分子生物学--分子克隆技术
分子克隆技术讲解课件
pUC19
pUC18 和 pUC19
小、高拷贝数, 长2686 bp 只有多克隆位点(MCS)排列 方向不同pUC18/19 含有: (1) pMB1 复制子rep (来自 pBR322)，因缺失了rop 基因和在pMB1的 rep 复制子
单个位点突变而导致了高拷贝数; (2)编码 beta-内 酰胺酶的bla基因，赋予对氨苄青霉素的 抗性 (来自 pBR322)，这个基因上有两个点突变， 因而不同于pBR322的 bla基因; (3) lac 操作元的区域
pUC19图
pBluescript II系列
均为2961 bp 长，用于DNA 克隆、双脱 氧 DNA 测序、体外诱变和在简单体系中 体外转录。 pBluescript II SK 和 KS 这两 个载体只有lacZ基因中的多克隆位点的方 向不同。
pBluescript II载体上的重要位点
Lambda噬菌体唯一切点
Lambda噬菌体载体
cos质粒
是lambda噬菌体和质粒的杂种，其优点 是可以用来插入较大的DNA片段，再转 入细菌。
cos质粒 载体
一个典型的质粒克隆技术涉及5步
1) 用限制性内切酶消化 DNA 样品 2)用限制性内切酶消化 质粒DNA 3) 连接样品DNA和质粒DNA的消化产物
pUC系列质粒
是2.7Kb的双链DNA质粒，有一个复制起点，一 个氨苄青霉素抗性基因和一个多克隆位点，多 克隆位点处于表达LacZ基因产物-β-半乳糖苷 酶的氨基端片段，用pUC质粒转化LacZ基因有 突变的大肠杆菌株（M15）时，因为由质粒表 达的α－肽补充了大肠杆菌却失的α－肽，所 以恢复了分解半乳糖的能力。在加入IPTG和Xgal的培养基上，长出蓝色克隆。如果在多克隆 位点内插入外源DNA，由于它破坏了α－肽的 表达，因而在加入IPTG和X－gal的培养基，不 能长出蓝色克隆，这就是所谓的蓝白筛选。
分子生物学中的克隆策略
分子生物学中的克隆策略克隆技术是分子生物学中应用最广泛的一项技术，其在基因工程、治疗、疫苗和药物研发等领域都有着重要的应用。
具体来说，克隆技术主要是指在体外复制和扩增特定DNA序列的过程。
为了实现有价值的克隆，需要选择合适的克隆策略。
一、催化剂-下游PCR法PCR是分子生物学实验室中最常用的技术之一，其可以扩增DNA的片段。
但是，PCR方法具有一定的局限性，PCR扩增的DNA片段长度不宜过长，而且与RNA结合后再翻译会产生较大的误差。
考虑到此种情况，研究者便设计了催化剂-下游PCR法。
在这种克隆策略中，研究者首先在DNA末端加入适当的序列标记（例如，带有限制酶切位点的标记），并在PCR反应体系中添加在另一条DNA链上特异性结合的相应催化剂，通过PCR扩增特定长度的DNA片段。
此外，在克隆过程中应注意，催化剂不能过多，否则可能引发非特异性放大，导致产物不纯。
二、限制酶-连接PCR法限制酶-连接PCR法是一种基于限制酶嗣中的DNA连接技术的克隆策略。
此种策略中，研究者在目标DNA的两端加入相同的限制酶切割位点，然后使用相应的限制酶处理目标DNA和载体DNA，以及用T4 DNA连接酶连接。
通过连接后，将连接后的目标DNA插入到适当的载体上并导入所需的表达宿主，如大肠杆菌（E. coli）, 单细胞藻等。
这种方法的优点是适用于大片段DNA的克隆，具有比较高的克隆效率和精确度。
此外，使用脚印标记探测目标DNA和核心连接位的研究也具有极大的借鉴意义。
三、COLD-PCR技术肿瘤组织中富含突变，突变基因的测序需要进行高度敏感的检测。
在这种情况下，COLD-PCR技术可以带来巨大的帮助。
COLD-PCR技术基于常规PCR方法进行改进，该策略使用高选择性扩增，以扩大突变基因，减小野生型基因，以达到高灵敏度检测突变基因以及基因突变率的效果。
通过这种技术，可以分离出包含目标突变基因的DNA片段，随后再进行DNA测序，以更好地理解该突变基因的生物学特性和相关性。
分子生物学中的克隆技术应用
分子生物学中的克隆技术应用近年来，在分子生物学领域中，克隆技术已经成为了一项广泛应用的技术，其对于研究人类疾病、基因治疗、农业生产等方面有着非常重要的作用。
本文将介绍克隆技术的定义和种类，以及在分子生物学中克隆技术的应用。
一、克隆技术的定义和种类克隆技术是将一个个体的DNA片段或细胞复制成为一个完整的生物个体或DNA分子的技术，该技术可以追溯到20世纪初期的坎宁安博士实现了对一只青蛙的克隆。
目前，克隆技术主要可以分为三种：基因克隆、细胞克隆和生殖克隆。
基因克隆是指将一个特定的DNA片段复制多次，以供后续的研究或应用。
