、生物传感、聚合物合成、手性化合物拆分、生物柴油等方面都具有重要的应用前景。

由于微生物生长繁殖快、所产脂肪酶种类多、微生物脂肪酶具有比动植物来源的脂肪酶更广的作用条件范围，且多为胞外酶，更适合于工业规模生产和获得高纯度产品，因此成为工业用脂肪酶的主要来源。

[7]上世纪初，微生物学家Eijjkmann发现了微生物脂肪酶并报道了一些能够产生和分泌脂肪酶的细菌，从此拉开了微生物脂肪酶研究的序幕，80年代后期至今，非水解酶学与界面酶学的理论研究及工业应用取得了突破性进展，极大促进了微生物脂肪酶的开发利用。

[1]
产脂肪酶的微生物在自然界中分布广泛，如植物油处理加工厂、工业废水、牛奶厂及被油污染的环境中均可以筛选到产脂肪酶的微生物，国内外研究较多的有根霉脂肪酶、曲霉脂肪酶、青霉脂肪酶、毛霉脂肪酶、地酶脂肪酶和细菌脂肪酶。

[8]在不同条件下进行菌种选育可得到适宜不同生产条件的脂肪酶的生产菌种。

一、菌种的分离筛选
（一）采样
应从富含油脂的环境中采取样品进行筛选，常见的有：
1、食堂餐厅和小餐馆排污处、户外烧烤摊、厨房、油脂化工厂排污池等
长期被油脂污染的土壤、油垢、污水。

2、小笼包蒸屉垫等经常接触油脂的家居用品。

3、产油作物如菜籽等。

4、如需筛选能生产在特殊条件下保持活性的脂肪酶的菌种，则需相应改
变取样范围。

例：付建红等人[9]在2009年公开的专利中，筛选低温条
件下保持活性的脂肪酶的生产菌时采取的样本为新疆高寒地区的含油
冻土样本。

（二）富集培养
用于筛选脂肪酶生产菌的富集培养基含有酯类物质，通常为橄榄油或聚乙烯醇橄榄油乳化液，根据所需脂肪酶的不同调节pH和培养温度。

刘瑞娟等人[10]在2009年发表的文章中，低温碱性脂肪酶产生菌筛选时使用了pH值为9.5的富集培养基。

[10]
（三）分离鉴定
初筛通常使用平板指示剂法，根据所使用指示剂不同有以下几种常用方法：
1、维多利亚蓝B指示剂染料法：
通过在含酯类的培养基中加入维多利亚蓝B来筛选脂肪酶产生菌，
能产生脂肪酶的菌落会在平板上形成蓝色增色圈。

[11]
2、三丁酸甘油酯琼脂平板透明圈法：
在培养基中添加三丁酸甘油酯乳化液，对待分离样本进行培养，根
据菌株是否生长及菌株透明圈的大小对菌株进行性质分类，圈大且清
晰的为优良的生产菌株。

[12]
3、罗丹明B平板测定法：
在含酯类的培养基中添加罗丹明B来筛选脂肪酶产生菌，产脂肪酶
的菌株会在平板上形成红色水解圈，在350nm的紫外光下，水解圈具
有橘黄色荧光。

[13]
4、溴甲酚紫显色培养基测定法：
在含酯类的培养基中添加溴甲酚紫，产脂肪酶的菌株会在平板上形
成黄色的水解圈。

[14]
复筛时除使用平板法外还可使用摇瓶法：
在发酵培养基中培养菌株，离心后测定脂肪酶活性，筛选出产脂肪酶能力更强的菌株，多次重复即可筛选出样本中产脂肪酶能力最强的菌株。

