蛋白表达步骤
包括翻译在内的蛋白质表达的三个步骤
包括翻译在内的蛋白质表达的三个步骤蛋白质是生物体内基本的结构和功能分子，其表达过程包括翻译、转录和转运三个关键步骤。
这些步骤的顺序和协调性对于维持正常的细胞功能至关重要。
本文将对蛋白质表达的三个步骤进行详细介绍。
一、转录（Transcription）转录是蛋白质表达的第一个步骤，它将基因DNA中的信息转录成RNA分子。
转录过程发生在细胞核内。
具体而言，转录由RNA聚合酶（RNA polymerase）酶催化，使其与DNA产生特异性的结合，然后通过DNA的双链解开，在DNA模板链上合成与其互补的RNA分子。
这一过程遵循碱基配对原则，但在RNA分子中，腺嘌呤（A）与鸟嘌呤（G）通过尿嘧啶（U）取代胸腺嘧啶（T）。
因此，在转录过程中，RNA的合成是与DNA的反向互补的。
二、翻译（Translation）在细胞质中的核糖体（Ribosome）中进行的翻译过程是蛋白质表达的第二步。
在转录过程中合成的RNA分子被称为mRNA（messenger RNA，信使RNA）。
翻译过程中，mRNA作为模板，通过与tRNA （transfer RNA，转运RNA）分子中的氨酸配对，使氨酸按照特定的序列结合在一起形成多肽链。
这样，蛋白质的氨基酸序列便在翻译过程中确定下来。
这个过程需要依赖翻译因子（Translation factor）的帮助，它们能够担任酶活性或辅助配对的功能，使整个翻译过程高效进行。
三、转运（Post-translation）蛋白质的形成并未终止于翻译，部分蛋白质还需经历转运过程，进行必要的修饰和定位。
转运过程分为两种类型：共翻译转运和后翻译转运。
共翻译转运（Cotranslational translocation）发生在正在进行翻译的多肽链合成过程中。
在这个过程中，多肽链通过核糖体附着的内质网上的核孔蛋白复合体（signal recognition particle receptor complex）进入内质网（endoplasmic reticulum，ER）。
蛋白表达步骤
蛋白表达步骤
蛋白表达的步骤通常包括以下几个阶段：
1. 扩增目标基因：从原始样品中提取RNA并逆转录合成cDNA，然后使用聚合酶链式反应（PCR）扩增目标基因的DNA序列。
2. 构建表达载体：将扩增得到的目标基因插入到表达载体中。
表达载体通常包括启动子序列、终止子序列和选择性标记等元素，以确保目标基因能够在宿主细胞中进行表达和复制。
3. 转化宿主细胞：将表达载体导入宿主细胞中。
常用的转化方法包括热激冲击法、电转化法和电穿孔法。
转化后，宿主细胞会获得表达载体并开始合成目标蛋白。
4. 培养细胞：将转化后的宿主细胞进行培养。
培养条件包括培养基的选择、温度、搅拌速度和气体供应等因素。
培养的时间因目标蛋白的类型和表达量而有所不同。
5. 收获蛋白：根据需求，可以采用不同的方法来收获目标蛋白。
常见的方法有细胞破碎、纯化和亲和层析等。
收获得到的蛋白需要进行进一步的质量检测和分析。
原核蛋白表达流程
原核蛋白表达是一种常用的蛋白质生产方法，可以通过大肠杆菌等原核细菌表达目标蛋白。
以下是一个典型的原核蛋白表达流程：1. 选择表达系统和载体：选择适合的原核表达系统和载体。
常用的原核表达系统包括大肠杆菌系统（如E.coli），常用的载体包括pET、pGEX等。
2. 构建重组质粒：将目标基因克隆到选定的表达载体上，通常采用限制性内切酶切割和连接方法，确保目标基因正确插入载体。
3. 转化宿主菌：将构建好的重组质粒转化入宿主菌中，一般选择适当的大肠杆菌菌株，如BL21(DE3)等。
4. 培养菌液：将含有重组质粒的宿主菌接种到适当的培养基中，进行菌液的培养。
培养条件可根据所选的菌株和载体进行优化，包括温度、培养时间、培养基成分等。
5. 诱导表达：在适当的生长阶段，向培养基中加入适量的诱导剂，常用的诱导剂包括异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）。
6. 细胞破碎：经过一定时间的表达后，收集培养菌液并将细菌进行破碎，释放目标蛋白。
破碎方法可以选择超声波破碎、高压破碎等。
同时添加适量的蛋白酶抑制剂，避免蛋白质的降解。
7. 蛋白纯化：通过一系列的蛋白纯化步骤，如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等，分离纯化目标蛋白。
此步骤可以根据目标蛋白的特性和需求进行优化。
8. 鉴定和确认：对纯化得到的蛋白进行鉴定和确认，如SDS-PAGE凝胶电泳、Western blot等。
确保表达的目标蛋白符合预期。
9. 储存和应用：将纯化好的目标蛋白进行适当的保存和储存，确保其稳定性和活性。
根据需要，可以进行后续的功能研究、结构分析、制备抗体等应用。
需要注意的是，原核蛋白表达流程可以根据实验目的和具体要求进行调整和优化。
不同的表达系统和载体可能需要适应性调整。
此外，对特定蛋白的表达可能需要进一步优化培养条件和蛋白纯化步骤。
蛋白表达操作流程
蛋白表达操作流程：
1、感受态细胞的制备
OD590≈0.375，3mL分装到两个EP管，4℃，5000转离心3分钟；沉淀重悬于500 uL 0.1M CaCl2中；4℃，5000转离心3分钟，沉淀重悬于200 uL 0.1M CaCl2中。
Note:所有操作都要在冰上进行，确保低温。
2、构建好的载体的转化
1uL PGS-21a 加到100 uL感受态细胞BL21（DE3）中,孵育30~40 min，42℃热激2 min，立即置冰上3 min，加650 uL LB（37℃），37℃，200 rpm摇1 h，室温，5000转离心3分钟，留大约150 uL涂板，37℃培养箱培养过夜。
3、蛋白的诱导，表达
挑抗性板上单克隆，接种到4 mL LB（含抗性）中，37℃，200 rpm 摇过夜，保存菌种，转接到新鲜的LB（含抗性）中，摇OD590≈0.6，加入IPTG至终浓度为1 mM IPTG，37℃诱导5 h。
（每份做两管，一管加IPTG，一管不加，做为阴性对照）
4、表达蛋白的检测
4℃，5000转离心5 min，收集菌体，重悬于0.25倍体积预冷的20 mM Tris-HCl（PH8.0）,100℃煮5 min，10000转离心，取上清，进行SDS-PAGE电泳检测。
Note:低温操作。
蛋白表达纯化流程
