重组蛋白质表达与纯化

真核细胞表达体系
酵母细胞 昆虫细胞 植物细胞/组织 哺乳动物细胞/组织
酵母细胞
• 可生产分泌型蛋白；有天然立体结构， 有糖基化修饰功能；可进行染色体整合 型基因表达;
• 糖链与哺乳动物加工的不一致，培养上 清多糖浓度高;
• 商品化表达体系：
酿酒酵母（Saccharomyce cerevisiae）;
为什么要 • HA-tag (YPYDVPDYA)
• Flag-tag (DYKDDDDK)
加 tag ? • Myc-tag (EQKLISEEDL)
有前景的特殊用途的tag
• Biotinylation-tag
100多AA的结构域, 在大肠杆菌中被识别为生 物素化的位点. Promega的PinPointTM Xa-1; Invitrogen的pET104-DEST. • 未命名 DVEAWLGAR, 被用来和streptoavidin结合 (个人通讯)
• 无加糖修饰功能，培养液中蛋白酶活性 高，重组蛋白易受蛋白酶的水解；
• 质粒不稳定，已有商品化的表达载体 （枯草芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌）。
其他
•乳酸菌 (Lactic acid bacteria) •沙门氏菌 (Salmonella typhimurium) •苏云金杆菌
(Bacillus thuringiensis)
各种融合蛋白表达载体
• Protein A • GST（glutathione S-transferase） • CBD (chitin-binding domain, BioLabs;
cellulose-binding domain, Novagen) calmodulin-binding domain, Stratagene) • MBP (maltose-binding protein) • GFP (green fluorescence protein) • Thioredoxin **帮助二硫键形成 • Dsb (periplasmic enzyme DsbA, DsbC) ** 二硫键的形成与 • SUMO (small ubiquitin-related modifier) • KSI (ketosteroid isomerase) 基本上全部沉淀 可用亲和层析纯化 帮助可溶化 帮助分泌到周质
• BL21TrxB(DE3) : thioredoxin reductase 突变
• Origami(DE3): thioredoxin reductase/ glutathione reductase 双突变 适合带thioredoxin reductase的融合表达载体, 帮助形成更多的二硫键
The protein folding Problem
How to get to the bottom of the funnel? And,what is at the bottom?
包含体蛋白质的复性方法
• 透析法: 简单; 但费时, 费缓冲液, 蛋白质 量少，浓度不能过高(容易产生沉淀)
• 快速稀释法: 最常用的小规模复性方法; 但比较费时,费缓冲液, 蛋白质的浓度不能 高(容易产生沉淀)
单抗生产: 杂交瘤细胞 工业酶生产: 各种微生物
有可能以后能做到的事
• 在大肠杆菌中直接生产有活性的胰岛素 • 在大肠杆菌中生产人凝血IX因子 • 在大肠杆菌生产Calcitonin类C端酰胺化短肽 • 在大肠杆菌中进行蛋白质的糖基化修饰 • 在酵母中进行与哺乳动物细胞一致的糖基化 • 在鸡输卵管中进行与哺乳动物细胞一致的糖基化 • 提高乳腺分泌表达的Factor IX类因子的活性 • 在植物中得到与哺乳动物细胞一致的糖基化
3.GPI-Anchor糖基化: 蛋白质通过肽链的C端共价
连接的糖基磷脂酸肌醇锚定在膜脂上。
昆虫细胞
• 可以病毒感染的形式在成虫中生产， 也可在体外培养细胞生产蛋白;
• 适合分泌型和膜蛋白的表达，有加 糖修饰；