在分子生物学中，基因克隆通常使用PCR技术进行，PCR是一种可以快速而准确地扩增特定DNA片段的技术。
细胞克隆是利用细胞分裂的天然特性来获取一系列相同的细胞，这些细胞有着相同的基因组成。
细胞克隆可以应用在细胞培养、基因工程等领域中。
生殖克隆是指采用体细胞核移植、胚胎分裂或人工激素治疗等手段复制整个生物个体。
生殖克隆最广泛的应用是动物克隆，比如多利羊的克隆等。
二、分子生物学中克隆技术的应用1. 基因结构和功能研究克隆技术可以制备出人工DNA和RNA，随后进行基因转染、基因敲除、基因过表达等操作，以研究基因的结构和功能。
同时，利用克隆技术也能实现对具有相同或相似功能基因的互补作用的研究。
2. 基因工程基因工程是指通过克隆技术将外源基因转入宿主细胞中，从而制造出具有特定功能的蛋白质。
克隆技术作为基因工程的核心技术之一，已经被广泛应用于各种领域，比如抗癌药物的研制、疫苗的制备、发酵产品的制备等。
3. 基因组研究基因组研究是指对于一个物种的全部基因组进行扫描、分析，以解析出其中的基因、基因数量以及与人类疾病相关的基因等。
克隆技术可以制备出大量的基因库，并且能够筛选出与不同性状或疾病相关的基因，为基因组研究提供了非常重要的支持。
4. 基因治疗基因治疗是指在治疗过程中，结合基因工程技术进行基因的修饰和转送，达到治疗疾病的效果。
分子克隆法
分子克隆法
分子克隆法是一种分子生物学技术，用于在体外制备和复制DNA 分子，包括基因、DNA片段和整个染色体。
这种技术允许科学家复制和操纵DNA，以进行各种研究和应用，包括基因工程、药物开发和基因治疗。
下面是分子克隆法的主要步骤：
1.DNA提取：首先，需要从源材料（通常是细胞或组织样本）中
提取DNA。
这可以通过细胞裂解和蛋白质分离等方法来完成。
2.DNA切割：提取的DNA通常是大片段，需要将其切割成较小
的片段，以便后续克隆。
这一步通常使用限制性内切酶来实现，
这些酶可以在特定DNA序列上切割。
3.DNA连接：切割后的DNA片段可以通过DNA连接酶与载体
DNA（如质粒或病毒DNA）连接在一起，形成重组DNA分子。
这个过程称为DNA重组。
4.DNA转化：重组DNA可以被引入宿主细胞中，这个过程称为
DNA转化。
这可以通过热激冷却法、电穿孔法、化学法等方法
来实现。
5.宿主细胞培养：转化后的细胞被培养，以允许它们繁殖并扩增
重组DNA。
6.筛选与识别：在宿主细胞中，可以筛选出携带重组DNA的细
胞，通常使用抗生素抗性标记或荧光标记等方法来进行筛选。
7.DNA提取与纯化：从筛选出的细胞中提取和纯化重组DNA，
以便进一步的研究或应用。
8.分析与验证：最后，分析和验证克隆的DNA，确保它是所需的
目标DNA，并不包含错误或突变。
分子克隆法有许多应用，包括基因表达、基因编辑、蛋白质生产、疾病研究等。
它在生物学研究和生物工程领域发挥着关键作用，允许科学家操纵和研究DNA，以深入了解生命的分子机制。
分子克隆主要步骤
分子克隆主要步骤分子克隆是一种常用的分子生物学技术，用于复制DNA分子。
下面是分子克隆的主要步骤：1.DNA提取：首先需要从一个已知的DNA源（例如细菌、动物组织等）中提取所需的DNA。
这可以通过使用不同的提取方法（如酚/氯仿提取、自动提取仪等）来实现。
2.限制性内切酶切割：将目标DNA切割成片段。
此步骤可以通过使用限制性内切酶来实现，这些酶可以识别特定的DNA序列，并在这些序列中切割DNA，形成切割产物。
3.DNA修饰：如果需要，在第2步切割的DNA片段末端添加修饰，以便后续步骤的操作。
例如，可以在DNA片段的末端添加磷酸基团（通过激酶酶和ATP）或羟基（通过糖转移酶和dTTP）。
4.连接DNA片段：将目标DNA片段与载体DNA（通常是质粒）连接起来。
这可以通过使用DNA连接酶，如DNA连接酶I或T4DNA连接酶，将DNA片段与载体DNA的末端连接。
5.转化：将连接好的DNA导入到宿主细胞中。
这可以通过转化（常见的转化宿主细胞包括大肠杆菌和酵母）来实现。
转化可以通过热冲击法、电转化或使用化学方法来进行。
6.筛选：在经过转化的细胞中筛选出带有目标DNA的细胞。
这可以通过将转化后的细胞接种到含有适当选择标记的培养基上来实现。
只有带有目标DNA的细胞才能生长并形成克隆。
7.复制：选取带有目标DNA的细胞进行培养，并使其进行大量复制。
这可以通过将细胞培养在含有适当培养基和条件的培养皿中来实现。
8.提取：从大量复制的细胞中提取含有目标DNA的质粒。
这可以通过使用质粒提取试剂盒来实现，其中包含了一系列的化学试剂和步骤，用于纯化和提取目标DNA。