第一章蛋白表达纯化一、诱导表达分析1) 把测序正确的表达质粒转化到合适的表达宿主菌中并涂布在相应抗性的LB 平板上培养过夜;2) 分别挑两个单克隆于3ml含抗生素的LB培养基中培养过夜;3) 按1%接种过夜培养的菌液于4ml含抗生素LB培养基中37度培养2-3小时;4) 加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导表达3个小时左右，取样做蛋白电泳分析目标蛋白的表达情况。
二、蛋白纯化2.1重组蛋白的提取2.1.1 提取缓冲液20 mM Tris-HCl (pH8.0) 或者其他推荐使用的缓冲体系。
如需溶解难溶蛋白或者包涵体还可加入8 M urea 或 6 M guanidine hydrochloride 。
Note: 处理(His)6融合蛋白时可以加入5–50 mM imidazole 以减少上柱时的非特异性吸附。
2.1.2 方法1)发酵液离心收集菌体(at 7 000–8 000 g for 10 minutes or 1 000–1 500 g for 30minutes at +4 °C)。
2)弃去上清液，加入适当的20 mM Tris-HCl (pH8.0)，重悬；3)离心收集菌体同上，弃去上清液，将装有菌体的离心管置于冰中。
4)每ml菌体加入50ul冰冷的提取缓冲液重悬菌体。
5)冰浴中超声裂解菌体(超声2秒，停止6秒)，之后取样进行SDS-PAGE电泳分析。
Note:超声破菌应尽量使用最短的时间，长时间的进行可能会破坏蛋白功能。
还应避免产生泡沫，因为这样会使蛋白变性和导致宿主蛋白与融合蛋白协同纯化。
6)离心使细胞碎片沉降(at 12 000 g for 10 minutes at +4 °C)。
7)小心将上清液移到干净的容器中，并取样进行SDS-PAGE电泳分析。
Note:含有8 M urea的样品可以直接电泳上样，但含有6 M guanidine hydrochloride的样品必须换成8 M urea才可上样。
蛋白表达纯化实验步骤
蛋白表达纯化实验步骤（待改进）1、取适当相应蛋白高表达得动物组织提total-RNA.2、设计蛋白表达引物。
引物要去除信号肽，要加上适当得酶切位点与保护碱基。
3、RT-PCR. KOD酶扩增获取目得基因c DNA、4、双酶切，将cDNA、克隆入PET28 / 3 2等表达载体.5、转化到DH5a感受态细菌中扩增，提质粒.6、将质粒转化入表达菌株，挑菌检测并保种。
表达菌株如BI2 1 （D E 3 ）, Rosett a garni （D E3）、BI2 1 Codon（DE3）^«7、蛋白得诱导表达.1 ）将表达菌株在3nilLB培养基中摇至O D=0 . 6左右，加入IPTG,浓度梯度从25 U M到Im M37度诱导过夜（一般3h以上即有大量表达）。
2）3 DS-PAGE电泳检测目得蛋白得表达.注：目得蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白得50%以上，在胶上可以瞧到明显得粗大得条带。
3）将有表达得菌株10%甘油保种，保存1ml左右就足够了，并记录I PTG浓度范鬧。
甘油就是用0、22 P mil滤除菌得，储存浓度一般就是30^-60%.使用时自己计算用量。
4）用上述【PTG浓度范围得最低值诱导10ml表达菌，18度，低转速（14 0 - 1 8 0rpm）. 诱导过夜作为包涵体检测样品。
注意：［、如果表达得蛋白对菌体有毒性，可以在加1 PTG送前得培养基中加入:L%得葡萄糖用来抑制本底表达。
葡萄糖会随着细菌得繁殖消耗殆尽，不会彫响后而得表达。
2、保种可以取一部分分成5om -管，每次用一管，避免反复冻融。
8、包涵体检测。
方案见附件29、如有上清表达，则扩大摇菌。
1）取保种得表达菌株先摇1 0 ml 3 7度，SOOrpm摇至0D>=1. 5,约5 h左右，视菌种得活性而异，也可过夜摇菌。
2）将上一步中得8m I加入300 ml培养基中37度,2 50rpm摇至0 D=ls 0左右（约2、5h〜3h）,然后加IPTG（浓度同包涵体检测中使用得浓度.）注：菌液浓度要适当得浓一些，否则第二天收集不到足够得菌体，因为低温低转速细菌生长非常缓慢。
蛋白表达纯化实验步骤
蛋白表达纯化实验步骤蛋白表达纯化实验步骤(待改进)1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。
2、设计蛋白表达引物。
引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基。
3、RT-PCR,K0酶扩增获取目的基因c DNA.4、双酶切，将cDNA克隆入PET28/32等表达载体。
5、转化到DH5a感受态细菌中扩增，提质粒。
6、将质粒转化入表达菌株，挑菌检测并保种。
表达菌株如BI21(DE3)、Rosetta gami(DE3)、Bl21 cod on (DE3)等。
7、蛋白的诱导表达1）将表达菌株在3ml LB培养基中摇至0D二0・6左右,加入IPTG,浓度梯度从25 11M到lm Mo 37度诱导过夜（一般3h以上即有大量表达）。
2）SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。
注：目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上，在胶上可以看到明显的粗大的条带。
3）将有表达的菌株10%甘油保种，保存lml左右就足够了，并记录IPTG浓度范围。
甘油是用0. 22 um过滤除菌的，储存浓度一般是30%-60%,使用时自己计算用量。
4）用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达,18 度,低转速(140-180rpm),诱导过夜作为包涵体检测样品。
注意:1.如果表达的蛋白对困体有毒性，可以在加IPTG之前的培养基中加入1%勺葡萄糖用来抑制本底表达。
葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽，不会影响后面的表达。
2.保种可以取一部分分成50卩I 一管,每次用一管, 避免反复冻融。
8包涵体检测。
方案见附件29、如有上清表达，则扩大摇菌。
1）取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=1.5,约5h左右，视菌种的活性而异，也可过夜摇菌。
2）将上一步中的8ml加入300ml培养基中37 度,250rpm摇至OD= 1.0左右（约 2.5h〜3h）,然后加IPTG（浓度同包涵体检测中使用的浓度。
蛋白表达纯化实验步骤