如王莎莉等人[15]在2016年使用添加有橄榄油和曲拉通的复筛/发酵培养基，
筛选得到单位酶活为2.14U/mL的高产脂肪酶菌株。

摇瓶法与平板法的不同在于其在测定菌株是否产脂肪酶的基础上测定了菌株产脂肪酶的能力，因此比平板法更适用于复筛阶段。

摇瓶法的核心在于测定酶活，常用的脂肪酶活性检测方法有碱滴定法、对硝基苯酚法和铜皂法[16]：
1、碱滴定法：
以橄榄油作为底物，酚酞作为指示剂，使用NaOH标准溶液进行滴
定，滴定时的空白对照组采用95%乙醇使脂肪酶样品失活。

此法脂肪酶酶活力单位定义为：在一定条件下，1min释放出1mol
脂肪酸的酶量定义为一个脂肪酶活力单位（U）。

碱滴定法稳定性较差，易产生误差，但耗时较短，可用于粗略的测
定。

2、对硝基苯酚法：
以对硝基苯酚棕榈酸酯作为底物，加入样品酶反应一定时间后以乙
醇或丙酮终止反应，在405nm测定吸光度并根据对硝基苯酚的吸光度
-浓度曲线计算生成的对硝基苯酚浓度，进而计算出酶活力。

此法脂肪酶酶活力单位定义为：在一定条件下，1min释放出1mol
对硝基苯酚的酶量定义为一个脂肪酶活力单位（U）。

江慧芳等人[16]在2007年发表的文章中将终止反应的乙醇或丙酮改
为三氯乙酸，使反应终止方法更有效，相对碱滴定法而言结果更稳定、
重复性更好，且比铜皂法用时更短，是进行大量脂肪酶活力的快速测
定的较好选择。

3、铜皂法：
铜皂法通过在脂肪酸中加入Cu+化合物作为显色剂，形成绿色络合物
后测定吸光度为原理。

通常采用橄榄油为底物，与样品酶反应后采用
苯或甲苯萃取生成的脂肪酸，加入显色剂后在710nm下测定吸光度，
并根据油酸标准溶液吸光度工作曲线计算生成的脂肪酸量，进而计算
出酶活力。

此法脂肪酶酶活力单位定义为：在一定条件下，1min释放出1mol
脂肪酸的酶量定义为一个脂肪酶活力单位（U）。

铜皂法结果稳定重复性好但用时较长，适用于脂肪酶活力的精确测
量。

以上三种常用的脂肪酶活测定方法中，碱滴定法属于滴定分析法，对氨基苯酚法和铜皂法属于光谱法；此外还有许多利用脂肪酶的水解特性来测定脂肪酶活性的方法[1]：色谱法、放射性、界面张力测量学、比浊法、电导分析法、免疫法、显微镜观察法等。

根据轻工业联合会提出的GB/T 23535-2009脂肪酶制剂国家标准中，测定脂肪酶（以淀粉质（或糖质）为原料，经微生物发酵、提纯制得的中性脂肪酶制剂）酶活的方法为碱滴定法。

[17]
二、菌种的改良
（一）自然选育：
不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程称为自然选育。

李扬等人[18]从小笼包蒸屉垫中筛选得到了两株脂肪酶高产菌株J2和J3，分别属于出芽短梗霉属的两个变体，以对硝基苯酚法测得J2和J33发酵上清液中的脂肪酶酶活分别为10.61U/mL和14.43U/mL。

（二）诱变育种：
诱变育种即利用人为添加的诱变剂处理微生物细胞以提高基因突变频率，再通过适当的筛选方法获得所需要的高产菌种的育种方法。

常用的诱变剂包括物理、化学和生物三大类。

1、物理诱变剂：
常用的物理诱变剂有：紫外线、快中子、X射线、β射线、γ射线、激光。

袁强等人[19]采用紫外诱变的方法对产脂肪酶的细菌菌株进行诱变和筛选，得到诱变株命名为U12，脂肪酶酶活（60.25U/mL）比原始相对出发菌株酶活提高220%，经五次传代实验平均酶活为58.63U/mL，相对诱变原菌降低2.69%。

