重组蛋白纯化概述
重组蛋白[Recombinant Protein]纯化的基本策略
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重组蛋白[Recombinant Protein]纯化的基本策略一、融合表达蛋白的纯化：融合表达蛋白可以在原目标分子之外带有GST肽段或（His）6肽段，从而使得可以分别用Glutathione Sepharose凝胶或Chelating Sepharos e凝胶进行亲和色谱分子，一步可以达到~90%的纯度，经过特异蛋白酶切后，再进行离子交换及高分辨凝胶过滤一般便可以达到所需的纯度（95~99%）。
二、包含体表达蛋白的纯化：在E.coli系统表达重组蛋白，表达量高时，常形成包含体，包含体易于与细胞其他组分分离，但需要注意的是蛋白复性的步骤。
一般采用盐酸胍溶解包含体蛋白后，用稀释的办法进行复性，也可以利用凝胶过滤色谱进行复性（已有多种凝胶可以促进蛋白质的复性的报道）。
以下以rhGM-CSF（重组人粒细胞 -巨噬细胞集落刺激因子）的下游纯化工艺为例：E.coli细胞，超声破碎，离心收集包含体，用7mol/L盐酸胍溶解包含体蛋白，作1：70稀释使蛋白复性，加硫酸铵至一定浓度后，上样于 P henyl-Sepharose 6 FF（high sub）色谱柱，活性组分再上Q-Sepharo se FF进行离子交换，最后上Superdex 75 prep grade凝胶进行凝胶过滤色谱，最终获得了纯度较高的rhGM-CSF，同时，DNA及内毒素去除率均很高。
如下表所示：步骤体积（ml）蛋白（mg）内毒素（EU/ml）DNA（pg/ml）起始（复性样品）4344 490 421 180HIC疏水柱 880 220 243 0.46AIEX阴离子交换 620 88 251 0.14GF凝胶过滤 1045 62 9 0.08三、周质表达的蛋白的纯化：可用渗透压休克方法，使周质释放，然后利用扩张床技术将含有菌体的悬液直接上柱（STREAmlINE系列凝胶），菌体穿过而表达的蛋白上柱。
重组蛋白质的表达与纯化
重组蛋白质的表达与纯化重组蛋白质是指通过基因工程技术将目标蛋白的基因导入到宿主细胞中，使其在宿主中表达并纯化得到的蛋白质。
这项技术应用广泛，被广泛用于生物制药、医学研究以及工业生产等领域。
下面将详细介绍重组蛋白质的表达与纯化过程。
一、重组蛋白质表达过程1. 选择表达宿主重组蛋白质表达宿主的选择十分重要。
常用的表达宿主包括大肠杆菌（E. coli）、酵母（yeast）、哺乳动物细胞等。
不同的表达宿主具有不同的特点和适用范围。
例如，大肠杆菌是最常用的表达宿主之一，具有高表达水平、易操作、成本低等特点。
2.构建表达载体表达载体是将目标基因导入宿主细胞的载体。
常用的表达载体有质粒、病毒载体等。
质粒是最常用的表达载体，它可轻松被细菌胞内扩增，并在细胞内产生大量目标蛋白。
3.转染和表达将构建好的表达载体导入到宿主细胞中，实现转染。
转染有多种方法，如电穿孔法、化学法、微粒子轰击法等。
转染后，宿主细胞会开始表达目标基因，合成目标蛋白。
4.优化表达条件为了提高重组蛋白质的产量和纯度，需要对表达条件进行优化。
常见的优化方法包括调节培养基成分、改变培养条件、优化诱导剂浓度等。
二、重组蛋白质的纯化过程1.细胞破碎与分离表达宿主中产生的重组蛋白质往往与其他细胞组分混合在一起，需要通过细胞破碎与分离来获取目标蛋白。