蛋白表达纯化实验步骤(待改进)1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。
2、设计蛋白表达引物。
引物要去除信号肽,要加上适当的酶切位点和保护碱基。
3、RT-PCR,KOD酶扩增获取目的基因c DNA.4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。
5、转化到DH5α感受态细菌中扩增,提质粒。
6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。
表达菌株如Bl21(DE3)、Rosetta gami(DE3)、Bl21 codon(DE3)等。
7、蛋白的诱导表达。
1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右,加入IPTG,浓度梯度从25μM到1m M。
37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。
2)SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。
注:目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带。
3)将有表达的菌株10%甘油保种,保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围。
甘油是用0.22μm过滤除菌的,储存浓度一般是30%-60%,使用时自己计算用量。
4)用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(140-180rpm),诱导过夜作为包涵体检测样品。
注意:1.如果表达的蛋白对菌体有毒性,可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。
葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽,不会影响后面的表达。
2.保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反复冻融。
8、包涵体检测。
方案见附件29、如有上清表达,则扩大摇菌。
1)取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=1.5,约5h左右,视菌种的活性而异,也可过夜摇菌。
2)将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度,250rpm摇至OD= 1.0左右(约2.5h~3h),然后加IPTG(浓度同包涵体检测中使用的浓度。
)注:菌液浓度要适当的浓一些,否则第二天收集不到足够的菌体,因为低温低转速细菌生长非常缓慢。
蛋白质表达过程
蛋白质表达过程蛋白质是生物体内最重要的分子之一，它们在细胞中扮演着关键的角色，参与调节生物体的生理功能和代谢过程。
蛋白质的表达是指从基因到蛋白质的转化过程，涉及到DNA转录成mRNA，然后通过翻译作用合成蛋白质的过程。
本文将详细介绍蛋白质表达的过程。
蛋白质表达的第一步是DNA转录成mRNA。
DNA是生物体内存储遗传信息的分子，它包含了编码蛋白质的基因序列。
在转录过程中，DNA的双链被解开，RNA聚合酶沿着DNA模板链合成mRNA的过程。
这个过程是通过将mRNA的碱基与DNA模板链上的互补碱基配对来完成的。
在合成过程中，A碱基与DNA上的T碱基配对，G碱基与C碱基配对。
这样，一个完整的mRNA分子就被合成出来。
接下来，合成出的mRNA分子会离开细胞核，进入细胞质。
在细胞质中，mRNA会与核糖体结合，进一步参与到蛋白质合成的过程中。
核糖体是由多个蛋白质和rRNA组成的复合物，它具有翻译mRNA 的功能。
蛋白质合成的第二步是翻译过程。
这个过程发生在核糖体中，通过将mRNA上的编码信息转化为具体的氨基酸序列。
翻译过程是通过tRNA分子来实现的，tRNA是一种特殊的RNA分子，它能够将mRNA上的编码信息与对应的氨基酸配对。
每个tRNA分子上都有一个特定的三个碱基序列，这个序列与mRNA上的三个碱基序列相互匹配，以确保正确的氨基酸被加入到正在合成的蛋白质链中。
在翻译过程中，tRNA分子将氨基酸从细胞质中的氨基酸库中带入核糖体，然后根据mRNA上的编码信息，将氨基酸逐个添加到蛋白质链上。
这个过程是通过核糖体中的rRNA分子来催化的。
rRNA 分子中的催化活性位点能够将氨基酸连接在一起，形成一个新的氨基酸链。
这个链上的氨基酸序列就是根据mRNA上的编码信息决定的。
蛋白质合成的最后一步是折叠和修饰过程。
在合成出来的蛋白质链形成后，它需要经过一系列的折叠和修饰过程，才能够形成具有功能的蛋白质分子。
这个过程是通过细胞内的分子机器来完成的。
蛋白表达的整个流程
蛋白表达的整个流程
蛋白质表达是生物学家和应用生物学家一直都在研究的重要课题，它
涉及识别、精确编码和连接基因组上的基因产物，并且可以转化为有
用的和使用的蛋白质。
蛋白质表达的整个流程是蛋白质系统研究中一
个复杂而重要的步骤，它可以非常有效地分析和发现基因之间的关系。
蛋白质表达的整个流程可以大致分为4个基本的步骤：转录、剪接、
转译和后修饰。
转录是从DNA到RNA的过程，这也是基因表达的开始。
可以从基因组
中找到蛋白质编码基因，然后根据已知的信息，将其转录成RNA片段。
剪接是一种对RNA进行修饰的步骤，它只在转录后发生，它能够从RNA 片段中切割出有用的蛋白质编码区域。
转译是从RNA到蛋白质的过程，它通过将RNA片段中的碱基对一一对
应转换成氨基酸来实现。
每个碱基三种代表一种氨基酸，有助于蛋白
质的组装。
后修饰是蛋白质最后一步，它是指在蛋白质表达过程中细胞内和细胞
外发生的一系列加工反应，这些加工反应有助于完善和活化蛋白质的
结构和功能。
蛋白质表达的整个流程是非常复杂的，但它也是蛋白质研究中不可或
缺的部分。
通过对蛋白质表达的整个流程的理解，我们可以更好地了
解和分析基因和蛋白质之间的关系，从而为蛋白质研究应用提供重要
的理论依据。
蛋白表达纯化实验步骤
蛋白表达纯化实验步骤蛋白表达纯化实验步骤（待改进）1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。
2、设计蛋白表达引物。
引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基。
