细菌裂解-蛋白质表达的关键性步骤说明
包括翻译在内的蛋白质表达的三个步骤
包括翻译在内的蛋白质表达的三个步骤蛋白质是生物体内基本的结构和功能分子，其表达过程包括翻译、转录和转运三个关键步骤。
这些步骤的顺序和协调性对于维持正常的细胞功能至关重要。
本文将对蛋白质表达的三个步骤进行详细介绍。
一、转录（Transcription）转录是蛋白质表达的第一个步骤，它将基因DNA中的信息转录成RNA分子。
转录过程发生在细胞核内。
具体而言，转录由RNA聚合酶（RNA polymerase）酶催化，使其与DNA产生特异性的结合，然后通过DNA的双链解开，在DNA模板链上合成与其互补的RNA分子。
这一过程遵循碱基配对原则，但在RNA分子中，腺嘌呤（A）与鸟嘌呤（G）通过尿嘧啶（U）取代胸腺嘧啶（T）。
因此，在转录过程中，RNA的合成是与DNA的反向互补的。
二、翻译（Translation）在细胞质中的核糖体（Ribosome）中进行的翻译过程是蛋白质表达的第二步。
在转录过程中合成的RNA分子被称为mRNA（messenger RNA，信使RNA）。
翻译过程中，mRNA作为模板，通过与tRNA （transfer RNA，转运RNA）分子中的氨酸配对，使氨酸按照特定的序列结合在一起形成多肽链。
这样，蛋白质的氨基酸序列便在翻译过程中确定下来。
这个过程需要依赖翻译因子（Translation factor）的帮助，它们能够担任酶活性或辅助配对的功能，使整个翻译过程高效进行。
三、转运（Post-translation）蛋白质的形成并未终止于翻译，部分蛋白质还需经历转运过程，进行必要的修饰和定位。
转运过程分为两种类型：共翻译转运和后翻译转运。
共翻译转运（Cotranslational translocation）发生在正在进行翻译的多肽链合成过程中。
在这个过程中，多肽链通过核糖体附着的内质网上的核孔蛋白复合体（signal recognition particle receptor complex）进入内质网（endoplasmic reticulum，ER）。
蛋白表达-破菌操作程序
蛋白表达-破菌操作程序操作程序1仪器及试剂试剂：LB培养基、1*PBS、IPTG、巯基乙醇（或DTT）、8M尿素、3*SDS上样缓冲液、12%分离胶、5%浓缩胶、10%过硫酸铵、TEMED、1*SDS-PAGE电泳缓冲液、乙醇、乙酸、考马斯亮蓝（R250）仪器：灭菌锅、无菌操作台、移液器、恒温摇床、分光光度计、高速离心机、超声波破菌机、电泳槽、电泳仪、脱色摇床、凝胶成像系统2诱导：2.1.取出灭菌的LB培养基（300ml）加入对应抗生素，取出2ml放入比色皿中，作为标准溶液。
2.2. 将上述已有表达的菌液加入LB培养基中，恒温摇床37摄氏度3-4小时测OD值，当OD值到达0.5-0.6之间时加入IPTG诱导（300μl）3-4小时。
2.3.将菌液倒入离心瓶中离心（3900转/min 10min）弃上清液。
2.4.需要过夜保存时将离心好的菌液放于-20度冰柜。
3破菌：3.1取50ml的1×PBS胞氧化）.3.2选择好合适的变幅杆，功率400W，破菌时间3S，间隔时间3S，共10min，超声破菌（菌液置于冰块中）。
离心（9000转/min）10min得到上清液①和沉淀，上清①装于50ml离心管中，暂时放4度保存。
沉淀中，吹匀沉淀，倒入50ml的烧杯中，功率400W，破菌时间3S，间隔时间3S，共5min 破菌（菌液置于冰块中），离心（9000转/min）10min 得到上清液②和包涵体，上清①装于50ml离心管中，暂时放4度保存。
3.4沉淀先用去离子水小心洗24个2ml的离心管中，离心（12000转/min ）2min的尿素，溶解、离心（12000转/min ）1min 上清移入到新的2ml 离心管中。
4 SDS-PAGE电泳确定蛋白表达位置及纯度：将得到的上清液①上清液②包涵体做10倍稀释和50倍稀释电泳，染色、脱色后确定蛋白表达的位置,上清则需要经过标签纯化，如不在上清，及时处理掉放于4度冰箱的上清。
蛋白质表达的基本原理解释蛋白质是如何通过转录和翻译过程表达出来的
蛋白质表达的基本原理解释蛋白质是如何通过转录和翻译过程表达出来的蛋白质是细胞内最重要的生物大分子之一，参与维持细胞结构和功能的正常运作。
它们广泛存在于所有生物体中，包括人类。
蛋白质的表达过程涉及到转录和翻译两个关键步骤。
本文将详细解释蛋白质表达的基本原理，介绍转录和翻译的过程，并展示它们之间的密切联系和协同作用。
一、转录的过程转录是蛋白质表达的第一步，其基本原理是将DNA中储存的遗传信息转换为RNA分子。
具体来说，转录过程包括DNA解旋、RNA合成和RNA剪接三个主要阶段。
首先，在转录开始时，DNA解旋酶作用于DNA双螺旋结构，分离出两个DNA链。
然后，RNA聚合酶结合到DNA的启动子区域，开始合成RNA链。
RNA聚合酶在DNA模板链上沿一个方向合成RNA分子，根据模板链上的碱基序列，合成了与DNA模板链互补的RNA链。
这个过程称为RNA合成。
RNA合成结束后，合成出的RNA分子会与DNA解旋的剩余部分分离。
然而，实际的mRNA（信使RNA）分子并非直接由RNA合成而来，而是在RNA后加工过程中经历了多个步骤的改造。
其中最重要的一步是RNA剪接，它将表达单位中的内含子（非编码区）剪除，并将外显子（编码区）连接在一起，形成完整的mRNA分子。
二、翻译的过程翻译是蛋白质表达的第二步，其基本原理是将mRNA分子中的信息转化为蛋白质序列。
翻译发生在细胞质内的核糖体中。