9.鉴定：验证提取的DNA是否为目标DNA。
这可以通过进行限制性内切酶切割、PCR扩增或测序等方法来实现。
分子克隆是一种重要的实验技术，可用于构建重组DNA分子、研究基因功能、制备蛋白质等。
虽然上述步骤描述了分子克隆的基本过程，但具体操作可能会因实验目的和需求而略有不同。
分子克隆的实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在学习分子克隆技术的基本原理和操作步骤，掌握目的基因的扩增、克隆及表达，为后续相关研究奠定基础。
二、实验原理分子克隆技术是指将目的DNA片段从供体细胞中分离出来，通过体外重组、转化和转导等方法，将其插入到克隆载体中，再将其引入宿主细胞进行复制和扩增。
本实验采用无缝克隆技术，通过T5核酸外切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶三种酶的共同作用，实现单片段或多片段与载体连接。
三、实验材料1. 试剂：限制性内切酶、DNA连接酶、T5核酸外切酶、DNA聚合酶、dNTPs、Taq DNA聚合酶、PCR引物、载体DNA、目的基因DNA、质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶电泳试剂盒等。
2. 仪器：PCR仪、凝胶成像仪、电泳仪、紫外灯、超净工作台、离心机、恒温水浴锅、移液器等。
四、实验步骤1. 目的基因扩增（1）设计引物：根据目的基因的序列设计特异性引物，引物长度一般在18-25bp，5'端添加限制酶切位点。
（2）PCR反应：配制PCR反应体系，加入引物、模板DNA、dNTPs、Taq DNA聚合酶等，进行PCR反应。
2. 载体线性化（1）酶切：使用限制性内切酶对载体DNA进行酶切，获得线性化的载体。
（2）去磷酸化：对单酶切得到的线性化载体进行去磷酸化处理。
3. 目的基因与载体连接（1）同源臂连接：将目的基因PCR产物和线性化载体进行同源臂连接，确保目的基因正确插入载体。
（2）连接反应：配制连接反应体系，加入目的基因PCR产物、线性化载体、DNA连接酶等，进行连接反应。
4. 转化与筛选（1）转化：将连接产物转化至宿主细胞中。
（2）筛选：通过抗生素筛选、酶切鉴定和测序等方法筛选出含有目的基因的克隆。
5. 目的基因表达（1）重组质粒提取：从筛选出的阳性克隆中提取重组质粒。
（2）重组质粒转化：将重组质粒转化至表达宿主细胞中。
（3）表达产物检测：通过Western blot、ELISA等方法检测目的蛋白的表达水平。
分子生物学中的克隆技术
分子生物学中的克隆技术在现代生物技术中，克隆技术是一项卓越的成就。
分子生物学家们通过这项技术可以复制基因、细胞以及有机体，进而进一步研究遗传学、发育生物学等重要领域。
本文将基于分子生物学中克隆技术的原理和应用，介绍该技术的基本原理、分类以及常用的实验方法。
一. 克隆技术的基本原理克隆技术源于自然界。
在细胞分裂的过程中，某些细胞会通过有性或无性生殖方式，产生完全或几乎完全相同的后代细胞。
在人工实验中，分子生物学家主要采用三种不同的克隆技术：DNA 克隆、细胞克隆和有机体克隆。
在这三种技术中，DNA克隆是应用最广泛的一种。
在DNA克隆中，研究者首先将感兴趣的DNA分子中的特定区域选取下来，再将其"粘贴"(克隆)到另一段DNA分子中，使其从原来的组织中剥离出来并以一定形式表现出来。
这项技术主要由三个基本部分组成：DNA剪切、连接（融合）和转化。
其中，DNA剪切是相对简单的，即利用特定的酶将DNA分子剪成小片段；连接（融合）部分涉及到DNA酶及其他化学物质的作用，用于将不同源的DNA连接在一起以形成新的DNA分子；转化部分则包括将经过连接（融合）的DNA分子放入细胞中，以使其在细胞内进行复制，从而得到更多的DNA分子。
二. DNA克隆方式的分类DNA克隆可以分为两种类型：体外克隆和体内克隆。
在体外克隆中，DNA分子经过多次局部剪切、溶解，最终形成所需的DNA 分子。
这种方法常常会用到回收的一些DNA碎片作为材料。
而在体内克隆中，研究者首先将感兴趣的DNA分子注入到细胞中，然后将这些细胞放入细胞培养皿中，使其在生长的过程中不断产生新的细胞。
最终，在培养皿中的细胞中发现了所需的DNA分子。
三. 常用DNA克隆实验方法1.限制性内切酶和连接酶的使用限制性内切酶是分子生物学实验中极为重要的酶。
它可以将DNA分子按照特定的位置剪切成小片段，以便进一步的研究。
连接酶可以将两个被剪切过的DNA片段连接在一起，生成新的DNA分子。
分子克隆原理