• 糖链有所区别，表达量有限； • 作为药物宿主细胞未被FDA认可
CHO细胞
• 可进行分泌表达，有天然 立体结构，加糖方式与人 体蛋白质完全一致；
鸟类输卵管组织
• 分泌生产有天然立体结构的蛋白质 到蛋清，产量高，容易贮存和运输， 分离纯化方便；
• 实验成本低，饲养费用低； • 加糖方式可能与人有所不同
体系选择
研究基因功能: 大肠杆菌, 裂殖酵母,昆虫细胞, CHO细胞
多肽药物生产: 大肠杆菌, 毕氏酵母, CHO细胞, 乳腺组织
疫苗: 大肠杆菌, 酵母, 大多数沿用细胞培养产物进行灭毒
第五章 重组蛋白质的 表达、复性与纯化
为什么要重组基因表达？
1. 蛋白质功能研究 2. 生物制药和疫苗生产 3. 疾病的基因治疗 4. 食品、化工用酶制剂 5. 抗虫、抗逆植物改良 6. 细胞代谢产物的富集
•基因表达体系及优劣势 •大肠杆菌表达体系 •蛋白质的复性 •工作中经常碰到的问题
基因表达体系
毕氏酵母 (Pichia pastoris);
裂殖酵母（Schizosaccharomyce pombe）
蛋白质糖基化的分类
1.O-糖基化: 糖链通过GalNAc连接在蛋白质的Ser
或Thr等侧链的羟基处
2.N-糖基化: 糖链连接在Asn-X-Ser或Asn-X-Thr
（X是除Pro以外的任何氨基酸）中Asn的氨基侧链处
1. 原核体系 2. 真核体系
大肠杆菌 (Escherichia coli)
• 遗传背景清楚，基因工程操 作方便，商品化表达载体种 类齐全，表达效率高；
• 基本不分泌，易形成包含体 (无正确折叠的立体结构)，无 加糖等修饰
枯草杆菌 (Bacillus subtilis)
• 分泌蛋白质能力强，一般有天然立体结 构；
• 样品没有很好细心去除不溶性物质 • 重复使用前树脂没有洗干净
• 蛋白质之间存在相互作用
• 可以提高盐浓度, 改变pH, 添加2-6 M尿素等方法来洗去杂蛋白质
是不是在进行复性时 用了Redox buffer
尝试用 Urea gradient /Gel filtration来解决
尽快用0.1 N HCl冲洗
用0.1 N NaOH / 0.1% SDS洗
主要是溶氧量的问题, 可以 通过在摇瓶中加入不同量的培 养基的方式来确定最佳体积。
细节决定成功。重组蛋白 质的表达、纯化和后加工的 各个细节对技术细节有高度 的要求，直接决定了产业化 的可行性。
• 表达量不够高，培养成本 较高
植物组织
• 植物可大面积种植，可以廉 价大规模生产；
• 转基因植物制作费时，表达 的组织特异性较难控制；
• 表达量较难提高，分离纯化 不方便
动物乳腺组织
• 分泌生产有天然立体结构和 活性的蛋白质至乳汁，产量 高，分离纯化方便，特别适 合药用蛋白的生产；
• 转基因动物制作花费巨大， 实验周期长
LEVLFQ↓GP
• Genenase I TM PGAAHY↓
• TEV protease: ENLYFQ ↓ G
特殊的表达用菌株
• BL21(DE3)/pLysS : 自身表达T7 RNA polymerase 适用pET系列等带T7启动子的载体
• M15/SG13009 : 自身表达T5 RNA polymerase 适用pQE系列等带T5启动子的载体
让表达产物可溶化
• 采用MBP融合 • 采用GST融合 • 采用CBD融合 • 采用thioredoxin融合 • 采用Origami等宿主菌 • 降低菌体培养的速度
温度 (15-30℃), 降低转速
让蛋白质分泌到间质去
• 采用CBD融合 (pET36/37) • 采用Dsb融合 (pET39/40) • 采用带pelB/ompT引导肽的载体
在大肠杆菌中表达 重组蛋白质
• 如果目的蛋白质有二硫键并需要 正确的立体结构, 尽可能进行可 溶性表达;
• 如果目的蛋白质没有二硫键或只 用来制备抗血清, 采用包含体表达 比较好;
• 如果目的多肽的分子量小于 10 kDa, 一定要进行融合表达
大肠杆菌表达载体分类
按蛋白质类型分