翻译过程涉及到mRNA分子与核糖体的结合、tRNA（转运RNA）的介入、氨基酸的连接和多肽链的形成。
首先，mRNA分子与核糖体亚单位结合，在核糖体的指导下，“读取”mRNA上的遗传密码。
核糖体将mRNA上的密码序列与适配的tRNA上的反密码序列进行配对。
每个tRNA带有一个特定的氨基酸，并通过其反密码序列与mRNA上的密码序列配对。
tRNA逐个将氨基酸接入正在形成的多肽链中，这个过程称为氨基酸连接。
当mRNA上的密码序列被完全“读取”并所有氨基酸都被连接在一起后，多肽链便完成了形成。
希望这些文章能帮助您更深入地了解蛋白质表达的各个方面如果您需要更多的信息或有其他问题随时提问
希望这些文章能帮助您更深入地了解蛋白质表达的各个方面如果您需要更多的信息或有其他问题随时提问希望这些文章能帮助您更深入地了解蛋白质表达的各个方面蛋白质是生物体内最基本的生物大分子之一，具有多种功能，如酶催化、结构支持和信号传导。
蛋白质的表达是指通过转录和翻译过程，将蛋白质的遗传信息转化为蛋白质分子的过程。
本文将介绍蛋白质表达的各个方面，并希望能为您深入了解这一过程提供帮助。
一、蛋白质表达的基本过程蛋白质表达的基本过程包括转录和翻译两个阶段。
在细胞核中，DNA通过转录过程被转录成RNA分子，然后RNA分子会被转运到细胞质中，通过翻译过程被转化为蛋白质分子。
这个过程是生物体合成蛋白质的基本机制。
二、转录的过程转录是指在细胞核中，DNA的遗传信息被转录成RNA分子的过程。
转录过程分为启动、延伸和终止三个阶段。
启动阶段，转录酶结合到DNA的启动子上，开始进行转录。
延伸阶段，转录酶沿着DNA链进行移动，合成RNA分子。
终止阶段，转录酶到达终止子区域，终止转录过程。
转录产生的RNA称为信使RNA（mRNA），它会被转运到细胞质中，参与翻译过程。
三、翻译的过程翻译是指RNA分子被转化为蛋白质分子的过程。
翻译过程包括启动、延伸和终止三个阶段。
启动阶段，mRNA结合到核糖体上，tRNA 带着氨基酸结合到mRNA上的起始密码子上，形成初始复合体。
延伸阶段，tRNA依次带着氨基酸进入核糖体，根据mRNA上的密码子顺序，合成多肽链。
终止阶段，当mRNA上出现终止密码子时，翻译过程结束，多肽链被释放出来，并形成蛋白质分子。
四、调控蛋白质表达的因素蛋白质表达是一个复杂的过程，受到多种调控因素的影响。
其中，转录水平的调控包括启动子的结构和转录因子的结合，可以调节基因的转录活性。
翻译水平的调控包括mRNA的稳定性、翻译起始复合体的组装等。
此外，还有后转录调控和后翻译调控等多种调控机制参与蛋白质表达的调控。
五、蛋白质表达的重要性和应用蛋白质表达在生物体内具有重要的功能，并且在许多领域具有广泛的应用。
简述蛋白质表达的主要操作流程
简述蛋白质表达的主要操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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蛋白表达的整个流程
蛋白表达的整个流程
蛋白质表达是生物学家和应用生物学家一直都在研究的重要课题，它
涉及识别、精确编码和连接基因组上的基因产物，并且可以转化为有
用的和使用的蛋白质。
蛋白质表达的整个流程是蛋白质系统研究中一
个复杂而重要的步骤，它可以非常有效地分析和发现基因之间的关系。
蛋白质表达的整个流程可以大致分为4个基本的步骤：转录、剪接、
转译和后修饰。
转录是从DNA到RNA的过程，这也是基因表达的开始。
可以从基因组
中找到蛋白质编码基因，然后根据已知的信息，将其转录成RNA片段。
剪接是一种对RNA进行修饰的步骤，它只在转录后发生，它能够从RNA 片段中切割出有用的蛋白质编码区域。
转译是从RNA到蛋白质的过程，它通过将RNA片段中的碱基对一一对
应转换成氨基酸来实现。
每个碱基三种代表一种氨基酸，有助于蛋白
质的组装。
后修饰是蛋白质最后一步，它是指在蛋白质表达过程中细胞内和细胞
外发生的一系列加工反应，这些加工反应有助于完善和活化蛋白质的
结构和功能。
蛋白质表达的整个流程是非常复杂的，但它也是蛋白质研究中不可或
缺的部分。
通过对蛋白质表达的整个流程的理解，我们可以更好地了
解和分析基因和蛋白质之间的关系，从而为蛋白质研究应用提供重要
的理论依据。
IPTG诱导蛋白表达的原理及方法步骤
IPTG诱导蛋白表达的原理及方法步骤E.coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。
I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。
在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白（CAP）结合位点。
由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。
在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态。
此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。
当有乳糖存在时，lac操纵子（元）即可被诱导。
在这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。
乳糖进入细胞，经b－半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。
后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。