分子克隆原理分子克隆是指利用DNA重组技术，将感兴趣的DNA片段插入到载体DNA中，然后将这些重组的DNA导入到宿主细胞中，使其在宿主细胞中复制和表达的过程。
分子克隆技术是生物学研究中的重要工具，它不仅可以用于基因的克隆和表达，还可以用于分析基因的结构和功能，研究蛋白质的结构和功能等。
分子克隆的原理主要包括DNA片段的获取、载体DNA的选择、DNA片段与载体的连接、重组DNA的导入宿主细胞等几个步骤。
首先，要获取感兴趣的DNA片段，可以通过PCR扩增、限制酶切割等方法进行。
PCR扩增是指利用DNA聚合酶酶和引物将目标DNA片段在体外进行大量复制，从而获得大量的目标DNA片段。
限制酶切割是指利用特异性的限制酶切割DNA，从而获得特定的DNA片段。
其次，选择合适的载体DNA。
常用的载体包括质粒、噬菌体、人工染色体等。
质粒是一种环状的DNA分子，可以在细菌中进行复制和表达。
噬菌体是一种侵染细菌的病毒，可以将外源DNA插入到其基因组中。
人工染色体是一种由人工合成的染色体，可以在宿主细胞中稳定复制和表达。
然后，将DNA片段与载体DNA连接。
这一步通常需要利用DNA 连接酶将DNA片段与载体DNA连接起来，形成重组DNA。
连接后的重组DNA可以通过转化、转染等方法导入到宿主细胞中。
最后，重组DNA在宿主细胞中进行复制和表达。
宿主细胞通常选择大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞等。
在宿主细胞中，重组DNA会进行复制，使得宿主细胞中含有大量的重组DNA。
重组DNA还可以通过转录和翻译过程进行表达，从而产生感兴趣的蛋白质。
总的来说，分子克隆原理是利用DNA重组技术将感兴趣的DNA 片段插入到载体DNA中，然后导入宿主细胞中进行复制和表达。
这一技术在基因工程、蛋白质表达、基因功能研究等领域有着广泛的应用，对于推动生物学研究和生物技术的发展起着重要的作用。
分子克隆组装实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习分子生物学中最基本的技术——分子克隆的操作过程。
2. 掌握基因克隆的概念，了解基因克隆的基本原理和方法。
3. 熟练掌握DNA提取、限制性内切酶切割、DNA连接、转化、筛选和鉴定等分子克隆实验操作。
4. 提高实验操作技能，培养严谨的科学态度。
二、实验原理分子克隆是指将目的基因（或DNA片段）与载体DNA连接，使其在宿主细胞中复制和表达的过程。
本实验采用分子克隆组装技术，将目的基因插入载体中，实现基因克隆。
三、实验材料1. 基因组DNA提取试剂盒2. 限制性内切酶3. DNA连接酶4. 载体DNA5. 目的基因片段6. 转化宿主细胞7. LB培养基、琼脂糖、氨苄青霉素等四、实验步骤1. 提取目的基因片段和载体DNA（1）取适量基因组DNA，按照试剂盒说明书进行提取。
（2）取适量载体DNA，按照试剂盒说明书进行提取。
2. 限制性内切酶切割（1）将目的基因片段和载体DNA分别用限制性内切酶进行切割。
（2）酶切反应体系：10×酶切缓冲液5μl，限制性内切酶1μl，DNA模板5μl，加双蒸水至50μl。
（3）酶切条件：37℃反应2小时。
3. DNA连接（1）将酶切后的目的基因片段和载体DNA进行连接。
（2）连接反应体系：10×连接缓冲液5μl，DNA连接酶1μl，酶切后的目的基因片段5μl，酶切后的载体DNA5μl，加双蒸水至50μl。
（3）连接条件：16℃反应4小时。
4. 转化宿主细胞（1）将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。
（2）转化条件：42℃热激45秒。
5. 筛选和鉴定（1）将转化后的细胞涂布于含有氨苄青霉素的LB培养基平板上，37℃培养过夜。
（2）挑取单克隆菌落，提取质粒DNA。
（3）对提取的质粒DNA进行PCR扩增，检测目的基因是否插入载体。
（4）对阳性克隆进行测序，验证插入序列的正确性。
五、实验结果1. 成功提取目的基因片段和载体DNA。
2. 目的基因片段和载体DNA经限制性内切酶切割后，酶切图谱与预期相符。
分子生物学领域的克隆技术
分子生物学领域的克隆技术随着分子生物学的发展，克隆技术成为了重要的分子生物学实验技术之一。
克隆技术可以复制出一份DNA分子的完整副本，并使其在实验室中大量复制。
通过这种方式，科学家可以利用这些重组DNA分子来研究生物体内的生物过程和基因功能。
一、对克隆技术的定义和原理的解析在分子生物学中，克隆技术被定义为一种在实验室中把某一DNA分子复制、重新组合的技术。