3、RT-PCR，KOD酶扩增获取目的基因 c DNA.4、双酶切，将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。
5、转化到DH5α感受态细菌中扩增，提质粒。
6、将质粒转化入表达菌株，挑菌检测并保种。
表达菌株如Bl21（DE3）、Rosetta gami（DE3）、Bl21 codon（DE3）等。
7、蛋白的诱导表达。
1）将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右，加入IPTG，浓度梯度从25μM到1m M。
37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。
2）SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。
注：目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上，在胶上可以看到明显的粗大的条带。
动等原因，要及时调整。
溶液由浑浊变清透，由粘稠变不粘稠表明裂解完成（后面3000转离心时，如果沉淀少说明裂解的好）。
5.超声波破碎仪工作30分min要休息5min（即关闭总电源开关）。
注意：1.如果纯化的蛋白较易被蛋白酶降解，在超声裂解之前要加蛋白酶抑制剂（PMSF），PMSF工作浓度为1%。
2.如不能判断是否裂解完全，就按上述条件裂解60分钟，60分钟足够裂解。
8、取得上清1）将破碎好的溶液收集到50ml离心管中。
10000rpm，15min，4°离心。
沉淀为包涵体、细胞碎片和未破碎的细胞。
轻轻的将上清倒出，尽量不要倒出沉淀。
（此时可以测量一下pH值，pH值最好在7.5左右。
平衡buffer的pH是7.8左右，裂解后上清就会在7.5左右。
）9、纯化上清---摸洗脱条件。
1）镍柱处理。
将1ml镍柱吸入空层析管中，待其中的液体流完后加入平衡缓冲液3ml。
2）将10ml上清加到已经平衡过的NI柱上，并将过柱的样品重复上样3次。
（若是流速慢可以在柱子下面加一个针头，或者用1ml 的枪将胶体吹散。
蛋白质表达是什么了解基本概念
蛋白质表达是什么了解基本概念蛋白质表达是指基因信息转录为RNA后，进一步通过翻译过程转换为蛋白质的过程。
蛋白质是细胞中最重要的分子之一，扮演着多种生物学功能的角色。
本文将通过对蛋白质表达的基本概念、流程和调控机制的探讨，帮助读者更好地理解蛋白质表达的过程。
一、蛋白质表达的基本概念蛋白质表达是细胞内遵循中心法则的过程之一。
中心法则指出，DNA的信息通过转录转化为RNA，再通过翻译过程转变为蛋白质。
蛋白质是细胞内多种生物学过程的执行者，参与体内的结构支持、功能调控等重要活动。
二、蛋白质表达的流程蛋白质表达的流程主要包括转录和翻译两个过程。
1. 转录过程转录过程是指DNA的信息通过RNA聚合酶酶的作用，在细胞核中转录为RNA的过程。
主要分为三个步骤：起始、延伸和终止。
转录起始时，RNA聚合酶识别DNA上的起始位点，并与其结合。
延伸阶段，RNA聚合酶沿DNA模板链移动，合成RNA链。
而在终止阶段，转录终止信号使RNA分子与DNA分离，并释放成为转录产物的RNA链。
2. 翻译过程翻译是指在细胞质中，mRNA的信息通过核糖体和tRNA的配合作用，合成蛋白质的过程。
其中tRNA通过把特定氨基酸携带到合成蛋白质的地方，并参与蛋白质的合成。
翻译过程主要分为三个阶段：起始、延伸和终止。
起始阶段，核糖体与mRNA和起始tRNA结合，形成初始的翻译复合体。
延伸阶段，核糖体沿着mRNA移动，依次组装氨基酸成链，形成多肽链。
而在终止阶段，到达终止密码子时，核糖体、mRNA和多肽链脱离，翻译过程终止。
三、蛋白质表达的调控机制蛋白质表达受到多种调控机制的影响，包括转录调控和翻译调控。
1. 转录调控转录调控是指在转录过程中，通过调节RNA聚合酶的结合和活性以及DNA区域的可访问性来控制基因的表达水平。
这种调控可以通过转录因子的结合和启动子区域的甲基化等方式实现。
转录调控的机制复杂多样，可以对特定基因的表达进行上调或下调，以满足细胞内外的需求。
流式检测蛋白表达实验步骤
流式检测蛋白表达实验步骤
流式检测蛋白表达实验是一种用于检测细胞或生物样品中特定蛋白质表达水平的实验方法。
以下是一种常见的流式检测蛋白表达实验步骤：
1.细胞或生物样品处理：首先，收集细胞或生物样品，并将其固定在适当的比例溶液中。
固定剂可以选择如甲醛、多聚甲醛或戊二醛等。
2.洗涤：将固定好的细胞或生物样品进行洗涤，以去除残留的杂质。
3.通透化处理：使用通透化剂（如0.1% Triton X-100）处理样品，以便染料进入细胞内。
4.封闭：为了防止非特异性染色，需要使用封闭剂（如牛血清白蛋白）覆盖样品。
5.染色：将抗体（针对目标蛋白质的特定抗原决定簇）加入样品中，孵育一段时间，让抗体与目标蛋白质结合。
6.洗涤：再次洗涤样品，以去除未结合的抗体。
7.荧光标记的二抗结合：加入荧光标记的二抗（针对抗体的抗原决定簇），使其与抗体结合。
荧光标记的二抗可以帮助检测目标蛋白质的表达水平。
8.洗涤：再次洗涤样品，去除未结合的荧光标记二抗。
9.流式细胞仪检测：将样品放入流式细胞仪中，通过激光照射
样品，检测荧光信号。
流式细胞仪可以对每个细胞进行快速测量，并收集表达特定蛋白质的细胞。
10.数据分析：使用流式细胞仪配套的软件对数据进行分析，根据荧光信号的强度，确定蛋白质的表达水平。
需要注意的是，这里提供的步骤仅供参考，实际实验过程中可能会有所不同，具体步骤还需根据实验目的、样品类型和研究对象进行调整。
蛋白表达纯化实验步骤
蛋白表达纯化实验步骤(待改良)1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。
2、设计蛋白表达引物。
引物要去除信号肽,要加上适当的酶切位点和保护碱基。
3、RT-PCR,KOD酶扩增获取目的基因c DNA.4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。
5、转化到DH5α感受态细菌中扩增,提质粒。
6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。
表达菌株如Bl21(DE3)、Rosetta gami(DE3)、Bl21 codon(DE3)等。
7、蛋白的诱导表达。