细胞破碎方法包括机械法、超声法、高压法等。
分离方法包括离心、电泳、柱层析等。
2.柱层析柱层析是常用的蛋白质纯化方法之一，它基于蛋白质在柱中不同吸附剂上的亲和力差异来实现分离纯化。
常用的柱层析方法有离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析等。
3.其他纯化方法除了柱层析外，还有许多其他的纯化方法可供选择。
例如，凝胶电泳、过滤、冷冻干燥等。
这些方法通常用于进一步提纯和去除杂质，以获得纯度更高的重组蛋白质。
三、重组蛋白质应用与挑战重组蛋白质的应用广泛，涉及到生物制药、医学研究、农业等领域。
例如，通过重组蛋白质技术，可以生产用于治疗疾病的药物，如人胰岛素、白介素等。
重组蛋白纯化的计算
重组蛋白纯化的计算
一、重组蛋白纯化的计算
1.重组蛋白纯化的筛选
重组蛋白纯化的第一步是要筛选出适合用于纯化的样品，这一步一般从筛选质量优良的重组蛋白源开始。
一般情况下，标准的重组蛋白纯化包括：源蛋白、模板、载体和艾伯特反应器检测、阳性试剂盒检测、浓缩和洗涤等步骤。
筛选出优质的重组蛋白样品，可以保证重组蛋白纯化的效率和质量。
2.重组蛋白纯化的规划
经过筛选，可以得到符合要求的重组蛋白，接下来就是要开始计算重组蛋白纯化的参数，即对重组蛋白纯化技术进行规划，制定纯化步骤的方案。
在该步骤中，首先需要将重组蛋白纯化分为两类：一类是细胞体系，另一类是细胞外系统。
细胞体系可以采用相对简单的精细纯化步骤，可以清除胞浆的污染物，如腺病毒。
细胞外系统一般采用比较复杂的步骤，必须克服微生物污染、抗原结构不清晰和非特异性结合等问题。
3.重组蛋白纯化的操作
重组蛋白纯化的操作分为两个步骤，第一步是灵活选择、安装和操作相关仪器和技术，第二步是重组蛋白纯化的操作步骤。
仪器和技术一般有机械和化学仪器，根据重组蛋白纯化的具体步骤，可以根据具体任务自行选择仪器进行操作。
而重组蛋白纯化的操作步骤，一般涉及到蛋白浓缩、洗涤、活性测定、检测和确定收率等操作。
4.重组蛋白纯化总结
重组蛋白纯化是一个系统的方法，必须按照步骤精确纯化，以保证重组蛋白质量。
重组蛋白的纯化要从源蛋白筛选开始，通过对重组蛋白纯化的参数和操作方法的规划，可以更好地提高重组蛋白的质量和收率，从而达到节省时间和资源的目的。
重组蛋白的概述
重组蛋白的概述1.概述分离纯化组成了基因工程的下游处理（downstream processing）阶段，这一过程又和上游过程紧密相联系，上游过程的诸方面影响到下游的分离纯化，所以在进行目标蛋白质表达纯化时要统一考虑和整体设计，并充分考虑上游因素对下游的影响，如是否带有亲和标签，是否进行分泌表达。
目前应用最广泛的表达系统有三大类，分别是大肠杆菌表达系统、酵母表达系统和CHO细胞表达系统，不同的表达系统和培养方法显著影响下游的处理过程，目标蛋白表达是否形成包涵体，目标蛋白表达的定位（胞内、细胞内膜、周质空间和胞外），蛋白表达的量都依赖于所选择的表达系统。
选择将所表达的蛋白分泌到细胞外或周质空间可以避免破碎细胞的步骤，并且由于蛋白质种类少，目标蛋白容易纯化；而在细胞质内表达蛋白，可能是可溶性表达，可能形成包涵体，可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤，而包涵体易于分离，纯度较高，但回收具有生物活性的蛋白却变的相当困难，需要对聚集的蛋白进行变复性，通常活性蛋白的得率比较低，表1列出了不同策略对表达、纯化的影响，对于其中的有些缺点可以通过一定的方法进行克服和避免，如利用DNA重组技术给外源蛋白加上一个亲和纯化的标签，有助于可溶性外源蛋白的选择性纯化，并能保护目标蛋白不被降解（96）。