这个复制的过程就像通过一种特殊方式，把DNA分子中的一个特定的基因片段从中分离出来，再把它复制成一个新的独立的具有完整基因序列的DNA分子。
克隆技术的核心是DNA的重组。
在DNA重组技术中，将需要复制的DNA分子切成小片段，并将这些小片段粘贴到另一个矩形形的DNA分子上，创建一个新的重组DNA分子。
这个新的DNA分子是原始DNA分子的完整复制品（包括了一整个或多个基因），并且可以被用于进一步分析。
二、克隆技术的应用现在，克隆技术已经应用于各种生物学研究领域。
例如，研究酶系统，研究蛋白质组学，研究基因治疗等方面。
在这些领域，克隆技术提供了一种可以从不同的物种中获取相关DNA分子副本并导入到目标物种体内的有效手段。
通过这种方法，生物学家不仅能学习到这些分子的功能，而且还可以研究这些分子对该物种的影响。
三、克隆技术的优缺点尽管克隆技术在分子生物学实验中非常受欢迎，但仍有一些人对它感到担忧。
有关克隆技术的争议不仅涉及到动物实验、伦理道德等诸多方面，还与其自身的优劣有关。
在这里，我们将简单介绍克隆技术的优缺点。
1. 克隆技术的优点a. 意义重大。
克隆技术的主要优点是使研究人员能够获得大量基因信息并了解生物过程。
这种知识是治疗基因疾病、解决食品安全问题等当代社会问题的重要组成部分。
b. 准确的重组。
克隆技术可以在实验室中通过基因重组的方式准确地重现原始DNA分子的序列和结构。
这种准确性为开展分子生物学研究提供了可靠的基础，并为其他各种生物化学及生物学实验技术提供了丰富的材料。
分子生物学分子克隆技术
克隆示意图
克隆技术流程
分 切 连 转 筛
分
分离 来自生物组织 、扩增 设计引物,PCR扩增 mRNA-------DNA------扩增
引物设计与订购
酶切位点
双酶切、保护碱基、最合适的缓冲液,
引物订购
保护碱基
1.用限制性酶消化 DNA 样品
单酶切
双酶切
选择合适的双酶切缓冲液
提取正确的克隆菌中的质粒,转入表达型的菌株,如BL21等,诱导表 达蛋白
鉴定方法
鉴 定
PCR
原 位 杂 交
免疫学方法 鸡的β肌球蛋白的克隆和检出
蛋白质的纯化
谢谢
多利诞生的过程
为什么震惊和惊呼,我们先了解一下多利诞生的过程以及胚胎细胞克隆和 体细胞克隆的区别这两个基本问题,对我们学习后面内容或许有所帮助和 启发,
四、分子克隆的技术支撑
核酸凝胶电泳技术 核酸分子连接技术 细菌转化技术 DNA序列分析技术 寡核苷酸合成技术 基因定点突变技术 聚合酶链反应 PCR 技术 DNA序列测定技术
核酸凝胶电泳
细菌转化技术 包括感受态细胞制备
聚合酶链反应 PCR 技术
大规模生产生物活性物质
野生细胞
目的基因高效表达规律
1. 目的蛋白无须变形和复性就具有生物活性的表达方式 2. 对于翻译后需要修饰蛋白质结构,能够进行目的蛋白结构修饰的
表达方式 3. 能够将目的蛋白分泌到细胞（ZHOU）质、特别是分泌到细胞外
的分泌型表达方式 4. 降低不含目的基因细胞的比例,保持目的基因的稳定性,使目的基
因在宿主细胞内长时间超持和表达 5. 通过选择好的培养方法和能够进行高密度培养的细胞,提高细胞
1 真核基因组庞大而复杂,不易制得基因图谱,
分子克隆技术
Transformation
Culture in the medium containing antibiotic
E.Coli without vector die
E.Coli with vector grow
PCR
RT-PCR RTase
基因克隆需要一些工具酶。
Taq DNA Pol
Target DNA fragment
获取目的基因片段的几种方法：
（一）体外扩增法
1、DNA聚合酶链式反应（PCR）
2、逆转录-PCR（RT-PCR）NA的体外扩增 1、PCR
基本程序：
模板的变性 引物的退火 新链的延伸
如何利用PCR技术获得目的基因片段？
1、确定目的基因
G C T T A A A A T T C G
nick
Annealing
G A A T T C C T T A A G
nick
Sealed
T4 DNA ligase
Sealed
G A A T T C C T T A A G
T4 DNA连接酶连接单链切口：
应用T4 DNA连接酶时需注意的问题：
（1）低温操作。连接酶对温度非常敏感，很容 易失活。 （2）连接时，可根据厂家的建议选择最佳温度 和时间，一般16oC连接需要12-16小时。
CT……….. GA………. CC……….. GG………. GATCC…. G….
…..A …..TTCGA
…..G …..CTTAASticky endAGCTT…. A….
AATTC…. G….
