第10章 酶的作用机制

胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶的底物 结合口袋决定了各自的专一性。

胰凝乳蛋白酶机制可以通过人工合成底物—— 简单的有机酯进行研究。

胰凝乳蛋白酶同乙酸－p－硝基苯酯反应的动 力学曲线

胰凝乳蛋白酶的机制分两个阶段： 第一步是乙酰复合体的形成，称为酰化作用。 第二步是乙酰复合体通过水解再生为游离的 酶，称为脱酰作用。
(五) 金属离子的催化作用
１.需要金属的酶分类：
（1）金属酶－metalloenzyme:含紧密结合的金属离子。 如Fe2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+、Mn2+ （2）金属-激活酶（metal-activated enzyme）:含 松散结合的金属离子，如Na+ K+ Mg2+ Ca2+
2.金属离子的催化作用：

（四）共价催化 （covalent catalysis）



催化剂通过与底物形成反应活性很高的共价过 渡产物，使反应活化能降低，从而提高反应速 度的过程，称为共价催化。 酶中参与共价催化的基团主要包括以下亲核基 团： His 的咪唑基，Cys 的硫基，Asp 的羧 基，Ser 的羟基等；亲电子基团：H+ 、Mg2+、 Mn2+ 、Fe3+ 某些辅酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也 可以参与共价催化作用。
咪唑催化对-硝基苯酚乙酸酯的水解反应
O CH3 C O NO2
CH3 C N + NH O + O
-
N
..
NH
NO2
O C O N
O
..
NH
NO2
+
N
+
O
-
NO2
NH
实验结果表明，分子内咪唑基参与的水解反应 速度比相应的分子间反应速度大 24 倍。说明 咪唑基与酯基的相对位臵对水解反应速度具有 很大的影响。
胰蛋白酶
胰凝乳蛋白酶 弹性蛋白酶
丝氨酸蛋白酶
凝血酶 枯草杆菌蛋白酶
纤溶酶
组织纤溶酶原激活剂

三种消化酶在胰腺中合成，以非活性的酶原形 式分泌到消化道中，在消化道中通过胰蛋白酶 水解除去部分肽链，转变成活性酶形式。

3个极性残基： His57、Asp102 和Ser195在活 性部位形成催 化三联体。
相对水解速率 0 1 8 4000 30000 60000
图像分析表明，(NAG)3仅仅占据了半个狭缝， 酶的最小底物应该是(NAG)6

第4个糖残基D 环因空间原因 必须由正常的 椅式变形为能 量较高的半椅 式构象。因此 糖苷键的稳定 性降低，键容 易从此断裂。

H218O溶液中酶促水解底物(NAG)6的实验证明酶切 位点在D糖基的C1和E残基的糖苷键的O之间。
第十章 酶的作用机制和 酶的调节
主要内容
酶的活性部位 影响酶催化效率的有关因素 酶催化反应机制的实例 酶活性的调节机制 同工酶

9.1、酶的活性部位
（一）基本概念：酶的活性中心是指结合底物和 将底物转化为产物的区域，通常是相隔很远的 氨基酸残基形成的三维实体。酶的活性中心包 括两个功能部位：结合部位和催化部位。 1．结合部位（ Binding site） 酶分子中与底物结合的部位或区域一般称为结 合部位。此部位决定酶的专一性。 2．催化部位（ catalytic site ） 酶分子中促使底物发生化学变化的部位称为催 化部位。此部位决定酶所催化反应的性质。


Glu35的-COOH提供一个H+到D与E之间的糖苷键O 原子上。糖苷键断开，形成正碳离子过渡态中 间产物。Asp52对中间产物有稳定作用。EF离 开酶分子。 正碳离子中间体与溶剂中的OH-反应， ABCD离 开。同时Glu35质子化。
（二）丝氨酸蛋白酶


丝氨酸蛋白酶家族的所有成员在其活性部位都 含有Ser残基，并且催化机制也相似。 具有消化作用的丝氨酸蛋白酶是胰蛋白酶、胰 凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶。 胰凝乳蛋白酶机制的动力学特征分酰化和脱酰 化两步。 Ser195的异常反应性与催化三联体有关。 丝氨酸蛋白酶的催化机制提供了一种典型的酸 碱催化和共价催化的例子。
（二）酶活性部位的特点
1.活性中心只占酶分子总体积的很小一部分，往 往只占整个酶分子体积的1%-2%。 2.酶的活性部位是一个三维实体，具有三维空间 结构。 3.酶的活性部位并不是和底物的形状正好互补的， 而是在酶和底物的结合过程中，底物分子或酶 分子、有时是两者的构象同时发生了一定的变 化后才互补的，此时催化基团的位臵正好处在 所催化底物键的断裂和即将生成键的适当位臵， 这个动态辨认过程称为诱导契合（inducedfit）.
蛋白激酶A是cAMP依赖性蛋白激酶。