周延等人[20]研究了从土壤中筛选的脂肪酶产生菌，利用紫外线、快中子、快中子和磁场复合、γ射线、γ射线和磁场复合进行诱变育种，得到一株酶活为396.22U/mL的诱变株，比出发菌株高92倍。

在后续研究中初步探讨了快中子、γ射线及磁场复合处理在脂肪酶产生菌中诱变的作用，认为三种方法中，在产脂肪酶的诱变中，快中子诱变更为有效。

郑敏等人[21]利用XeCl准分子紫外激光照射少根根霉孢囊孢子，筛选到8株脂肪酶活提高幅度10%以上的菌株，其中包括一株酶活较出发菌株提高55.1%的突变株。

2、化学诱变剂：
可用于产脂肪酶的菌种选育的化学诱变剂有硫酸二乙酯（DES）、LiCl、亚硝基胍、盐酸羟胺等。

化学诱变剂一般不单独使用。

李忠英等人[22]以紫外线（UV）与硫酸二乙酯（DES）复合诱变处理，筛选出酶活为14.85U/mL的突变菌，比出发菌株提高48.2%。

苗长林等人[23]采用微博-亚硝基胍复合诱变法处理米黑根毛霉，筛选出一株酶活比出发菌提高105%的突变株。

3、生物诱变剂：常见的生物诱变剂有噬菌体和转座子，中文期刊中鲜少有此类方法对脂肪酶产生菌进行诱变育种的报道。

（三）杂交育种
杂交育种是将不同菌株的遗传物质进行交换重组，使不同菌株的优良性状集中在重组体中。

杂交法局限大，杂交率低，因此利用此法选育脂肪酶高产菌株的报道很少。

但有与基因工程相结合的同源高效表达技术的研究。

如华中科技大学硕士研究生郭道义[24]通过运用PCR方法从高产脂肪酶的洋葱假单胞菌G63克隆了脂肪酶基因及其伴侣基因，将其克隆岛广泛宿主质粒pBBR1Tp载体上，构建质粒pBBR-LipAB,通过三亲杂交，在辅助质粒pRK2013的帮助下，使该基因在原始菌株中高效表达，所构建的工程菌较原始菌株酶活提高3.6倍。

（四）原生质体融合
原生质体融合技术是将两个已经去细胞壁处理释放出原生质的细胞释放在高渗环境中，在助融剂或电场作用下使之发生细胞融合，实现遗传重组。

原生质体融合技术提供了充分利用遗传重组杂交的方法。

段学辉等[25]进行了假丝酵母和白地霉的原生质体融合研究，选育获得一株融
合株CG16，其表型遗传性状和发酵性能稳定，产酶活力好，固态发酵脂肪水解酶活达到82.22U/g干物质，比亲本假丝酵母和白地霉的产酶活力分别提高了32%和171%。

（五）低能离子注入技术
生物离子注入技术的基本原理是利用低能离子与生物体作用产生辐射损伤，从而诱导产生可遗传变异，因此也属于辐射生物技术。

但它与γ射线及宇宙射线育种等有一定的区别。

低能离子注入技术在诱变过程中，除离子束的能量对生物体具有作用外，离子本身最终会留在生物体内，对其变异产生影响。

低能离子注入技术具有生理损伤小，、突变谱广、突变频率高等优点，并具有一定的重复性和方向性。

[26]
冀颐之等人[27]将出发菌株（根霉）单孢子悬浮液涂于N+离子注入载体硅片上，无菌风吹干后将其装入低能加速器（离子注入机）靶室中进行注入诱变，该实验获得的高产脂肪酶突变株N103，在摇瓶发酵条件下，测得脂肪酶水解酶活为175U/mL，为出发菌株的165%，且有较好的遗传稳定性。

三、菌种保藏
四、培养基
（一）培养基的组成
1、定义：
培养基是应科研或生产的需要，由人工配制的，适合与不同微生物生长繁殖或积累代谢产物用的营养基质（混合养料）。