1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右,参加IPTG,浓度梯度从25μM到1m M。
37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。
2)SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。
注:目的蛋白包涵体表达量一般会到达菌体蛋白的50%以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带。
3)将有表达的菌株10%甘油保种,保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围。
甘油是用0.22μm过滤除菌的,储存浓度一般是30%-60%,使用时自己计算用量。
4)用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(140-180rpm),诱导过夜作为包涵体检测样品。
注意:1.如果表达的蛋白对菌体有毒性,可以在加IPTG之前的培养基中参加1%的葡萄糖用来抑制本底表达。
葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽,不会影响后面的表达。
2.保种可以取一局部分成50μl一管,每次用一管,防止反复冻融。
8、包涵体检测。
方案见附件29、如有上清表达,则扩大摇菌。
1)取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=1.5,约5h左右,视菌种的活性而异,也可过夜摇菌。
2)将上一步中的8ml参加300ml培养基中37度,250rpm摇至OD= 1.0左右(约2.5h~3h),然后加IPTG(浓度同包涵体检测中使用的浓度。
)注:菌液浓度要适当的浓一些,否则第二天收集不到足够的菌体,因为低温低转速细菌生长非常缓慢。
蛋白表达纯化实验步骤
蛋白表达纯化实验步骤(待改进)1、取适当相应蛋白高表达得动物组织提total—RNＡ.２、设计蛋白表达引物。
引物要去除信号肽，要加上适当得酶切位点与保护碱基。
3、RT－PＣR，KＯD酶扩增获取目得基因c DNA、4、双酶切,将cDNA、克隆入PＥT2８／３2等表达载体.5、转化到DH5α感受态细菌中扩增，提质粒.6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。
表达菌株如Bl2１(ＤE３）、Rosettａgami（D Ｅ3)、Bl2１ｃoｄon(ＤE3)等。
7、蛋白得诱导表达.１)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至ＯD=０、6左右，加入IＰTG，浓度梯度从25μM到1m M.37度诱导过夜（一般3h以上即有大量表达）。
2)ＳＤＳ－PＡGE电泳检测目得蛋白得表达.注：目得蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白得50%以上，在胶上可以瞧到明显得粗大得条带。
3）将有表达得菌株10％甘油保种,保存1ml左右就足够了，并记录ＩPTG浓度范围。
甘油就是用0、22μm过滤除菌得,储存浓度一般就是30％-60%，使用时自己计算用量。
4)用上述ＩPTG浓度范围得最低值诱导１0ｍl表达菌，18度，低转速(14０－１８0rpｍ)，诱导过夜作为包涵体检测样品。
注意:1、如果表达得蛋白对菌体有毒性，可以在加ＩＰTG之前得培养基中加入1%得葡萄糖用来抑制本底表达。
葡萄糖会随着细菌得繁殖消耗殆尽,不会影响后面得表达。
２、保种可以取一部分分成５0μl一管，每次用一管,避免反复冻融。
８、包涵体检测。
方案见附件2９、如有上清表达，则扩大摇菌。
1）取保种得表达菌株先摇1０ml,３7度，300rpm摇至OD>=1、5,约5ｈ左右，视菌种得活性而异,也可过夜摇菌。
2)将上一步中得8ｍｌ加入３0０ml培养基中37度,２50rpm摇至ＯＤ= 1、0左右(约2、5h～3h),然后加IPＴＧ(浓度同包涵体检测中使用得浓度.）注：菌液浓度要适当得浓一些,否则第二天收集不到足够得菌体,因为低温低转速细菌生长非常缓慢。
了解蛋白质表达的基本步骤
了解蛋白质表达的基本步骤蛋白质是生物体内构成细胞和组织的重要基本单元，参与了生物体内的各种生命活动。
了解蛋白质表达的基本步骤对于研究生物学、药物研发和基因工程等领域都具有重要意义。
本文将介绍蛋白质表达的基本步骤，包括基因转录、转录后修饰、翻译和后转录修饰。
一、基因转录蛋白质表达的第一步是基因转录。
在细胞核内，DNA双螺旋结构的基因区域会先解开，形成单链的RNA。
这个过程被称为转录。
转录是由一种特殊的酶称为RNA聚合酶完成的。
在转录过程中，RNA聚合酶会根据DNA模板合成与DNA互补的RNA分子，这种RNA分子被称为信使RNA（mRNA）。
mRNA能够进一步被翻译为蛋白质，因此它是蛋白质表达的关键。
二、转录后修饰转录完成后，mRNA并不是立即能够被翻译为蛋白质。
在细胞核内，mRNA还需要经过一系列的修饰过程。
这些修饰过程包括剪接、五帽、多聚腺苷酸尾巴等。
剪接是指将mRNA分子中的非编码区域（内含子）剪除掉，将编码区域（外显子）连接成连续的序列。
这样的修饰过程使得mRNA能够包含来自不同外显子的编码信息，从而增加了蛋白质的多样性。
五帽和多聚腺苷酸尾巴则有利于mRNA的稳定和翻译效率。
三、翻译翻译是蛋白质表达的关键步骤，它发生在细胞质中的细胞器——核糖体内。
翻译通过mRNA上的密码子来指导氨基酸的组装，将氨基酸连成蛋白质链。
在翻译的过程中，mRNA的密码子与tRNA上的抗密码子相互配对。
每个tRNA携带着一个特定的氨基酸，并根据mRNA上的密码子配对选择正确的氨基酸。
随着tRNA的配对，蛋白质链逐渐增长，直到遇到终止密码子停止翻译。
四、后转录修饰翻译完成后，蛋白质并不是最终形态。
在细胞中，蛋白质还需要一系列的后转录修饰过程，以获得最终的功能性蛋白质。
后转录修饰包括蛋白质折叠、糖基化、磷酸化、乙酰化、甲基化等。
这些修饰过程能够改变蛋白质的空间结构和化学性质，从而影响蛋白质的功能和稳定性。
结语蛋白质表达是生物体内重要的生物过程。
蛋白表达步骤
1。
培养基得配制原理步骤LB培养基,就是微生物学实验中最常用得培养基,用于培养大肠杆菌等细菌,其分为液态或就是加入琼脂制成得固态培养基.加入抗生素得ＬB培养基可用于筛选以大肠杆菌为宿主得克隆.尽管该培养基得名称被广泛解释为Ｌuria-Bertani 培养基，然而根据其发明人贝尔塔尼（Giｕｓeppe Ｂertａni）得说法，这个名字来源于英语得lysogenｙbrｏth，即溶菌肉汤。