异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。
材料1、诱导表达材料( 1 ) LB （Luria—Bertani）)培养基酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10gNaCl 10g 琼脂 (Agar) 1-2%蒸馏水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0适用范围：大肠杆菌( 2 ) IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，－20℃ 保存。
( 3 ) l× 凝胶电泳加样缓冲液：50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )50 mmol / L DTT2 % SDS （电泳级）0.1 ％溴酚蓝10 ％甘油2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料1 ）酶溶法（1）裂解缓冲液：50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )1 mmol / L EDTA100 mmol / LNaCI（2）50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF ）。
什么是蛋白质表达简单介绍蛋白质表达的基本概念和过程
什么是蛋白质表达简单介绍蛋白质表达的基本概念和过程蛋白质表达是生物学领域中重要的概念之一，它指的是蛋白质的合成过程。
蛋白质在细胞中扮演着多种重要角色，包括参与代谢过程、调节基因表达、构建细胞骨架等。
本文将对蛋白质表达的基本概念和过程进行简要介绍。
蛋白质是生物体内最基本的生物大分子之一，由氨基酸组成。
氨基酸通过肽键的形成连接在一起，形成多肽链。
多肽链经过折叠和修饰，最终形成具有生物活性的蛋白质。
蛋白质的合成是由基因组中的DNA信息转录成mRNA，并在细胞中被翻译成蛋白质的过程。
蛋白质表达的过程可以简要概括为三个步骤：转录、剪接和翻译。
第一步是转录，即将DNA中的信息转录成mRNA。
转录过程由RNA聚合酶酶催化，通过核苷酸与模板DNA链上的互补碱基配对，合成与DNA序列相对应的mRNA分子。
这个过程中，DNA的双螺旋结构被解开，RNA聚合酶在模板链上滑动，并合成与DNA模板链互补的mRNA链。
转录过程在细胞的细胞核中进行。
第二步是剪接，即将转录得到的前体mRNA分子修剪成成熟的mRNA。
转录得到的前体mRNA包含了被称为内含子的不具有编码信息的区域，以及具有编码信息的外显子区域。
剪接过程通过移除内含子，将外显子连接在一起，形成连续的编码序列。
这个过程由剪接酶和剪接信号序列的识别实现。
剪接使得同一个基因可以通过选择性的剪接产生多个不同的mRNA分子，从而扩大了蛋白质多样性。
最后一步是翻译，即将mRNA上的信息转化为氨基酸序列，合成蛋白质。
翻译过程发生在细胞质中，由核糖体酶复合物催化。
翻译的开始需要mRNA与小核仁RNA（rRNA）和特定的起始tRNA结合成翻译启动复合物，并选择正确的起始密码子。
随后，转移RNA（tRNA）依次将对应的氨基酸带入核糖体，通过互补碱基配对，将氨基酸连接成蛋白质链。
在翻译过程中，遇到终止密码子时，合成的蛋白质链会从核糖体上释放出来。
总结起来，蛋白质表达是一系列复杂的生物化学过程，包括转录、剪接和翻译。
蛋白质的表达、分离、纯化实验流程
蛋白质的表达、分离、纯化实验流程蛋白质表达、分离、纯化可以：（1）探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理；（2）供作结构与功能的研究；（3）作为催化剂、营养剂等。
实验步骤一：材料准备1. 实验材料：大肠杆菌BL21、LB 液体培养基、氨苄青霉素、Washing Buffer、Elution Buffer、IPTG、蒸馏水、胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠2. 实验仪器：摇床、离心机、层析柱、离心管、移液枪、枪头盒、烧杯、玻璃棒二：实验操作1.试剂准备：2.2. 获得目的基因①PCR 方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR 循环获得所需基因片段。
②通过RT-PCR 方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR 循环获得产物。
3. 构建重组表达载体①载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit 或冻融法回收载体大片段。
②PCR 产物双酶切后回收，在T4DNA 连接酶作用下连接入载体。
4. 获得含重组表达质粒的表达菌种①将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp 或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。
②测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作。
否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。
③以此重组质粒DNA 转化表达宿主菌的感受态细胞。