发酵培养基一般包括碳源、氮源、无机盐及微量元素、水和其他成分（如诱导剂等）。

2、科研用培养基的组成：
对于脂肪酶生产菌来说，科研用培养基有初筛及富集培养常用的各类平板培养基、复筛常用的摇瓶法使用的液体培养基。

科研用培养基一般采用由纯度较高的试剂如橄榄油、聚乙烯醇橄榄油乳化液、三丁酸甘油酯乳化液等配制的合成或半合成培养基。

3、工业用培养基：
工业上生产脂肪酶则多选用天然培养基。

（1）水
（2）碳源：
常见碳源包括油脂、葡萄糖、玉米粉、小麦粉等；速效碳源如葡萄糖、蔗糖等有利于细菌脂肪酶的形成，而缓效碳源如玉米粉和小麦粉等则有利于真菌脂肪酶的形成。

[28]
如付建红等人[9]在2009年公开的专利中，所筛选的低温碱性脂肪酶生产菌（白地霉G.candidum ch-3）在以可溶性淀粉为碳源时最有利于产酶，而以葡萄糖为碳源时，发酵产生较低的酶活。

程兴[1]在进行假单胞菌的产酶条件优化时则发现其最佳碳源为麦芽糖。

在脂肪酶的生产中，油脂不仅可作碳源，同时也起到诱导物的作用。

大多数微生物只有在诱导物存在时才能产生脂肪酶，诱导物包括甘油三酯、长链脂肪酸、脂肪酸酯等[28]。

例：付建红等人[9]在2009年公开的专利中，所筛选的低温碱性脂肪酶生产菌（白地霉G.candidum ch-3）在以不同油脂诱导情况下研究，发现豆油是其最好的诱导物，而猪油和菜籽油则
对该菌产酶有一定的抑制作用。

也有一些菌种既能产脂肪酶又能产油脂，曹茜（浙江大学）[29]在2016年发表的博士论文中在对一种能产油脂的脂肪酶生产菌的产酶条件研究中发现，在无诱导油的情况下该菌种仍具有一定的产脂肪酶能力。

（3）氮源：
常用氮源包括无机氮源如硫酸铵、尿素等，有机氮源如大豆粉、玉米浆等；一般认为复合氮源更有利于微生物生长及产酶，有机氮源比无机氮源要好，蛋白胨和酵母膏在细菌脂肪酶的生产中应用十分广泛。

[28] 例：王蕾[30]等人于2017年分离出的热泉菌Bacillus sp.BI-3在筛选最佳氮源时显示的结果为：以蛋白胨为氮源时，菌体的生长和脂肪酶的酶活都是最高，以草酸铵为氮源则很低。

（4）无机盐与微量元素：
无机盐作为微生物生命活动所不可缺少的物质，参与构成菌体成分；作为酶活性基因的组成部分或辅酶（基）；调节渗透压、pH值、氧化还原电位等生理生化因素；还可作为自养菌的能源物质。

不同离子对同种菌产酶的影响不同，同种离子对不同菌种产酶能力的影响也不同。

付建红等人[9]在2009年公开的专利中，所筛选的低温碱性脂肪酶生产菌（白地霉G.candidum ch-3）产脂肪酶受Fe2+、Cu2+、Mn2+促进，Zn2+、Na+、K+、Mg2+对该菌产酶有不同程度的抑制作用，而段盈伊等人[31]所筛选的脂肪酶高产菌产酶则受Ca2+、Mg2+促进，受Fe2+、Zn2+抑制。

（5）生长因子：
一类微生物生长不可缺少的微量有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等。

有机氮源是生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的B族维生素和其他一些生长因子，因此在实际生产过程中一般不需要额外添加生长因子，未见这方面的研究报道。