LB培养基得配制:成分胰蛋白胨（tryptone)１0g酵母提取物(ｙeast extraｃt）５g氯化钠(NａＣl)10g固体培养基另加琼脂粉15—２0ｇ加双蒸水至100０mL, 用5mol/L ＮaOH(约0、2mｌ)调pＨ至7、2，12１℃灭菌３０ｍin配制方法(1)称量分别称取所需量得胰化蛋白胨、酵母提取物与NaCｌ,置于烧杯中。
(2）溶化加入所需水量2/3得蒸馏水于烧杯中,用玻棒搅拌,使药品全部溶化。
(3）调ｐH 用１mｏl/L NaＯH溶液调pＨ至7、２。
（4)定容将溶液倒入量筒中,加水至所需体积。
(５）加琼脂加入所需量琼脂,加热融化,补足失水。
(6）分装、加塞、包扎．(7)高压蒸汽灭菌10０Pa灭菌２0ｍｉn。
2、大肠杆菌菌种活化原理菌种得活化就就是将处于保藏状态得菌种放入合适得培养基中进行培养,逐级增大培养就是为了得到纯而壮得培养物，可以理解为就就是为了获得活力旺盛得、接种数量足够得培养物进行培养．菌种发酵一般情况下需要2—3代得复壮过程,因为保存时得条件往往与培养时得条件不相同,所以要活化，让菌种逐渐适应培养环境中药标准对照品研究中心建议实验要明白菌种活化得情况就首选需要了解菌种保藏得方式与方法。
目前国际与国内常用得菌种保存方法包括：定期移植法、液体石蜡法、沙土管法、真空冷冻干燥法、８0℃冰箱冻结法、液氮超低温冻结法。
对于不同得保存方式活化得方式也不同:1定期移植法得菌种复苏较简单，直接转接即可;2液体石蜡法保存得菌种在复苏时，挑取少量菌体转接在适宜得新鲜培养基上,生长繁殖后,再重新转接一次;3沙土管法保存菌种在复苏时，在无菌条件下打开沙土管,取部分沙土粒于适宜得斜面培养基上,长出菌落后再转接一次。
蛋白表达纯化实验步骤
蛋白表达纯化实验步骤(总9页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--蛋白表达纯化实验步骤(待改进)1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。
2、设计蛋白表达引物。
引物要去除信号肽,要加上适当的酶切位点和保护碱基。
3、RT-PCR,KOD酶扩增获取目的基因c DNA.4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。
5、转化到DH5α感受态细菌中扩增,提质粒。
6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。
表达菌株如Bl21(DE3)、Rosetta gami(DE3)、Bl21 codon(DE3)等。
7、蛋白的诱导表达。
1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=左右,加入IPTG,浓度梯度从25μM到1m M。
37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。
2)SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。
注:目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带。
3)将有表达的菌株10%甘油保种,保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围。
甘油是用μm过滤除菌的,储存浓度一般是30%-60%,使用时自己计算用量。
4)用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(140-180rpm),诱导过夜作为包涵体检测样品。
注意:1.如果表达的蛋白对菌体有毒性,可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。
葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽,不会影响后面的表达。
2.保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反复冻融。
8、包涵体检测。
方案见附件29、如有上清表达,则扩大摇菌。
1)取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=,约5h左右,视菌种的活性而异,也可过夜摇菌。
2)将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度,250rpm摇至OD= 左右(约~3h),然后加IPTG(浓度同包涵体检测中使用的浓度。
蛋白表达原理
蛋白表达原理蛋白是生命体中非常重要的组成部分，它们扮演着许多生物学过程中的关键角色。
蛋白的合成过程被称为蛋白表达，它是通过基因转录和翻译过程来实现的。
在本文中，我将详细介绍蛋白表达的原理以及其背后的基本机制。
蛋白表达的过程可以简单地分为三个主要步骤：转录、RNA加工和翻译。
转录是指DNA的信息被转录成RNA的过程。
在细胞质中，DNA 的一部分被转录成一种称为mRNA（信使RNA）的分子。
这是通过RNA聚合酶酶的作用实现的，它将DNA模板上的核苷酸序列转录成相应的RNA序列。
这个过程发生在细胞核中，随后mRNA从细胞核运输到细胞质，为接下来的翻译做准备。
接下来，RNA加工是指mRNA分子在转录后需要经过一系列的修饰和修剪过程。
这些修饰包括剪接、5'端帽和3'端尾巴的加入等。
剪接是最重要的一个步骤，它指的是将mRNA上的内含子（即非编码区域）剪除，将外显子（即编码区域）连接起来，形成成熟的mRNA分子。
这个过程确保了蛋白质的编码序列是正确的。
翻译是指mRNA上的信息被翻译成蛋白质的过程。
这个过程发生在细胞质中的核糖体中，它是一种包含RNA和蛋白质的细胞器。
核糖体将mRNA上的核苷酸序列翻译成氨基酸序列，从而合成出特定的蛋白质。
这是通过tRNA（转运RNA）分子的作用实现的，tRNA分子能够识别mRNA上的特定核苷酸序列，并将相应的氨基酸运输到翻译机器上进行合成。
在整个蛋白表达过程中，还有一些其他的因素也起到了重要的作用。
例如，转录因子是一类能够结合到DNA上的蛋白质，它们能够调控基因的转录过程。
转录因子的结合可以增强或抑制基因的转录，从而影响蛋白的表达水平。