表 1 重组蛋白不同表达策略的优点和缺点表达策略优点缺点分泌表达至细胞外增强正确二硫键的形成降低蛋白酶对表达蛋白的降解可获得确定的N末端显著减少杂蛋白水平，简化纯化不需要细胞破碎表达水平低多数蛋白不能进行分泌表达表达蛋白需要进行浓缩细胞周质空间表达增强正确二硫键的形成可获得确定的N末端显著减少杂蛋白水平，简化纯化好些蛋白不能分泌进入周质空间没有大规模选择性的释放周质空间蛋白的技术周质蛋白酶可引起重组蛋白酶解胞内包涵体表达包涵体易于分离保护蛋白质不被降解蛋白质不具有活性对宿主细胞生长没有大的影响，通常可获得高的表达水平需要体外的折叠和溶解，得率较低具有不确定N末端胞内可溶性蛋白表达不需要体外溶解和折叠一般具有正确的结构和功能高水平的表达常难以得到需要复杂的纯化可发生蛋白质的酶解具有不确定的N末端在细胞的提取物中，除了目标蛋白外，还含有其它各种性质的蛋白、核酸、多糖等。
重组蛋白实验报告
一、实验目的本实验旨在通过基因工程手段，构建表达重组蛋白的载体，并在宿主细胞中进行表达，随后对表达的重组蛋白进行纯化，以获得高纯度的目标蛋白。
二、实验材料1. 实验试剂：- pET-28a载体- 目的基因片段- restriction enzymes (EcoRI, BamHI)- T4 DNA连接酶- DNA聚合酶- 限制性内切酶缓冲液- DNA分子量标准- 质粒提取试剂盒- 诱导剂 (IPTG)- 细胞培养试剂（DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶等）- 纯化柱（Ni柱）2. 实验仪器：- PCR仪- 紫外分光光度计- 凝胶电泳仪- Western Blot系统- 离心机- 流式细胞仪三、实验方法1. 基因克隆：- 使用PCR技术扩增目的基因片段，并使用EcoRI和BamHI进行酶切。
- 将酶切后的目的基因片段与pET-28a载体连接，并转化大肠杆菌感受态细胞。
- 对转化后的细胞进行PCR检测，筛选出含有目的基因的阳性克隆。
2. 重组蛋白表达：- 将阳性克隆接种于含抗生素的培养基中，培养至对数生长期。
- 加入IPTG诱导剂，调节IPTG浓度至0.1 mM，诱导表达重组蛋白。
- 收集细胞裂解物，进行SDS-PAGE电泳分析重组蛋白的表达情况。
3. 重组蛋白纯化：- 使用Ni柱对细胞裂解物进行亲和纯化。
- 通过梯度洗脱，收集含有重组蛋白的洗脱液。
- 使用Western Blot检测纯化蛋白的纯度。
4. 重组蛋白活性检测：- 使用流式细胞仪检测重组蛋白的活性，以验证其功能。
四、实验结果1. 基因克隆：- 成功构建了含有目的基因的重组质粒，经PCR和酶切验证无误。
2. 重组蛋白表达：- 在IPTG诱导下，成功表达出重组蛋白，SDS-PAGE电泳结果显示目的蛋白条带清晰。
3. 重组蛋白纯化：- 使用Ni柱纯化后，重组蛋白的纯度达到90%以上。
4. 重组蛋白活性检测：- 通过流式细胞仪检测，重组蛋白具有良好的活性。
重组蛋白质的分离纯化 (1)
重组蛋白质的分离纯化摘要：90年代以来基因重组技术得到很大的发展，基因工程产品的分离纯化的成本约占其全部成本的60%～80%，因此重组蛋白的分离纯化技术越来越重要。