（6）产物促进剂：
产物促进剂指那些既非细胞生长所必需的营养物，又非前体，但加入后能提高产量的添加剂。

表面活性剂如Tween 80、Triton X-100、SDS、PEG等主要通过增加细胞通透性使脂肪酶易于分泌到胞外来促进产酶。

[28]但许多文献显示SDS对酶活性具有抑制作用。

这方面的例子有：DAI Da-zhang[32]等在2008年进行的研究中发现，所使用的脂肪酶生产菌P.expansum PED-03所产脂肪酶为胞外酶，适宜的表面活性剂能改变细胞膜透性，有助于打破细胞中酶合成的“反馈平衡”并促进脂肪酶分泌到胞外，因而能提高酶的产率。

研究中发现，Tween 80对产酶有较强促进作用（加入0.05%Tween 80，产酶能力提高55%，达850U.mL-1），而SDS则对产酶有较强抑制作用。

陈巍等[33]对黑曲霉产脂肪酶的研究中也显示SDS对该脂肪酶活有强烈的抑制作用。

一些有机溶剂能提高酶活性，如卢亚萍[34]在2010进行的研究中发现，所筛选的菌株产脂肪酶在常见的有机溶剂如甲醇、甘油、正己烷、正丁醇、甲苯和乙酸乙酯中都具有良好的稳定性，其中乙酯、正丁醇和正己烷能提高酶的活性。

（二）培养基的设计与优化
实验室选育的菌株要应用于工业生产就必须进行生物过程的优化，发酵培养
基的设计和优化是其中重要的一环。

1、培养基的设计
培养基的粗略设计可采取两种方式：一是模拟所培养菌的天然生活环境和生态条件，设计天然培养基；二是查阅、分析文献，调查前人工作资料，借鉴经验，完成培养基的初步设计。

2、培养基的优化
初步设计的培养基往往不能使菌株的生长繁殖和产酶能力达到最佳水平，因此还需要进行一系列优化改造，才能在实际应用中发挥较好的作用。

由于发酵过程往往受多种因素影响，因此培养基优化过程中除了使用传统的单因子法、正交设计法外，响应面法、均匀设计法、人工神经网络、模糊逻辑控制、专家系统、遗传算法、化学计量法、最陡爬坡试验等新方法也逐步得到推广利用，其中响应面法应用最广，一般可将脂肪酶产量提高1~10倍。

[28]
（1）单因子实验
单因子实验是在假设各因素间不存在相互影响的前提下，一次改变一个因素的水平而其他因素保持恒定，对各因素单独进行考察的实验方法。

单因子实验简单、容易，培养基组分的个体效应能从图表上直观明显地看出来，不需要做统计分析。

但这种方法忽略了组分间的交互作用也不能考察各因素的影响力主次关系，并且在考察的实验因素较多是，需要大量实验和较长的实验周期。

单因子实验很少单独应用，一般是为后续其他实验方法提供一个数据基础。

（2）正交实验设计
利用正交表安排多因素多水平试验与分析实验结果的方法，简称正交实验法。

虽然仍旧不能体现出各组分间的交互作用，但正交实验设计能减少试验次数并辨别出哪些因素是主要的，哪些是次要的，以及所考察因素的最适水平和指标在各因素不同水平时的变化规律。

PIackett-Burman设计法是一种两水平的试验设计方法，常用于从众多考察因素中快速有效地筛选出影响力最大的几个因素，这几个因素是后续响应面法所考察的因素，其他次要因素则通常选用单因素试验中得到的最佳水平。

PIackett-Burman设计一般使用统计软件来进行实验设计，如SAS软件、Design-Expert软件。

（3）响应面法
响应面分析方法以回归方法作为函数运算的工具，把各因素与实验结果（即响应值）的关系函数化，依此可对函数的面进行分析，研究因素与响应值之间，各因素间的相互关系，并进行优化。