有两种粘性末端：
1）5-端突出的粘性末端
5 ………GAATTC……… 3 3 …… CTTAAG……… 5
分子克隆技术及其应用
分子克隆技术及其应用分子克隆技术是指利用特定的分子生物学方法，在实验室中制备出与原细胞完全一致的生物体或物质的一种技术。
这种技术于1970年代被首次开发并应用，随着技术的不断完善，现今已广泛应用于基因工程、生物医药、农业等领域。
一、基本概念及原理分子克隆技术包括以下基本步骤：1.基因重组 2.转化 3.繁殖 4.筛选。
其中，基因重组指将被复制的DNA序列插入向量DNA中，形成重组质粒；转化是将重组质粒引入宿主细胞中，形成重组宿主细胞；繁殖是让重组宿主细胞自我复制，使其得到强大的繁殖能力；而筛选则是从繁殖出的重组宿主细胞中筛选出目的基因并放大。
具体而言，基因重组可以通过酶切、连接、转移等操作实现。
首先，将要克隆的DNA序列以及向量DNA进行酶切，用限制酶切分别切断它们的中间部分，得到“粘性末端”。
接着，将两者的“粘性末端”连接起来，形成插入向量，再将其转移到细胞中。
重组宿主细胞的选择一般依据所传递的向量类型选择合适的细胞系，如大肠杆菌、酵母等。
繁殖过程中，选定的细胞在合适的培养基中生长繁殖，细胞数目呈指数级增长，几天后细胞就可达到数百万个。
最后，通过特定的方法筛选出所需的克隆基因就完成了整个克隆过程。
二、分子克隆技术的应用分子克隆技术已成为现代生物技术的重要手段，被广泛应用于基因工程、生物医药、农业等领域。
1.基因工程分子克隆技术的应用最为广泛的领域，也是发展得最为成熟的领域之一。
利用分子克隆技术，科学家们可以构建基因工程菌株，来生产大量特定的蛋白质，如生长激素、乳糖酶等，以及进行人工基因的定点突变。
此外，还可利用分子克隆技术将外源基因植入植物、微生物等生物体中，来实现短期内大规模的基因导入，如通过基因工程技术开发新品种作物等。
2.生物医药分子克隆技术也为生物医药领域带来了新的变革和机遇。
利用它可以生产出各种高质量的同位素、抗体、药物、疫苗等生物标本，以及对病毒、细菌、疾病等进行精准治疗。
也可以用于研究基因的构造、调控和功能等信息，进一步提高人类对癌症、心脑血管疾病等重大疾病的认识和治疗水平。
分子克隆技术步骤
分子克隆技术步骤第一步：选取目标DNA在开始分子克隆之前，需要从一个生物体中选择一个含有所需DNA序列的样本。
这可以是任何生物体的DNA，例如人类、动物、植物或微生物。
第二步：DNA提取从所选生物体提取DNA。
这可以通过使用一系列化学和物理方法来完成，例如细胞裂解、蛋白酶处理、DNA沉淀和洗涤等。
第三步：选择一个合适的载体载体是一种DNA分子，可以容纳目标DNA序列并将其复制。
在分子克隆中最常使用的载体是质粒。
质粒是圆形的双链DNA分子，存在于许多细菌和酵母种类中，并被广泛用于分子生物学研究。
第四步：限制性内切酶切割将目标DNA和载体同时使用限制性内切酶（Restriction Enzymes）酶切。
限制性内切酶是一种可以识别和切割特定DNA序列的酶。
通过在目标DNA和载体的特定位置上切割，可以为将两者连接提供互补的末端。
第五步：DNA连接将目标DNA和载体连接在一起。
将目标DNA和载体的DNA片段混合，并在其末端形成互补碱基，然后使用DNA连接酶将两者连接在一起。
连接后的DNA分子被称为重组质粒。
第六步：转化将重组质粒引入细菌或酵母等微生物细胞中，这个过程称为转化。
这可以通过将细菌细胞暴露在低温高压胁迫下来实现，使得细胞膜变得更加渗透性，可以将质粒引入细胞内。
第七步：筛选和鉴定筛选出含有重组质粒的细菌或酵母细胞。
一种常用的筛选方法是将细菌培养在含有抗生素的培养基上，只有携带重组质粒的细菌才能在含有抗生素的环境下存活。
此外，还可以使用标记基因和特定染色剂等方法来鉴定重组质粒。
第八步：扩增和纯化用培养液扩增含有重组质粒的细菌或酵母细胞。
随着细菌或酵母细胞的生长，它们会复制重组质粒并将其传递给后代细胞。
然后使用一系列纯化步骤，如离心、洗涤和电泳等手段，将其中的重组质粒提取纯化。
总结：分子克隆技术的主要步骤包括选取目标DNA、DNA提取、选择合适的载体、限制性内切酶切割、DNA连接、转化、筛选和鉴定，以及扩增和纯化。
分子克隆技术
分子克隆技术实验操作手册课程简介分子克隆技术是指DNA的无性繁殖技术。
分子克隆技术课程主要是针对生物技术专业、生物科学专业、生命科学与技术基地班本科生及生物学类专业研究生而开设的实验课。
实验内容涉及分子克隆的一些基本方法及基本操作技巧，主要包括分子克隆和分子杂交两大部分：分子克隆技术：DNA重组技术是分子生物学的核心内容。
本实验利用质粒载体克隆外源DNA片段，通过这个实验大家可以掌握质粒载体的抽提、外源DNA的准备、酶切、连接及感受态细胞的制备、连接产物的转化以及阳性克隆子的鉴定和验证等。
分子杂交技术：实验室常用的分子杂交技术主要有Southern blotting，Northern blotting，Western blotting及Dot blotting等。
Southern blotting 是通过用一种或多种限制性内切酶消化基因组或其它来源的DNA，经过琼脂糖凝胶电泳按大小分离酶切所得的片段，随后DNA在原位发生变性并从凝胶转移到一固相支持物上（硝酸纤维素膜或尼龙膜）。
DNA转移至固相支持物的过程中各DNA的相对位置保持不变，用一定方法(如放射性同位素)标记的DNA探针与固着在膜上的DNA 杂交，经X-光片自显影显现出与探针DNA互补的DNA电泳条带的位置，然后进行分析。
本实验要求掌握植物总DNA的抽提、质量检测、限制性内切酶操作、DNA的琼脂糖凝胶电泳、转膜、探针的制备、同位素操作等方面的实验技术。
在转录水平上研究和了解基因的表达与调控是分子生物学和基因操作的重要内容。
为让学生初步了解有关RNA的操作过程注意事项，我们还列出Northern blotting的操作步骤以供选择。
目录系列一分子克隆技术 (4)实验一质粒的制备 (4)实验二DNA的琼脂糖凝胶电泳 (5)实验三外源DNA片段在质粒载体中的克隆 (7)实验四感受态细胞的制备 (9)CaCl2感受态细胞的制备实验步骤 (9)电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤 (10)实验五质粒的转化及转化子的鉴定 (11)热激法转化实验步骤： (11)质粒电转化大肠杆菌感受态细胞操作步骤 (12)实验六PCR技术 (12)系列二 Southern杂交技术 (14)实验一植物总DNA的快速少量抽提（CTAB法） (14)实验二总DNA质量检测及酶切 (15)实验三电泳、转膜 (16)实验四Southern Blotting (18)系列三 Northern Blotting (24)实验一RNA Extraction (mini prep) (24)实验二RT-PCR (Reverse transcription PCR) (26)实验三RNA的电泳，转膜和杂交 (28)附录试剂配方 (29)一细菌培养试剂 (30)二质粒抽提试剂 (30)三DNA操作试剂 (31)四RNA操作试剂 (34)Stock Solution: (34)Work Solution (35)系列一分子克隆技术实验一质粒的制备质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。
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GAATTC CTTAAG AGATCT TCTAGA