5. 氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导①接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21 菌株于 5 mL LB 液体培养基中（含100 ug/mL 氨苄青霉素），37 ℃震荡培养过夜。
②按1:50 或1:100 的比例稀释过夜菌，一般转接 1 mL 过夜培养物于100 mL（含100 ug/mL 氨苄青霉素）LB 液体培养基中，37 ℃震荡培养至OD600 = 0.6 - 0.8（最好0.6，大约需3 h）。
细菌的裂解
电泳时讲授10-20min
决定使用不同的方法
，煮沸法 大量提取质粒：二次扩增细菌，纯化方法要复杂 小量提取质粒：单克隆培养，普通碱裂解法 质粒纯度：要求高纯度、无内毒素等等 （满足各种转基因实验的要求） 要求不同的纯化方法
方法举例：
经典的方法：CsCl-溴化乙锭梯度密度离心
原理：不同结构和大小的DNA参入的溴化乙锭的量不一 样从而在CsCl梯度密度离心中处于不同的位置 特点：纯度最高（可获得 高质量的超螺旋质 缺口环状或 线状DNA 粒DNA）、最贵、 闭环质粒DNA 最麻烦 应用：大量制备质粒；基 因注射，基因转染 等对质粒质量要求 高的实验
常用方法：小量碱裂解法
（沉淀DNA）
（6）将上层水相移至另一离心管中，加入2.5倍体积 的无水乙醇， 置-20℃沉淀10－15 min。
上午实验结束
下午实验内容
１ 继续提取质粒： 获取及溶解沉淀的质粒DNA
2 质粒DNA电泳分析：
继续实验操作
（7） 12,000 转/分离心5min。 弃上清，室温干燥质粒DNA 5-10min。 （去除RNA） （8）用20l含RNase的水溶解质粒DNA， 轻轻吹打混合。 37 ℃保温10min
20 l质粒 DNA溶液
取出10 l放于另一个离心管中备用 剩余10 l用于下一步酶切
质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳
取10 l 的质粒DNA 加2 l 上样液混匀。 加到0.8%琼脂糖凝胶的加样孔内。 电泳条件：100V 40min。
电泳结束后照像保存，结果分析。
质粒提取方法
质粒的量
质粒的纯度要求 质粒的大小
碱裂解法提取质粒试剂：
1) 细胞悬浮液（溶液I）--悬浮菌体 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris.Hcl PH 8.0 10 mmol/L EDTA.Na2 PH 8.0 2) 细菌裂解液（溶液II） --裂解菌体 0.2mol/L NaOH 1% SDS
细菌的裂解
√去除蛋白质
*酚-氯仿抽提法
√去除RNA
*RNase消化
√去除基因组DNA
？？？
质粒DNA与基因组DNA的区别
1、部位不同： 2、大小不同：
质粒分子量较小，大小只 有普通细菌染色体DNA的百分 之一。 基因组DNA分子量较大， 细菌基因组约含3000个基因， 5106 bp。 基因组DNA容易断裂线性化
20 l质粒 DNA溶液
取出10 l放于另一个离心管中备用 剩余10 l用于下一步酶切
质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳
取10 l 的质粒DNA 加2 l 上样液混匀。 加到0.8%琼脂糖凝胶的加样孔内。 电泳条件：100V 40min。
电泳结束后照像保存，结果分析。
质粒提取方法
质粒的量
质粒的纯度要求 质粒的大小
特点：小量质粒制备、最简便、快捷 应用：质粒酶切鉴定、克隆（粗提） 测序、转染（细提）
质粒提取试剂盒
满足不同需要的试剂盒
纯化原理：离子交换柱层析等 小量制备质粒kit 大量制备质粒kit
去除内毒素制备质粒kit
可用于大部分分生实验
质粒的电泳
质粒DNA的存在形式有3种: 1、共价闭环DNA:常以超螺旋 形式存在 2、开环DNA:质粒DNA两条链 中有一条发生一处或多处断裂 ，因此可以自由旋转从而消除 张力,形成松弛的环状分子 3、线性DNA:因质粒DNA的两 条链在同一处断裂而造成.
碱裂解法提取质粒试剂：
1) 细胞悬浮液（溶液I）--悬浮菌体 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris.Hcl PH 8.0 10 mmol/L EDTA.Na2 PH 8.0 2) 细菌裂解液（溶液II） --裂解菌体 0.2mol/L NaOH 1% SDS
蛋白原核表达纯化原理
蛋白原核表达纯化原理蛋白原核表达纯化是一种常用的生物技术方法，用于大量制备目标蛋白质。
该方法可以在原核细胞中直接表达目标蛋白，然后通过一系列的纯化步骤获得高纯度的蛋白质样品。
以下将详细介绍蛋白原核表达纯化的原理和步骤。
蛋白原核表达纯化的原理主要基于细菌细胞的生物特性。
在表达过程中，目标蛋白的基因会被插入到表达载体中，该载体会被转化到细菌细胞中。
转化后的细菌细胞会利用其自身的代谢机制表达目标蛋白。
蛋白原核表达纯化的步骤主要包括以下几个方面：第一步，构建表达载体。
在这一步骤中，目标蛋白的基因会被插入到表达载体的多克隆位点中。
这个过程可以通过PCR扩增目标基因，然后将其连接到表达载体上。
第二步，转化细菌细胞。
在这一步骤中，经过构建的表达载体会被转化到细菌细胞中。
转化可以使用化学方法或电穿孔等物理方法进行。
第三步，培养表达菌株。
转化后的细菌细胞会被培养在含有适当抗生素的培养基中。