• 单纯表达: pJLA系列, 用NcoI/NdeI导入AUG的载体 • 融合表达: 融合各种tag, GST, CBD, MAL, GFP, etc • 分泌表达: pel/ompT分泌肽
• BR21CodonPlusRIL: 富含AT的真核生物基因的表达 • BR21CodonPlusRP: 富含GC的真核生物基因的表达
重要的原核表达质粒提供商
• Novagen • Stratagene • Invitrogen • BioLabs • Qiagen • Pharmacia • Promega • Clontech • Roche • Gibco/BRL
• 超滤透析法: 比较省缓冲液, 处理量大; 但费时, 要控制好蛋白质浓度
• 凝胶过滤法: 快速, 可重复性高, 不会产生 沉淀, 操作复杂一点
• 亲和层析复性法, 水相二相法, etc
工作中经常碰到的问题
• 表达量不够高； • 包含体在8M尿素中不能溶解； • 重组蛋白在大肠杆菌中表达的分子量偏小； • 带His-tag重组蛋白不吸附到Ni-chelating树脂上； • Ni-chelating分离纯化的效果不好； • GST融合蛋白不吸附到glutathione-Sepharose上； • 包含体来源的采用透析法或稀释法复性时全部沉淀； • Ni-chelating错用DTT后发生黑色沉淀该怎么办？ • 贵重的亲和层析树脂经常发生结块该怎么办？ • 某些表达载体的表达效率在放大培养时无法提高
(T7 promoter, Novagen公司)
• pQE系列 (T5 promoter, Qiagen公司)
• pMAL系列 (周质表达, BioLabs公司)
• pGEX系列 (GST融合表达, Pharmacia公司)
• pBAD系列 (Arabinose诱导型)
•pTYB系列 (CBD融合, 可以自我切割, BioLabs)
按启动子分
• lac及衍生的tac , trc, pac, rac等启动子 IPTG诱导
• lamda phage PL和PR 启动பைடு நூலகம் • T7 启动子
热诱导 IPTG诱导
• T5 启动子
IPTG诱导
• ara启动子
阿拉伯糖诱导
常用表达载体
• pJLA50X系列; pcDNAII; etc
• pET系列
尝试不同表达载体， 特别是N端有融合蛋 白的载体
• 是不是忘了加还原剂（DTT 或巯基乙醇）？
• 是不是在－20℃冻存过？ • 用4M盐酸胍试试
• 是不是酸性蛋白质？
• 是不是蛋白质的合成提前中止了？ （富 含Arg, Ile, Leu, Pro这几种氨基酸）
• 可以尝试用BL21 CodonPlus RIL 或 RP 作宿主菌 (Stratagen)；
• 未命名
一些病毒外壳蛋白的片段, 破坏细胞膜的结构导 致容易进入细胞
融合蛋白的专一性切割
• DTT:
intein的↓Cys
• 溴化氰:
Met↓
• Thrombin:
LVPR↓GS
• Factor Xa:
IEGR↓
• Enterokinase: DDDDK↓
• PreScissionTM protease:
(pET12/20/22)
• 采用带MBP融合 (pMAL载体, Biolabs) • 采用带SUMO融合
(pET SUMO, Invitrogen)
纯化方便: 先用 EDTA/蔗糖 溶液处理, 然后 5 mM MgSO4 洗出
各种用于抗体识别的标记
• His-tag (6-8 Histidine) • T7-tag (MASMTGGQQMG) • HSV-tag (QPELAPEDPED) • S-tag (KETAAKFERQHMDS) • VSV-G-tag (TTDIEMNRLGK)
• 使用C端带His-tag的融合表达载体（如 pET21, Novagen）以便纯化全长的融合 蛋白
• His-tag被操作过程混入的重金 属离子所饱和，可以通过添加 0.5 mM EDTA来去除重金属离 子的干扰；
• His-tag被包裹在不易和树脂发 生结合的位置（比较罕见）;
• 其他不明原因导致弱结合