磷酸化酶激酶通过磷酸化作用使无活性 的磷酸化酶b转化为有活性的磷酸化酶a。
（二）酶含量的调节


酶含量的调节是指通过改变细胞中酶蛋白合成 或降解的速度来调节酶分子的绝对含量，影响 其催化活性，从而调节代谢反应的速度。这是 机体内迟缓调节的重要方式。 酶蛋白合成的调节 酶蛋白降解的调节
4.酶的活性部位位于酶分子表面的一个裂 隙（crevice）内.裂隙内是一个相当疏 水的环境，从而有利于同底物的结合。 5.底物靠次级键较弱的力与酶结合。 6.酶的活性部位具有柔性和可运动性
（三）研究酶活性部位的主要方法
酶分子侧链基团的化学修饰法 1. 非特异性共价修饰 2. 特异性共价修饰（DFP） 3. 亲和标记（底物类似物，具有活泼的 化学基团） X- 射线晶体衍射法： 定点诱变法
共价调控


酶蛋白分子中的某些基团可以在其他酶的催化 下发生共价修饰，从而导致酶活性的改变，称 为共价修饰调节。 共价调节酶的两个主要特点： 1、通过可逆的共价修饰调节酶活性； 2、导致级联式放大反应。

共价修饰的主要方式是磷酸化和脱磷酸 化。
蛋白激酶 蛋白质 蛋白磷酸酶 蛋白质－npi

通过对现有酶分子结构的影响来改变酶 的催化活性。这是一种快速调节方式。
别构调控 酶原激活 共价调控

别构调控



酶分子的非催化部位与某些化合物非共价结合后发生 构象的改变，进而改变酶活性状态，称为酶的别构调 节（allosteric regulation）。 具有这种调节作用的酶称为别构酶（alloseric enzyme）。 凡能使酶分子发生别构作用的物质称为效应物 （effector）或别构剂。 因别构导致酶活性增加的物质称为正效应物 （positive effector）或别构激活剂，反之称为负效 应物（negative effector）或别构抑制剂。
意义：

在很小的浓度（底物、调节物）范围内严格控 制酶活力，因此是生物代谢中许多代谢途径的 关键酶。
V V 1负协同
1 2 3
V
2米氏 曲线
别构激 活 别构抑 制
3正协同
底物敏感 区
0
[S]
0
[S]

K型效应物和V型效应物
K型
V型
别构模型

齐变模型（WMC）
别构酶的所有亚基，或全部呈坚固紧密的，不利于结 合底物的“T”状态，或者全部是松散的，有利于结合 底物的"R"状态，这两种状态间的转变对于每个亚基都 是同时的，齐步发生的。"T"状态中亚基的排列是对称 的，变成"R"状态后亚基的排列仍然是对称的。
诱导契合模型与底物的形变
（三）酸碱催化（acid-base catalysis）
酸-碱催化可分为狭义的酸-碱催化和广 义的酸-碱催化。酶参与的酸-碱催化反 应一般都是广义的酸－碱催化方式。 广义酸－碱催化是指通过质子酸提供部 分质子,或是通过质子碱接受部分质子的 作用，达到降低反应活化能的过程。 酸-碱催化是催化有机反应的最普遍有效 的催化剂
轨道定向(orbital-steering)假说示意图
（二）底物的形变（distortion）

酶-底物复合物形成时，酶分子构象发生 变化，底物分子也常常受到酶的作用而 发生变化，甚至使底物分子发生扭曲变 形，从而使底物分子某些键的键能减弱， 产生键扭曲，有助于过度态的中间产物 形成,从而降低了反应的活化能。

溶菌酶是一种葡糖苷酶，能催化水解NAM的C1 和NAG的C4之间的糖苷键，但不能水解NAG C1 和NAM C4之间的β（1-4）糖苷键。
X射线晶体分析法揭示了溶菌酶的三维结构
活性部位？
(NAG)3是研究溶菌酶活性部位的良好竞争性抑制剂
底物 (NAG)2 (NAG)3 (NAG)4 (NAG)5 (NAG)6 (NAG-NAM)3
适于解释由底物调节的效应