此外，信使RNA的稳定性也对蛋白表达起到了重要的影响。
有些mRNA分子具有较长的寿命，可以在细胞中持续存在较长的时间，从而导致蛋白的高表达水平。
除了天然的蛋白表达机制，科学家们还开发了许多基因工程技术，用于实现外源蛋白的表达。
例如，重组DNA技术可以通过将外源基因插入到表达载体中，然后将这个载体导入到宿主细胞中来实现外源蛋白的表达。
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1．培养基的配制原理wenku.baidu./link?url=B2SX0TUS5KB2ovXQcKyds9MS9OnW7y5Yn204CH3vg44FsT WICJAnwePCb013a9T-vzmX5g9oCbv6GSuPahN6jfA9hVhQXCd3QCMZ_NTscu7步骤LB培养基，是微生物学实验中最常用的培养基，用于培养大肠杆菌等细菌，其分为液态或是加入琼脂制成的固态培养基。
加入抗生素的LB 培养基可用于筛选以大肠杆菌为宿主的克隆。
尽管该培养基的名称被广泛解释为Luria-Bertani 培养基，然而根据其发明人贝尔塔尼(Giuseppe Bertani)的说法，这个名字来源于英语的lysogeny broth，即溶菌肉汤。
LB培养基的配制：成分胰蛋白胨(tryptone)10g酵母提取物(yeast extract)5g氯化钠(NaCl)10g固体培养基另加琼脂粉15-20g加双蒸水至1000mL, 用5mol/L NaOH（约0.2ml）调pH至7.2，121℃灭菌30min配制方法（1）称量分别称取所需量的胰化蛋白胨、酵母提取物和NaCl，置于烧杯中。
（2）溶化加入所需水量2/3的蒸馏水于烧杯中，用玻棒搅拌，使药品全部溶化。
（3）调pH 用1mol/L NaOH溶液调pH至7.2。
（4）定容将溶液倒入量筒中，加水至所需体积。
（5）加琼脂加入所需量琼脂，加热融化，补足失水。
（6）分装、加塞、包扎。
（7）高压蒸汽灭菌100Pa灭菌20min。
2、大肠杆菌菌种活化原理菌种的活化就是将处于保藏状态的菌种放入合适的培养基中进行培养，逐级增大培养是为了得到纯而壮的培养物，可以理解为就是为了获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物进行培养。
菌种发酵一般情况下需要2-3代的复壮过程，因为保存时的条件往往和培养时的条件不相同，所以要活化,让菌种逐渐适应培养环境中药标准对照品研究中心建议实验要明白菌种活化的情况就首选需要了解菌种保藏的方式和方法。
目前国际和国常用的菌种保存方法包括：定期移植法、液体石蜡法、沙土管法、真空冷冻干燥法、80℃冰箱冻结法、液氮超低温冻结法。
对于不同的保存方式活化的方式也不同：1 定期移植法的菌种复较简单，直接转接即可；2 液体石蜡法保存的菌种在复时，挑取少量菌体转接在适宜的新鲜培养基上，生长繁殖后，再重新转接一次；3 沙土管法保存菌种在复时，在无菌条件下打开沙土管，取部分沙土粒于适宜的斜面培养基上，长出菌落后再转接一次。
或取沙土粒于适宜的液体培养基中，增殖培养后再转接斜面；4 真空冷冻干燥法保存菌种在复时先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部，将安瓿管顶部烧热，用无菌棉签沾冷水，在顶部擦一圈，顶部出现裂纹，用挫刀或镊子颈部轻叩一下，敲下已开裂的安瓿管的顶端，用无菌水或培养液溶解菌块，使用无菌吸管移入新鲜培养基上，进行适温培养；5 -80℃冰箱冻结法保存菌种复时，从冰箱中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置38℃-40℃水浴中快速复并适当快速摇动。
直到部结冰全部溶解为止，约需50秒-100秒。
开启安瓿管或塑料冻存管，将容物移至适宜的培养基上进行培养6 液氮超低温冻结法保存菌种复与-80℃冰箱冻结法保存菌种复相似，从液氮罐中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置在38℃-40℃水浴中快速复并适当摇动。
直到部结冰全部溶解为止，一般约需50秒-100秒。
开启安瓿管或塑料冻存管，将容物移至适宜的培养基上进行培养。
步骤总结一下菌种活化需要以下几个步骤：第一配置菌种适宜生长的培养基第二将菌种从保藏状态恢复到室温状态，比如将冷冻的菌种解冻第三将通过操作将保藏的菌种接种到培养基中培养，此步骤称为菌种复壮第四步挑选培养基茁壮的菌落，挑选其中部分菌落接种到新的培养基中培养，重复此步骤2-3次，从而得到生长良好的菌落经过这四个步骤就到达将菌种从保藏状态活化的最终目的.举例大肠杆菌菌种活化方法：配活化培养基（LB）：活化大肠杆菌配方：0.5g酵母粉，1g蛋白胨，1g氯化钠，稀释到100ml复细胞（去掉DMSO及冷冻过程中产生的有毒物质）材料：液氮中的细胞共1毫升：含20%血清（FBS），10%DMSO（防止细胞产生冰晶），培养基步骤：一、从液氮（约-190度）中取出细胞（管中有1ml细胞）（稍微抖掉液体）二、快速放入37度水浴1分钟。
三、加入1ml DMEM 培养基融化冰晶。
四、全部移入离心管中，管口封口膜封口；五、离心：1200r/min，5min。
六、去上清（用大枪（1-5ml）一次吸出，吸时沉淀朝上）；G2 细胞沉淀较明七、先（用1ml 小枪）加到离心管中1 ml培养基并吹打吸出到培养瓶中，再加1 ml培养基润洗离心管吸出到培养瓶中，然后用大枪加3ml培养基到培养瓶中（补足5毫升）；八、培养瓶放入37度温箱。
3、质粒的提取一、导论已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA，这些方法都含有以下3个步细菌培养物的生长。
细菌的收获和裂解质粒DNA的纯化。
(一)细菌培养物的生长从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长)，然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。
现在使用的许多质粒载体(如pUC系列)都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准LB 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。
此时，不必造反性地扩增质粒DNA。
然而，较长一代的载体(如pBR322)由于不能如此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。
氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时，其拷贝数持续递增。
这样，像pBR322-类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不同，前者大为增高。
多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素μg/ml)已成为标准的操作、用该方法提取的质粒DNA量，对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。
(二)细菌的收获和裂解细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。
选择哪一种方法取决于3个因素:质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。
尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。
1)大质粒(大于15kb)容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。
将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解球形体。
这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌部把质粒释放出来所需要的作用力。
2)加200μl新配制的溶液Ⅱ。
溶液Ⅱ0.2mol/L NaOH(临用前用10mol/L贮存液现用现稀释)1%SDS盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合容物。
应确保离心管的整个表面均与溶液Ⅱ接触。
不要振荡，将离心管放置于冰上。
3)加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ溶液Ⅲ5mol/L乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml水28.5ml所配成的溶液对钾是3mol/L，对乙酸根是5mol/L。
盖紧管口，将管倒置后和地振荡10秒钟溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3-5分钟。
4)用微量离心机于4℃12 000g离心5分种，将上清转移到另一离心管中。
5)可做可不做:加等量酚:氯念，振荡混匀，用微量离心机于4 ℃以12000g离心2分钟，将上清转移到另一良心管中。
有些工作者认为不必用酚:氯仿进行抽提，然而由于一些未知的原因，省略这一步，往往会得到可耐受限制酶切反应的DNA。
6)用2倍休积的乙醇于室温沉淀双锭DNA。
振荡混合，于室温放置2分钟。
7)用微量离心机于4℃以12 000g离心5分钟。
8)小心吸去上清液，将离心管倒置于一纸巾上，以使所有液体流出。
再将附于管壁的液滴除尽。
除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，并用吸头接触液面。
当液体从管中吸出时，尽量使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。
9)用1ml70%乙醇于4℃洗涤双链DNA沉淀，按步骤8)所术方法去掉上清，在空气中使核酸沉淀干燥10分钟。
i.此法制备的高拷贝数质粒(如Xf3或pUC)，其产量一般约为:每毫升原细菌培养物3-5μg。
ii.如果要通过限制酶切割反应来分析DNA，可取1μl DNA溶液加到另一含8μl 水的微量离心管，加1μl 10×限制酶缓冲液和1单位所需限制酶，在适宜温育1-2小时。
将剩余的DNA贮存于-20℃。
iii.此方法按适当比例放大可适用于100ml细菌培养物:3.煮沸裂解1)将细菌沉淀，所得重悬于350μlSTET中。
STET0.1mol/L NaCL10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)1mmol/L EDTA(pH8.0)5% Triton X-1002)加25μl新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml，用10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)配制]，振荡3秒钟以混匀之。
如果溶淮中pH低于8.0，溶菌酶就不能有效发挥作用。
3)将离心管放入煮沸的水浴中，时间恰为40秒。
4)用微量离心机于室温以12 000g离心10分种。
5)用无菌牙签从微量离心管中去除细菌碎片。
6)在上清中加入40μl 5mol/L乙酸钠(pH5.2)和420μl异丙醇，振荡混匀，于室温放置5分钟。
7)用微量离心机于4℃以12 000g离心5分种，回收核酸沉淀。
8)小心吸去上清液，将离心管倒置于一纸巾上，以使所有液体流出。
再将附于管壁的液滴除尽。
除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。
当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管的液滴。
9)加1ml 70%乙醇，于4℃以12 000g离心2分钟。
2)可用更剧烈的方法来分离小质粒。
在加入EDTA后，有时还在加入溶菌酶后让细菌暴露于去污剂，通过煮沸或碱处理使之裂解。
这些处理可破坏碱基配对，故可使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。
当条件恢复正常时，质粒DNA链迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。
3)一些大肠杆菌菌株(如HB101的一些变种衍生株)用去污剂或加热裂解时可释放相对大量的糖类，当随后用氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心进行质粒纯化时它们会惹出麻烦。
糖类会在梯度中紧靠超螺旋质粒DNA所占位置形成一致密的、模糊的区带。
因此很难避免质粒DNA污染有糖类，而糖类可抑制多种限制酶的活性。
故从诸如HB101和TG1等大肠杆菌蓖株量制备质粒时，不宜使用煮沸法。