EcoRⅠ+ Bg lⅡ 双酶切
AATTC G A TCTAG
AATTC G GATCT A
Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切
+
AATTC G
A TCTAG
T4 DNA连接酶 15º C
GAATTC CTTAAG AGATCT TCTAGA
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5. 细菌在加有Amp+X-Gal的培养基上生长以进行筛选
连接会有三种结果，一是要插入的序列自连；二是切开的质粒重连 ；三是要插入的序列与质粒相连。第一种连接结果没有菌落形成。 第二种连接结果表现为蓝色菌落。只有后一种结果是符合需要的， 产生白色的抗氨苄青霉素菌落。
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灭 菌 器
克隆示意图
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克隆技术流程
分
切
连
转
筛
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分
分离（来自生物组织）、扩增（设计引物，PCR扩增）
mRNA-------DNA------扩增
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引物设计与订购
酶切位点
双酶切、保护碱基、最合适的缓冲液。
引物订购
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保护碱基
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1.用限制性酶消化 DNA 样品
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单酶切
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双酶切
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目的基因的高效分泌表达
概念：目的蛋白分泌到细胞周质和目的蛋白转运到细胞周质后再 分泌到细胞外 优点：① 防止宿主菌对表达产物的降解；②有利于蛋白质正确折 叠，形成天然构象③减轻宿主细胞代谢负荷④有利于分离 需要在质粒设计时加入一段信号肽基因
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基因克隆操作过程
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克 隆 示 意 图
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加IPTG和X-GAL
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倒平板
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α 互 补
利用α互补原理筛选重组体pUC18
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筛选结果
蓝菌落代表含有质粒的耐药菌，表达出由完好的α LacZ序列编码 的功能性的 α 片段。 白菌落代表含有质粒的耐氨苄青霉素菌，质粒上α LacZ序列上有 插入片段。
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乳糖和诱导物IPTG的化学结构
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表达型基因工程的载体----以PET32为例
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多克隆位点
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宿主
要考虑宿主菌对密码子的偏爱性 大肠杆菌不同密码子的偏爱性问题，将64组密码子分为强、中 、弱密码子
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目的产物
目的基因不溶性的高效表达 过程：目的基因编码的真核蛋白质与宿主基因编码的原核多肽或或其 它基因编码的具有其它功能的多肽和结合在一起，这种结合在一起的 形成的不溶性无活性的包涵体，又叫为融合蛋白。 举例：胰岛素与β-半乳糖苷酶形成包涵体 优点：避免细菌蛋白酶破坏，提高目的基因表达产物产量。 缺点：需要经过溶解和复性才能获得有活性的 适合：不需要翻译后修饰的蛋白质产物
为什么震惊和惊呼，我们先了解一下多利诞生的过程以及胚胎细胞克隆 和体细胞克隆的区别这两个基本问题，对我们学习后面内容或许有所帮 助和启发。 多利诞生的过程： 1.取出第一只成年母羊乳腺的普通细胞，分离基因备用。 2.取出第二只母羊未受精的卵细胞，取出基因换上第一只羊乳腺细胞 基因（“掉包”），放电激活该卵细胞，使之象正常受精卵一样进行细 胞分裂，直至一定阶段，胚胎成熟。
27
28
DNA聚合酶
Taq酶
用Taq酶扩增DNA时常使片段3‘端凸出一个A。
Pfu酶
产生平末端产物。
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连接酶
T4 DNA Ligase (invitrogen) 16°C过夜或者室温1-2个小时了连接即可。
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基因工程的载体---用于扩增
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克隆载体必备条件
（1）具有复制起点 （2）具有抗菌素抗性基因 （3）具有若干限制酶单一识别位点 （4）具有较小的相对分子质量和较高的拷贝数。
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外源DNA
载体多克隆 位点
限制性内切酶酶切
5’P 3‘OH 3‘OH 5’P
限制性内切酶酶切
5‘P 3‘OH 3‘OH 5’P
CIAP去除5‘磷酸
5’OH 3’OH 3’OH 5’OH
T4连接酶连接
转化E.Coli
筛选重组子，测序
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重 组 体 筛 选
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重组体
配伍末端的 连接情况和同一 限制酶切位点连 接相似。
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冷循环器
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4.用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞
转化细菌有两个基本方法。 一是 化学法，即用CaCl2 处理并加热激以促进DNA进入菌体； 二是电激法，即 施加短脉冲的电荷以促进DNA 吸收。