本文主要介绍了沉淀、液液萃取、层析等常用分离重组蛋白方法的原理及应用，旨在为开展蛋白质的制备及其应用研究提供理论依据。
关键词：重组蛋白质；分离；纯化；沉淀；液液萃取；层析；包涵体随着基因重组技术的发展，出现了很多基因工程产品，而作为基因工程技术的下游工程中的基因重组蛋白的分离纯化技术越来越显示其重要性。
据有人统计,基因工程产品的分离纯化成本约占到其全部成本的60%～80%[1]。
由此可见产品的分离纯化是获得目的产物的关键一步，也是比较困难的一步，它标志着生物产业的高低。
纯化重组蛋白质和普通蛋白质的不同就在于要选择合适的表达系统，因为表达系统决定了细胞培养过程中产物的性质以及可能产生的杂蛋白，而纯化重组蛋白质的主要目的是去除杂蛋白质，通常对一种重组蛋白质的纯化会采用多个系统[2]。
但是重组蛋白有几种不同的表达形式，如细胞外的分泌表达；细胞内可溶性表达以及包涵体形式的存在，因此对于重组蛋白的纯化要依据其表达形式的不同，采取不同的纯化工艺。
与传统方式相似，重组蛋白的分离纯化也是利用其物理和化学性质的差异，即以分子的大小、形状、溶解度、等电点、亲疏水性以及与其它分子的亲和性等性质建立起来的。
目前主要的纯化方法有浓缩沉淀法，层析和电泳技术。
重组蛋白质在分离纯化的过程中，必须维持一定的浓度和生物活性形式，以及防止被降解。
因此从生物体中有效分离纯化重组蛋白质一直是个难题。
90 年代以来,国内外许多科学工作者在蛋白质分离纯化技术和工艺上进行了大量的研制和开发,将原有的纯化技术水平提高到一个新的高度。
本文将简单介绍一些传统的分离纯化方法，并介绍近10 年来重组蛋白分离纯化中的新进展和一些新出现的技术。
1 沉淀分离技术1.1 盐析法其原理是蛋白质在高浓度盐溶液中，随着盐浓度的逐渐增加，由于蛋白质水化膜被破坏、溶解度下降而从溶液中沉淀出来。
重组胶原蛋白纯化内容介绍
重组胶原蛋白纯化内容介绍
重组胶原蛋白的纯化主要包括以下步骤：
1. 发酵：通过基因工程技术将编码所需胶原蛋白的基因克隆进入适当的宿主细胞中，在培养基中进行发酵。
2. 细胞破碎：发酵完成后，对细胞进行破碎，使细胞壁破裂，释放出细胞内的胶原蛋白。
3. 初步分离：将破碎后的细胞和培养基中的其他成分进行初步分离，常用的方法有离心、过滤等。
4. 纯化：采用各种纯化技术，如凝胶过滤、离子交换、亲和色谱等，将胶原蛋白与其他杂质进行分离。
5. 浓缩：对纯化后的胶原蛋白进行浓缩，使其浓度更高。
6. 干燥：采用真空干燥或冷冻干燥等方法，将胶原蛋白从液态变为固态，便于保存和运输。
在纯化过程中，需要注意保持胶原蛋白的生物活性和天然结构，避免对其造成破坏。
同时，还需要对胶原蛋白进行质量检测，确保其纯度和稳定性符合要求。
重组蛋白质的表达纯化和结构鉴定
重组蛋白质的表达纯化和结构鉴定在生物医学领域中，重组蛋白质凭借其广泛的应用前景成为了研究热点。
然而，要想获得高纯度的重组蛋白质，并对其结构进行准确的鉴定，需要经历一系列复杂而细致的实验步骤。
本文将从表达、纯化和结构鉴定三个方面介绍重组蛋白质的研究过程。
一、表达重组蛋白质的表达是研究重组蛋白质最初的关键步骤之一。
通常采用大肠杆菌（Escherichia coli）作为表达宿主。
首先，需要将目标基因克隆至表达载体中，确保其与启动子、转录因子等相互配合，并携带一定的标签，如His 标签、GST 标签等。
接着，将修饰好的表达载体转化至大肠杆菌中，采用选择性培养基筛选出目标菌株。