培养的条件包括温度、pH值、搅拌速度等，这些条件可以根据目标蛋白的特性进行优化。
第四步，诱导表达。
在菌株达到一定的生长密度后，可以通过添加适当的诱导剂来诱导目标蛋白的表达。
诱导剂的选择可以根据目标蛋白的特性进行优化。
第五步，收获细胞。
在表达过程中，细菌细胞会合成大量的目标蛋白。
可以通过离心等方法，将细菌细胞从培养基中收获下来。
第六步，裂解细胞。
收获的细菌细胞需要被裂解，以释放目标蛋白。
常用的方法包括超声波、高压等物理方法，以及酶解等化学方法。
第七步，纯化目标蛋白。
裂解后的混合物中含有大量的杂质，需要通过一系列的纯化步骤来获得高纯度的目标蛋白。
常用的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等。
经过以上步骤，蛋白原核表达纯化的过程就完成了。
这种方法可以高效地制备目标蛋白，并且可以根据需要进行优化。
蛋白原核表达纯化在生物医药、生物工程等领域有着广泛的应用前景，对于研究目标蛋白的结构和功能具有重要意义。
原核蛋白表达细胞裂解方法
原核蛋白表达细胞裂解方法原核蛋白表达细胞裂解是获取目标蛋白的重要步骤之一，以下是具体方法：一、试剂准备1.Triton X-100：1 % (w/v)，溶于异丙醇中；2.EDTA：0.5 mol/L，pH 8.0；3.100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；4.150 mmol/L NaCl；5.1 mmol/L PMSF；6.50 μg/mL溶菌酶。
二、细胞裂解1.将表达目标蛋白的细菌接种于适量的LB培养基中，37℃振荡培养至对数生长期；2.将细菌转移到离心管中，离心收集菌体；3.用预冷的PBS洗涤菌体2次，去除上清；4.重悬菌体于适量的细胞裂解缓冲液中，加入溶菌酶，使终浓度为50 μg/mL，37℃孵育1 h；5.加入Triton X-100，使终浓度为1 % (v/v)，轻柔混匀，冰浴30 min；6.4℃离心，转速为12000 g，离心15 min；7.取上清液，即为包涵体。
三、洗涤包涵体1.将上清液转移至新的离心管中，加入等体积的洗涤液(由2 % Triton X-100、20 mmol/L Tris-HCl、pH 8.0和250 mmol/L NaCl配制而成)，轻柔混匀，冰浴30 min；2.4℃离心，转速为12000 g，离心15 min；3.重复洗涤2-3次，直至洗涤液不再浑浊。
四、包涵体溶解与重折叠1.将洗涤后的包涵体悬浮于适量的溶解液(由2 mol/L尿素、50 mmol/L Tris-HCl、pH 8.0和1 mmol/L DTT配制而成)中，4℃孵育过夜；2.4℃离心，转速为12000 g，离心15 min；3.取上清液，即为溶解后的包涵体溶液。
重折叠操作是将溶解后的包涵体溶液进行透析，去除尿素，使蛋白质重新折叠成天然构象。
五、蛋白质纯化根据目标蛋白的性质选择合适的纯化方法进行进一步纯化。
常用的纯化方法包括离子交换色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱等。
在纯化的过程中，可以加入适量的还原剂(如DTE)和氧化剂(如H2O2)来维持蛋白质的稳定性。
细菌裂解
细菌细胞样品的裂解处理步骤1、细胞的破碎：1）将沉淀的细菌细胞悬浮在0.4mL的50mM Tris（用10%的HCl调节pH值到7.8-8.2）中, 剧烈振荡（V otex rigorously）充分混合，然后在冰浴中用超声波破碎仪（微型超声探头）破碎处理，重复两次，每次30秒。
此过程用于破碎细胞膜。
后加入1.6mL的裂解缓冲液储备液，充分混合。
若沉淀的细菌细胞量较大（总体积超过0.1mL）不易于悬浮在0.4mL的50mM Tris溶液中, 则将0.4mL的50mM Tris溶液(用10%的HCl调节pH值到7.8-8.2)与1.6mL的裂解缓冲液储备液预混合, 后用于悬浮细菌细胞沉淀物。
剧烈振荡后，与上述同样超声破碎处理。
上述所获最后细胞裂解液的组份是：6M的尿素、2M的硫脲、10%的甘油、50mM 的Tris、2%的n-辛基葡糖苷、5 mM TCEP和1mM蛋白酶抑制剂。
2）在4℃条件下以20000g的离心力冷冻离心60分钟（离心力务必达到或大于20000g）。
3）移取上清溶液。
若上清样品不立即使用，请储存于-80℃（最佳条件）或-20℃的无霜冰箱中。
2、用初始缓冲液（Start buffer）交换处理细胞裂解液1）在上述细胞裂解液中，加入初始缓冲液至最后体积为2.5mL，充分混合。
2）用约25mL初始缓冲液平衡PD-10柱（编号：17-0851-01）。
3）加入第1）步骤获得的2.5mL样品到PD-10柱, 丢弃洗脱液。
4）用初始缓冲液洗脱, 从PD-10柱中洗脱蛋白质, 收集前3.5mL部分。
5）所获得的3.5mL样品即可用于HPCF 1D柱的进样分离分析。
* 为检验所获得样品的优劣，可取50uL上述已经交换过的样品进样到HPRP 2D柱，观察所有蛋白的反相分离图谱。
在这一步,如果样品制备有一些问题,在分析该色谱图后将会鉴别出来。
注意:根据化合物和蛋白的量预测样品, 在这时应该得到一张“豪猪”状的色谱图(a very "spikey or porcupine" liking chromatogram)，使你分析的样品有意义,如果没有这样的蛋白图谱, 请停止进行色谱聚焦分离分析步骤，继续摸索样品制备的过程和步骤。
基于裂解系统的蛋白质表达方法
基于裂解系统的蛋白质表达方法一、引言在生物科学领域，为了研究和生产特定类型的蛋白质，蛋白质表达方法变得至关重要。