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用氯化钙化学转化
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用氯化钙化学转化
野生细胞 分离工程 分 离 工 程 酶 野生细胞 基因工程 蛋白质工程 途径工程 工程细胞
酶工程
发酵工程 细胞工程 生物活性物质
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用携带了外源基因的农杆菌Ti质粒转化植物原生
质体，发育成具有新性状的完整植株——转基因植物。
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基因工程的工具酶
“手术刀” “缝纫针”
专司切割之职 具有连接之功
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四、分子克隆的技术支撑
核酸凝胶电泳技术 核酸分子连接技术
细菌转化技术
DNA序列分析技术
寡核苷酸合成技术
基因定点突变技术 聚合酶链反应（PCR）技术 DNA序列测定技术
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核酸凝胶电泳
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细菌转化技术 （包括感受态细胞制备）
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聚合酶链反应（PCR）技术
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大规模生产生物活性物质
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选择合适的双酶切缓冲液
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2.用限 制性内 切酶消消化产物
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连接前最好要定量
连接比例摩尔比例为：
插入片度：质粒=10:1---5:1为佳。
质粒几十个ng为佳。
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双酶切
Eco RⅠ切割位点
GAATTC CTTAAG
Bg lⅡ切割位点
3.将成熟的胚胎移植到第三只母羊子宫中发育，妊娠（同正常一样） ，最后产下多利。
这样一只与第一只羊基因百分之百一样的复制品诞生了。
79
80
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目的基因高效表达规律
1. 2.
目的蛋白无须变形和复性就具有生物活性的表达方式 对于翻译后需要修饰蛋白质结构，能够进行目的蛋白结构修饰的 表达方式
3.
能够将目的蛋白分泌到细胞周质、特别是分泌到细胞外的分泌型 表达方式
内切酶 连接酶 聚合酶
“复印机”
行使复制之责
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内切酶
“手术刀” “缝纫针”
专司切割之职 具有连接之功
内切酶 连接酶 聚合酶
“复印机”
行使复制之责
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内切酶
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同裂酶(Isoschizomers）
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同尾酶
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星活性*
所谓星活性又称Star活性。是指由于反应条件不同而产生的切断 与原来认识序列不同的位点的现象，也就是说产生Star活性后， 不但可以切断特异性的识别位点，还可以切断非特异性的位点。 产生Star活性的结果是酶切条带增多。 Differences which can lead to star activity include low ionic strength, high pH, and high (> 5% v/v) glycerol concentrations. High Fidelity (HF) Restriction Enzymes can be used to reduce star activity.
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分子克隆技术
又称为重组DNA技术，是指将一种生物体（供体）的基因与载体在 体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人 们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序。 供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。
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重组DNA操作一般步骤：
（1）获得目的基因； （2）与克隆载体连接，形成新的重组 DNA分子； （3）用重组DNA分子转化受体细胞， 并能在受体细胞中复制和遗传； （4）对转化子筛选和鉴定； （5）对获得外源基因的细胞或生物体 通过培养，获得所需的遗传性状或
有一个“车子”将重组DNA送到宿主细胞中去。
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逆转录酶
使真核基因的制备成为可能。
（1）真核基因组庞大而复杂，不易制得基因图谱。 （ 2 ）即使有了基因图谱，因为真核基因有内含子，不能 在原核表达系统剪接出 mRNA ，没有成熟的 mRNA 就不 能得到相应得产物。 （3）经过逆转录mRNA→cDNA (comple就方便得多。
《基因工程》：张惠展，华东理工大学出版社，2005.
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分子克隆
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4
基因工程
基因工程是指在微观领域（分子水 平）中，根据分子生物学和遗传学 原理，设计并实施一项把一个生物 体中有用的目的 DNA(遗传信息)转 入另一个生物体中，使后者获得新 的需要的遗传性状或表达所需要的 产物，最终实现该技术的商业价值。
表达出所需要的产物。
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获得需要的目的基因（外源基因）
获得需要的目的基因常用的方法：
（目的基因； （2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段； （3）利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段，
降低不含目的基因细胞的比例，保持目的基因的稳定性，使目的 基因在宿主细胞内长时间超持和表达