最后，将筛选得到的菌株进行大规模培养，促使目标基因在细胞内表达。
二、纯化获得表达目标蛋白的菌株后，需要将蛋白从细胞中纯化出来。
首先，采用超声波或高压颠破细胞壁，释放出蛋白质。
接着，通过离心等手段将蛋白质与其他细胞组分分离。
此时，可以利用目标蛋白质特异性的亲和层析柱，如镍柱、葡聚糖柱等，吸附目标蛋白质，并通过逆向洗脱等方法，得到高纯度的目标蛋白质。
三、结构鉴定获得纯度较高的重组蛋白质后，需要对其结构进行进一步的鉴定。
常用的结构鉴定方法包括X射线晶体学、核磁共振（NMR）、电子显微镜等。
X射线晶体学是目前应用最广泛的方法，通过将蛋白质结晶并进行X射线衍射实验，得到蛋白质的高分辨率结构。
NMR则通过测量蛋白质中核自旋的相对位置和相互作用关系，获取蛋白质的三维结构信息。
电子显微镜是一种能够获得蛋白质高分辨率结构的技术，主要应用于研究大分子复合物和纤维形态的蛋白质。
除了上述常用技术外，近年来还涌现出一些新的结构鉴定方法，如质谱联用技术、光学显微镜成像、负染电镜等。
这些方法的出现，为蛋白质结构鉴定提供了更多的选择和便利。
由于篇幅所限，本文仅对重组蛋白质的表达、纯化和结构鉴定进行了简要介绍。
事实上，研究重组蛋白质的过程还包括目标基因的设计与合成、蛋白质的功能分析等环节。
重组蛋白质的表达与纯化技术
重组蛋白质的表达与纯化技术蛋白质是生命体活动的重要组成部分，对于生命体的生长、繁殖和免疫功能起着至关重要的作用。
而重组蛋白质则是利用基因工程技术，将人工合成的外源基因导入到特定的宿主细胞中，通过细胞表达和纯化技术得到的转录翻译产物。
这种技术不仅可以生产天然蛋白质，还可以生产人工合成的新型蛋白质，对于疾病的治疗和新药的研发有着重要的意义。
一、蛋白质表达技术蛋白质表达是获得大量重组蛋白质的重要方法。
选择适当的宿主细胞和表达载体是获得高水平表达的关键。
常用的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。
1.大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统具有生长快、表达量高等优点，广泛应用于重组蛋白质的表达和纯化。
其表达载体主要有pET和pBAD两种，pET系统一般用于产生可以形成包涵体的重组蛋白，pBAD系统用于在分泌表达中产生滞留蛋白。
2.昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统包括SF9、Sf21、HighFive等细胞系，常用的表达载体为pIB/V5-His、pFastBac等。
昆虫细胞表达系统通常用于表达大分子蛋白质，如糖蛋白、膜蛋白等。
3.哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统是目前表达规模最大、表达产物最接近人体蛋白质的一种表达系统。
其表达载体主要有pCDNA3.1、pCI 等，常用于表达与人体有关的蛋白质，如抗体、生长因子等。
二、蛋白质纯化技术蛋白纯化是重组蛋白质生产的重要环节，其目的是得到高质量的、纯度较高的蛋白质样品。
常见的纯化方法包括亲和层析法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法、逆流式层析法等。
1.亲和层析法亲和层析法是指因与载体中固定的亲和剂相互结合而纯化目标蛋白质的一种方法。
亲和剂通常是与目标蛋白质有特异性结合作用的化合物，如亲和标签、酶底物、抗体等。