裂解系统是一种常用的蛋白质表达方法，它通过利用细胞内的蛋白质合成机器来产生蛋白质。
本文将介绍基于裂解系统的蛋白质表达方法，并讨论其主要步骤和优势。
二、基于裂解系统的蛋白质表达方法基于裂解系统的蛋白质表达方法主要包括DNA构建、转化、培养和裂解等步骤。
1. DNA构建首先，需要构建一个DNA载体，其中包含目标蛋白质的编码序列。
常用的载体包括质粒和噬菌体。
质粒是一种循环的DNA分子，可在细胞内自主复制。
噬菌体则是一种感染细菌的病毒，能够在细菌内进行蛋白质表达。
在构建DNA载体时，可以利用分子克隆技术将目标蛋白质的编码序列插入到载体中。
2. 转化构建好的DNA载体需要被转化到宿主细胞中。
常用的宿主细胞包括大肠杆菌（E. coli）和酵母等微生物。
转化过程通过改变细胞膜的渗透性和蛋白质导入机制，使得细胞能够吸收外源性DNA。
3. 培养转化后的宿主细胞需要在培养基中得到适当的条件下进行培养。
培养条件包括温度、pH值、氧气供应和培养基成分等。
通过优化这些条件，可以提高蛋白质表达的效率和产量。
4. 裂解当宿主细胞达到一定生长阶段时，需要进行裂解以释放表达的蛋白质。
裂解可通过多种方法实现，包括机械裂解、超声波裂解和酶裂解等。
机械裂解利用高压力将细胞破裂，使得蛋白质释放到裂解液中。
超声波裂解则利用超声波的振动作用来破坏细胞膜。
而酶裂解则利用特定的酶来降解细胞膜。
三、基于裂解系统的蛋白质表达方法的优势基于裂解系统的蛋白质表达方法具有以下几个优势：1. 高产量：裂解系统能够轻松地实现大规模的蛋白质表达，从而提高了蛋白质的产量。
这对于需要大量蛋白质的研究和生产是非常重要的。
2. 简单易行：相比其他蛋白质表达方法，基于裂解系统的方法操作简单、易于掌握。
只需进行一系列基本的实验步骤，就能够得到高效的蛋白质表达。
3. 成本低廉：基于裂解系统的蛋白质表达方法所需的设备和试剂相对简单且价格较低，从而降低了生产成本。
蛋白质的裂解优质课件
4. 嗜热菌蛋白酶
含金属旳酶，锌原子和钙原子，锌是活力所必需旳， 钙使酶在高温下稳定，该酶易被EDTA所克制。
专一性比上面三种酶都差，用来直接酶解蛋白质 不太合适，因为产生旳肽段相对较多，不但纯化起来 麻烦，而且对后来旳顺序重排也不利。如用它来裂解 次级肽，即先用专一性较强旳酶或化学试剂把蛋白质 多肽链降解成大肽段，再切成小肽段时，嗜热菌蛋白 酶可发挥很好旳作用。
(3) 颌下腺蛋白酶也有裂解精氨酸所形成旳肽键旳专一 性, 对磷脂酰胆碱互换蛋白只裂解Arg-Glu键，对 血纤维蛋白原只裂解Arg-Arg键。
Lys 蛋白酶
选择性一般不如Arg蛋白酶专一
1）密环菌（Armillaria mellea）是裂解赖氨酸氨端肽键,条 件是在赖氨酸残基旳羧端必须联有谷氨酸、天冬氨酸或天 冬酰胺残基。这个酶对精氨酸也具有活力，如在酶解天冬 氨酸氨转移酶时，发觉它在部分赖氨酸残基氨端裂解外， 还同步裂解三个Arg-Leu（Ile）键
分离纯化
7.密环菌蛋白酶裂解: 蛋白质 1.0mg 溶于0.5m1 0.1mol/l 1N - 甲基吗啉醋酸缓冲液 或 0.07％氨水 （pH8.1） 1 ug 酶 溶于5 ul 双蒸水 （酶:底物 = 1:1000） 37℃下搅拌反应 4-6h 冷冻干燥 50 ul 双蒸水溶解 分离纯化供测顺序用
1．原理 。溴化氰（CNBr）裂解法是多种化学法中最主要旳
也是最常见旳措施。 。由Gross和Witkop于1962年建立旳。后人进行了系统
研究, 能专一裂解蛋氨酸残基旳羧端，产率到达85% 。因为蛋白质中旳Met一般都比较少，所以裂解后旳肽
段较少，新生成旳肽段往往是大肽段，这么很适合于 自动顺序仪测定，更合用于固相法测定。与胰蛋白酶 裂解法配合起来，一般很轻易取得肽段旳排列顺序
蛋白表达步骤
1．培养基的配制原理步骤LB培养基，是微生物学实验中最常用的培养基，用于培养大肠杆菌等细菌，其分为液态或是加入琼脂制成的固态培养基。
加入抗生素的 LB 培养基可用于筛选以大肠杆菌为宿主的克隆。
尽管该培养基的名称被广泛解释为Luria-Bertani 培养基，然而根据其发明人贝尔塔尼(Giuseppe Bertani)的说法，这个名字来源于英语的lysogeny broth，即溶菌肉汤。
LB培养基的配制：成分胰蛋白胨(tryptone)10g酵母提取物(yeast extract)5g氯化钠(NaCl)10g固体培养基另加琼脂粉 15-20g加双蒸水至1000mL, 用5mol/L NaOH（约0.2ml）调pH至7.2，121℃灭菌30min配制方法（1）称量分别称取所需量的胰化蛋白胨、酵母提取物和NaCl，置于烧杯中。
（2）溶化加入所需水量2/3的蒸馏水于烧杯中，用玻棒搅拌，使药品全部溶化。
（3）调pH 用1mol/L NaOH溶液调pH至7.2。
（4）定容将溶液倒入量筒中，加水至所需体积。
（5）加琼脂加入所需量琼脂，加热融化，补足失水。
（6）分装、加塞、包扎。
（7）高压蒸汽灭菌100Pa灭菌20min。
2、大肠杆菌菌种活化原理菌种的活化就是将处于保藏状态的菌种放入合适的培养基中进行培养，逐级增大培养是为了得到纯而壮的培养物，可以理解为就是为了获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物进行培养。
菌种发酵一般情况下需要2-3代的复壮过程，因为保存时的条件往往和培养时的条件不相同，所以要活化,让菌种逐渐适应培养环境中药标准对照品研究中心建议实验要明白菌种活化的情况就首选需要了解菌种保藏的方式和方法。