以上三种方法是目前使用广泛的发酵条件优化方式，它们之间是循序渐进的关系。

下面以一个案例进行具体分析。

王莎莉等人[15]2016年发表于《食品与生物技术学报》的文章：《脂肪酶生产菌株的筛选及其发酵条件优化》中，研究者在培养条件优化上依次使用了：单因子实验、PIackett-Burman设计、最陡爬坡试验、中心复合试验、响应面方差分析。

单因子实验单独考察每一个因素对培养结果的影响，共考察了包括酵母膏用量、玉米油用量、PVA用量、培养温度在内的10个单因子并得出了各因素
的最佳水平。

单因素试验为后续主要影响因素优化过程中提供次要研究因素的用量数据。

然后研究者进行了PIackett-Burman设计试验（使用Design-Expert软件）从所发表文章的PB设计与结果图表来看研究者使用了8个实际因素（而不是单因素试验中的10个影响因素）、3个用以估计误差的虚构变量进行PIackett-Burman设计试验，得出了12个酶活数据，再对这些数据进行分析后得出影响力最大的3个因素是酵母膏、玉米油和初始pH。

后续最陡爬坡试验、中心复合试验、响应面方差分析都是为了探究酵母膏、玉米油和初始pH对培养结果的综合影响，其中最陡爬坡试验是将3个因素一起改变，这样会得到一个使酶活达到爬坡过程中最大值的组合，但由于每一次取值改变都是3个因素一起改变，因此还不能保证所得组合为最优的发酵条件。

在此基础上进行以最陡爬坡试验最大值作为各因素的中心点水平进行中
心复合试验，研究者使用Design-Expert软件设计得到一个CDD矩阵，并进行相应实验操作得到不同条件下的酶活。

然后进行响应面方差分析，得出二次回归方程，对回归方程进行响应面分析，对3个因素分别求导，即可得出最佳发酵条件组合。

这个研究所用优化的方法比较典型，先对单因素影响做分析，再考察重要因素的交互作用。

存有疑问的地方是PIackett-Burman设计过程中只考察了单因素试验10个因素中的8个，并且没有说明未考察的是哪两个因素。

除了这三个常用的优化方法外，近年来一些新的优化方法也在发展兴起。

（4）人工神经网络
人工神经网络是由众多的神经元经可调的连接权值连接而成。

具有大规模并行处理、分布式信息储存、良好的自组织自适应性，并具有很强的学习能力。

[35]人工神经网络作为一种非线性模型，预测能力大大优于多元线性回归模型，在生物领域尤其是生物信息学方面受到了越来越多的应用和重视。

[36]郝建华[37]等以海洋酵母Bohaisea-9145发酵生产脂肪酶为例，利用人工神经网络控制方法建立批式发酵模型，以该模型模拟的葡萄糖流加补料策略为方案，脂肪酶发酵活力比批式发酵提高了3.45倍。

（5）均匀设计法
均匀设计法是一种试验设计方法，旨在用最少的试验次数建立实验数据的回归模型，用回归模型来估计因素的主效应及交互效应。

与正交试验设计相比，均匀设计法不能用方差分析估计出主效应及交互效应，失去了整齐可比性，但在选点方面比正交设计有更大的灵活性，也就是说它更注重均匀性，可以选到偏差更小的点，此外在研究因素较多的情况下均匀设计的试验次数大大减少，能够极大降低试验成本。

[38]
均匀设计法通常不单独使用。

如唐春红等人[39]于2006年提出将均匀设计与正交实验设计联用的实验设计方法，该方法具有均匀设计适用于多因素水平和实验次数少的特点，回避了均匀设计只能用计算机分析软件才能对数据进行分析的不足，同时保留了正交实验设计应用面广，可对实验结果进行简单直观分析的特点，适用于生物医学工程学的研究；谭泗桥[40]等人于2015年提出的均匀设计结合支持向量回归优化微生物发酵培养基的方法。

林仙菊等人[41]于2017年使用单因素试验和均匀设计法对从海鳗肠道内容。