常见的亲和层析方法有亲和柱层析、亲和膜层析等。
2.离子交换层析法离子交换层析法是根据蛋白质带有正或负电荷的差异性进行分离的一种方法。
离子交换层析的柱填充物常为离子交换树脂，其一般分为阴离子交换树脂和阳离子交换树脂两种。
11重组蛋白纯化——可溶性蛋白纯化(GST)
SOP6 谷胱甘肽亲和柱纯化带谷胱甘肽还原酶（GST)标签蛋白1.样品制备与“SOP Ni-NTA层析柱亲和纯化6His标签融合蛋白”中样品制备方法相同，裂解缓冲液（50mM Tris，150mM NaCl，2mM EDTA，0.5% NP-40，0.5% Triton X-100，0.5mM DTT ，1mM PMSF，1mM NaF ，protease inhibitors cocktail，pH7.5) 。
（PMSF，DTT，protease inhibitors cocktail在破菌前加入。
）适合于GST Pull- Down的细菌裂解液配方还有很多。
2.样品纯化Glutathione Beads亲和树脂灌装层析柱或直接使用Glutathione Beads预装柱，层析柱下端接核酸蛋白检测仪。
2.1 平衡层析柱至工作温度，纯化过程可在室温或4℃进行。
2.2 将层析柱固定在支架上，让其流尽树脂保护液，快流干的时候用至少5倍体积的平衡/洗涤缓冲液（50mM Tris，150mM NaCl，pH8.0)冲洗柱子。
2.3 制备的蛋白样品与平衡/洗涤缓冲液1:1混合，加到平衡好的Glutathione Beads中（保证目的蛋白与Glutathione Beads充分接触，提高目的蛋白的回收率），收集流穿液。
2.4 用10～15倍柱床体积的平衡/洗涤缓冲液清洗柱床，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗涤液。
2.5 使用5～10倍柱床体积的洗脱缓冲液（50mM Tris，150mM NaCl，10mM还原型谷胱甘肽，pH8.0），收集洗脱液，即目的蛋白组分。
还原型Glutathione易氧化，也容易影响pH,需现用现配,同时注意调pH 8.0。
3.SDS-PAGE检测分析纯化过程各组分纯化过程中得到的样品（包括上样前样品液、流穿液、洗杂液和顺次收集的洗脱蛋白）以及原始样品使用SDS-PAGE检测分析纯化效果。
基因工程的下游技术重组蛋白的表达、纯化和分析
基因工程的下游技术是实现基因功能研究和基因产品开发的关键环节，对于生 命科学研究、生物医药、农业、工业等领域具有重要意义。
基因工程下游技术的分类与流程
01
02
03
04
05
分类
1. 目的基因的克 2. 重组载体转化 3. 表达产物的分 4. 表达产物的分
隆和…
宿主…
离和…
析
基因工程下游技术主要包 括重组蛋白的表达、纯化 和分析等技术。
根据宿主细胞的偏好性， 对重组蛋白基因的密码子 进行优化，以提高重组蛋 白的表达水平。
载体优化
通过改造载体，增加重组 蛋白的表达量和稳定性， 如使用分泌型载体、融合 标签等。
培养条件优化
通过调整培养基成分、温 度、pH等培养条件，提高 重组蛋白的表达水平。
03 重组蛋白的纯化
重组蛋白的分离与纯化方法
详细描述
纯化是重组蛋白制备的关键步骤，通常采用多种分离纯化技术，如离心、过滤、沉淀、离子交换、亲和层析等， 以去除杂质并获得高纯度的目的蛋白。
案例二：重组蛋白的结构与功能分析