目前国际和国内常用的菌种保存方法包括：定期移植法、液体石蜡法、沙土管法、真空冷冻干燥法、80℃冰箱冻结法、液氮超低温冻结法。
对于不同的保存方式活化的方式也不同：1 定期移植法的菌种复苏较简单，直接转接即可；2 液体石蜡法保存的菌种在复苏时，挑取少量菌体转接在适宜的新鲜培养基上，生长繁殖后，再重新转接一次；3 沙土管法保存菌种在复苏时，在无菌条件下打开沙土管，取部分沙土粒于适宜的斜面培养基上，长出菌落后再转接一次。
细菌详细裂解步骤
细菌详细裂解步骤 The document was finally revised on 2021
超声——酶解法
1细菌培养及收集
活化细菌，LB固体培养基活化培养24h，挑取单菌落接种液体培养基12h，收集菌悬液，4℃12000g 离心 10min，弃上清液，细菌沉淀悬于生理盐水中，于 600nm
波长处测定其吸光度值（A600），调整菌悬液吸光度 A600=，浓缩 10,20，30，40 倍后将菌悬液分装于离心管中，每管 1m L，4℃ 12000g离心 10min，弃上清液，细菌沉淀于 - 20℃保存备用
2 超声波破碎菌体
取保存的细菌沉淀，用生理盐水清洗2-3次，取菌悬液1ml，加入20ul溶菌酶（50mg ／ml），37℃水浴锅恒温反应一小时，采用超声法裂解细菌，超声功率 300~350W，工作，间歇，循环 152 次，冰浴。
超声结束后立即取 10μL 菌悬液，涂片进行革兰染色，显微镜下观察细菌破碎程度。
3 提取菌悬液蛋白
剩余菌悬液于 4℃ 16060g 离心 10min，收集上清液。
Tris-Hcl \L
柠檬酸 20mM MnSO4 30mM NADP 20mM 溶菌酶 50mg ml。
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细菌裂解-蛋白质表达的关键性步骤说明关于包涵体蛋白质的纯化是一个令人头疼的问题，包涵体的复性已经成为生物制药的瓶颈，关于包涵体的处理一般包括包括：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化。
此次介绍菌体的破碎相关知识。
菌体的裂解1、怎样裂解细菌？细胞的破碎方法1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。
此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。
2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。
对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。
4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。
无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
这是标准配方:裂解液：50mM Tris-HCl(pH8.5~9.0), 2mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 1mg/ml溶菌酶。
(溶菌酶在这个pH范围内比较好发挥作用)但我个人的经验是:如果你裂解细菌是为了提取蛋白的话,而且蛋白的分子量又小于20kd的话,尽量减少溶菌酶的用量,会引入溶菌酶这种杂蛋白.一般配60ml裂解液用药匙匙柄盛一点就够.判断裂解好坏的标准是,溶液很粘.protocol是10ml-50ml缓冲液(菌体洗涤液,裂解液等)/1g湿菌体.如果只做一个鉴定,我觉得100-200ml菌就够了.但凡超声,我都用60ml裂解液,因为我们的超声仪(现代分子生物学实验技术录象里的那种)很适合用100ml小烧杯,装60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低,不会冒泡泡,也不会洒出来.菌多我就延长超声时间.沉淀,也就是包涵体沉淀了,如果要上柱纯化,一定要先用4M尿素洗涤一下再用8M尿素溶解.如果不上柱,只是跑跑电泳,可以直接用8M尿素溶解以后,离心取上清,加入适量体积的loading buffer.loading buffer 对于包涵体的溶解能力是较弱的.取200微升菌液，离心后直接加上样buffer，100度3分钟后上样，然后SDSPAGE. 这个方法到底能不能溶解细菌中的包涵体? "而楼主的问题,虽然loading buffer对于包涵体的溶解能力是较弱的,但是我觉得你的做法只是在鉴定有无表达,用loading buffer是没有问题的.2、表达重组蛋白时，细菌裂解方法都有哪些？在表达重组蛋白时，诱导以后跑SDS-PAGE发现表达都很好，但是在裂解细胞时遇到问题。
总是不能彻底裂解细胞。
首先我采用超声裂解，可是不管我如何超声总有部分细菌没有裂解。
我的超声条件如下：宁波新芝超声细胞破碎仪，功率400W，超5秒，间隔5秒，重复99次。
然后显微镜观察，不彻底时再重复99次。
菌体来自200 ml培养液，用20 ml PBS重悬。
然后我又尝试加溶菌酶，首先加至终浓度100 ug/ml，4C半小时菌液不变粘，加大浓度至1 mg/ml，半小时后仍无明显变化。
因为我用的PBS是pH7.4，我怀疑是pH不合适，换用pH8.0 TE buffer，1 mg/ml溶菌酶，4C半小时仍无明显变粘。
因为这次使用的溶菌酶是前一天配好的，担心溶菌酶失效，重新称取冻干粉末，直接加入菌液，仍然没有明显变化。
真是郁闷。
到底出了什么事？请高手解答，并介绍优化的方案。