序变模型（KNF）
酶分子中的亚基结合小分子物质（底物或调节物）后， 亚基构象逐个地依次变化，因此亚基有各种可能的构
象状态。
非底物调节的效应用序变模式说明较好。
酶原的激活


处于无活性状态的酶的前体物质就称为酶原。 酶原在一定条件下转化为有活性的酶的过程称 为酶原的激活。 酶原的激活过程通常伴有酶蛋白一级结构的改 变。酶原分子一级结构的改变导致了酶原分子 空间结构的改变，使催化活性中心得以形成， 故使其从无活性的酶原形式转变为有活性的酶。 举例：消化系统蛋白酶原的激活，凝血机制。

酶分子中可作为酸碱催化的功能基团
广义酸基团
（质子供体）
-COOH,
+ -NH 3,
广义碱基团 （质子受体）
-COO , -NH 2, -S ,
..
-SH,
+
OH
HN
NH
O
:N
NH
影响酸碱催化反应的因素包括酸碱强度 及质子传递的速率。 His咪唑基的解离常数约6.0，咪唑基解 离下来的质子浓度与水中的[H+]相近， 在中性条件下，一半以酸形式存在，一 半以碱形式存在;同时，咪唑基接受质子 和供出质子的速率十分迅速，半衰期小 于10-10秒。 所以，His是酶中最有效最活泼的一个催 化功能基团。

通过结合底物为反应定向。 通过可逆的改变金属离子的氧化态调节氧化还原反应。 通过静电稳定或屏蔽静电荷。
9.3、酶催化反应机制的实例
（一）溶菌酶 溶菌酶的生物学功能是催化某些细胞壁多糖的 水解。 X射线晶体结构分析法和竞争性抑制剂揭示了 酶的活性部位。 键张力导致与酶结合的底物特定位臵的糖苷键 稳定性降低。 溶菌酶催化机制是一个广义的酸碱催化，Glu35 和Asp52在催化过程中起了重要作用。

胰凝乳蛋 白酶中的 催化三联 体。

丝氨酸蛋 白酶的催 化机制
胰蛋白酶的催化机制
9.4、酶活性的调控机制
酶活性的调节可以通过改变其结构而使 其催化活性发生改变，也可以通过改变 其含量来改变其催化活性，还可以通过 以不同形式的酶在不同组织中的分布差 异来调节代谢活动。

（一）酶结构的调节


DFP的作用
二异丙基氟磷酸
9.2、影响酶催化效率的有关因素
（一）底物和酶的邻近效应（approximation）与定 向效应（orientation）


在酶促反应中，由于酶和底物分子之间的亲和性，底物分 子有向酶的活性中心靠近的趋势，最终结合到酶的活性中 心，使底物在酶活性中心的有效浓度大大增加的效应叫做 邻近效应。 定向效应：当专一性底物向酶活性中心靠近时，会诱导酶 分子构象发生改变，使酶活性中心的相关基团和底物的反 应基团正确定向排列，同时使反应基团之间的分子轨道以 正确方向严格定位，使酶促反应易于进行。以上两种效应 使酶具有高效率和专一性特点。


当别构酶的一个亚基与其配体（底物或别构剂） 结合后，能够通过改变相邻亚基的构象而使其 对配体的亲和力发生改变，这种效应就称为别 构酶的协同效应。 别构剂一般以反馈方式对代谢途径的起始关键 酶进行调节，常见的为负反馈调节。 E1 E2 E3 En
A
B
C
D
P
别构酶的基本性质


别构酶一般是寡聚酶，通过次级键由多亚基构 成。 因别构酶有协同效应，故其[S]对v的动力学曲 线不符合米氏方程。 效应物可分为K型和V型两种类型。 别构酶经加热或化学试剂处理，可引起别构酶 解离，失去调节活性，称为脱敏作用。
催化亚基
多亚基 调节亚基
正协同 协同效应
负协同
别构激活剂
别构抑制剂
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
别构酶的动力学

[S]对v的动力学曲线不是双曲线，而是S形曲 线（正协同）或表观双曲线（负协同），两者 均不符合米氏方程。
1负协同
V V
1
2米氏曲线
2 3
3正协同
0
[S]

饱和比值（Rs）可用来鉴别不同的协同作用以 及协同的程度。 典型的米氏类型的酶Rs=81 具有正协同效应的别构酶Rs<81， Rs 正 协同效应 具有负协同效应的别构酶Rs>81， Rs 负 协同效应