同时希望能介绍一下如何选择细胞破碎方法，以及如何确定最佳条件。
溶菌酶在pH7.4时是否没有活性了？可否配成浓缩液保存溶菌酶，如果可以，应如何保存？加入溶菌酶以后，如果细胞壁已破坏，菌液应该变粘吧，因为核酸被释放出来。
而超声破碎细胞，我觉得菌液是不会变粘的，因为超声可以把大分子核酸打碎成小片段。
我判断细胞破碎不完全是因为，在将破碎后样品离心分离上清和沉淀跑SDS-PAGE观察，发现在细胞碎片组分中除了经常出现的一两条带以外，还有菌体总蛋白样品中的很多带出现。
据此可以判断细胞只是部分破碎。
如果溶菌酶效果还可以，我觉得先用溶菌酶初步裂解细胞，然后再用超声进一步破碎并断裂大分子核酸以降低粘度的细胞破碎策略可能比较好。
因为超声有可能使蛋白变性，但单用溶菌酶不能确定是否完全破碎，还要再加核酸酶降低粘度。
这种两步法策略应该还可以减少破碎条件优化的时间。
我用的溶菌酶放置时间比较长了，有可能失活了。
我刚从生工又定了一支，不过得后天到货，但愿它有用。
如何观察溶菌酶是否已裂解细胞，通过观察粘度变化是否可以？只反复冻融是否可以有效裂解大肠杆菌细胞？溶菌酶只有在pH值大于8.0的条件下才能发挥溶菌作用，请务必保持PBS的pH＞8.0，同时溶菌酶的量一定要足！在加入溶菌酶后，最好放于磁力搅拌器上搅拌30分钟，再进行超声破菌，我的超声条件是：功率400W，工作2秒，间隔2秒，重复199次。
菌体来自500 ml培养物，用30 ml PBS重悬，超声效率还是可以的。
哪儿的溶菌酶好用？我用生工的溶菌酶，称取干粉20mg。
200ml菌液用18 ml NaCl重悬，加入2 ml 25mM Tris-HCl(pH8.0)，将溶菌酶干粉加入体系，混匀，测pH降低到5－6，加20 ul 2M Tris碱，体系pH升到～8。
4C放置1小时，菌液上层变澄清，摇动发现体系没有变粘。
测pH仍在8左右。
再37C保温1小时，还没有变化，我简直不知如何才好了。
另一瓶200ml培养物，溶菌酶处理1小时后超声。
条件：300W，超5秒停5秒，重复99次。
菌液有变化，但很不明显。
继续超声400次，从外观来看没有太大区别。
我简直要说tmd了。
见鬼了。
我的操作有什么地方不妥当，请各位指正。
溶菌酶的厂商要求是否很重要？我的诱导物来自1：20过夜培养物接种，37C生长3小时后30C诱导2小时（0.8mM IPTG）。
是否菌液太浓，Pharmacia的说明书200 ml培养物用10 ml重悬，我用20 ml，仍然不够稀？有人告诉我菌液应该稀一些，200 ml用30－40 ml重悬。
但实际操作也不够理想。
SDS-PAGE总是观察到细胞破碎效果不够彻底。
超声那么多次，蛋白都要被超碎变性了。
3、酵母的破碎酵母是一类单细胞真菌的总称，其成员分别属于不同的真菌纲，细胞壁成分是否会有较大差别，这些都是做破碎酵母细胞前要考虑的。
我归纳了一下，做破碎酵母的几种方法：1 机械的方法：一般的PROTOCOL都是用glass beads：如 sigma G-8772，加玻璃珠后超声，蛋白活性保持较好。
2 化学裂解的方法：10g酵母加1ml的乙酸乙酯，充分搅拌至液体状（希望高手点评）3 尿素裂解液（尿素8mol/L, NaCl 0.5mol/L,Tris 20mmol/L, EDTA 20mmol/L, 2%SDS, PH值8.0）高压匀浆。
（这个好象也该在方法2中）4 液氮冻融并研磨酵母破壁，我认为这种可能在小试中比较合适。
5 温和的酶法，可能不会会破坏酵母原生质体酶法裂解主要用两种酶：1。
蜗牛酶，可以直接从蜗牛的胃液中获得；2。
lyticase，可以从sigma定购。
这两种酶解法都可以和上面的几种方法结合使用，尤其是glass beads方法，效果很好。
我用过化学裂解的方法，10g酵母加1ml的乙酸乙酯，充分搅拌至液体状。
此法的裂解效果不错的，不妨试一下。
一篇文章是加尿素裂解液（尿素8mol/L, NaCl 0.5mol/L,Tris 20mmol/L, EDTA 20mmol/L, 2%SDS, PH 值8.0），据说效果可以酵母破碎效果好的我所做过的方法中还是玻璃珠，就象microbe 和rongjunli所说的那样，效率很高的，而且对目的蛋白活性不会有什么影响。
一般应该用这个方法。
4、超声破碎的条件选择超声破碎的条件不能一概而论，要看你的实验要求，有的是细菌破碎，有的是对组织细胞进行破碎，要掌握好功率和每次超声时间，功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，必要时在冰浴条件下进行超声破碎。
至于每次超声时是否起泡沫到不是关键的问题，这与你超声的量明显有关。
5、如何鉴定细菌超声破碎的程度最简单的方法：涂片--革兰氏结晶紫溶液染色0.5分钟---显微镜观察切记：只用结晶紫染色，别忘了染色后再用水稍冲洗一下6、细菌裂解的DNaseI不同纯度的酶换算标准不同，所以你最好查查是哪个公司的酶？仔细看说明书，可能会有换算说明。
另外看一下参考文献所用的酶是哪个公司的，到该公司的主页也可能有收获。
我用过华美和TAKARA的DNA酶，华美的是用mg/ml。
华美也有RNase free的DNA酶，定量用活性单位。
TAKARA的两种酶都是用活性单位定量的。
我在超声裂解细菌时加入一些DNA酶，一般用超声液加不同量的酶做一个预实验，选取符合你需要的酶量。
其实根据目的和方法的不同，所需要的酶量也是可调节的，比如酶切温度（16度或37度）。
7、超声裂解细菌是否完全？最简单的方法：涂片--革兰氏结晶紫溶液染色0.5分钟---显微镜观察切记：只用结晶紫染色来源出处：武汉戴安生物技术有限公司。