• 总结词：重组蛋白的结构与功能分析是了解蛋白性质和功能的重要手段，通过 X射线晶体学、核磁共振等技术，可以解析蛋白质的三维结构，进一步揭示其 生物学功能。
重组蛋白纯化的优化策略
选择合适的亲和配基
针对目的蛋白的特性选择特异性结合的配基，提高亲和 色谱的纯度。
结合多种分离方法
综合运用多种分离技术，如凝胶过滤色谱和反相色谱等 ，提高目的蛋白的纯度和回收率。
ABCD
优化离子交换色谱条件
通过调整离子强度、pH等参数，提高分辨率和纯度。
优化缓冲液和添加剂
选择合适的缓冲液和添加剂，如稳定剂、还原剂等，保 持目的蛋白的稳定性和活性。
xiap原核重组蛋白的表达和纯化
Caspases
• 现已确定至少存在11种caspase：
这些caspases中，caspase 1和caspase 11，以及可能还有caspase 4被认为不直接参 与凋亡信号的转导，它们主要参与白介素 前体的活化；而caspase 2，caspase 8， caspase 9和caspase 10参与细胞凋亡的起始； 参与细胞凋亡执行的则是caspase 3， caspase 6和caspase 7，其中caspase 3和7具 有相近的底物和抑制剂特异性，它们降解 PARP，DFF-45（DNA fragmentation factor-45
Ni-NTA柱改进方法洗脱后SDS-PAGE胶检测（增加了两个PH）
M：Marker A：蛋白原液 B：穿透液 W：清洗液 5.9：洗脱液ⅠpH 4.5:洗脱液ⅡpH 5.4、4.9洗脱液pH
总结：在增加两个不同pH洗脱液后，发现 在洗脱液pH为4.9、4.5时洗脱下来的目的蛋 白较标准方法多。但是纯化后的蛋白依然 有两条杂带，这有一条可能是His标签蛋白， 另外有可能是由于与目的蛋白等电点很接 近，没法用不同梯度的pH将其分离。
二、蛋白纯化条件优化
Ni-NTA柱标准方法洗脱跑胶检测 M：Marker A：蛋白原液 B：穿透液 W：清洗液 5.9：洗脱液ⅠpH 4.5:洗脱液ⅡpH
Ni-NTA柱改进方法洗脱后SDS-PAGE胶检测
M：Marker A：蛋白原液 B：穿透液 W：清洗液 5.9：洗脱液ⅠpH 4.5:洗脱液ⅡpH
• 蛋白纯化条件优化
重组蛋白的高效表达及纯化技术研究
重组蛋白的高效表达及纯化技术研究随着生物技术的发展，蛋白表达与纯化技术在医疗、工业以及科学研究等领域中扮演着越来越重要的角色。
其中，重组蛋白的高效表达及纯化技术是蛋白质学研究的关键环节之一。
本文旨在探讨目前被广泛应用的几种重组蛋白表达及纯化技术，以及它们的新进展与应用前景。
一、背景介绍重组蛋白指的是通过基因重组技术将人工合成的DNA片段引导到细胞中，使其在受到特定刺激后大量表达特定功能蛋白的一种新型蛋白质。
由于其具有高度专一性、易制备性以及更高的效力和安全性，越来越多的药物被开发为基于重组蛋白的生物制剂。
二、重组蛋白表达技术1. 原核表达系统原核表达系统是将DNA片段导入大肠杆菌等细菌中，在其形成菌落的过程中进行表达。
该系统的优点在于表达速度快、操作简便、表达产量高。
但同时，由于原核表达与真核细胞中的表达相比，它对于蛋白翻译辅助因子和蛋白修饰等生物特征的模拟程度较差，不利于蛋白的正确折叠，因此该系统表达的蛋白质通常需要经过重新折叠处理。
2. 原核表达系统与原核表达系统相比，真核表达系统更接近真实情况中的表达方式，对于全长的蛋白大多数时候能够实现正确的折叠。
在真核表达系统中，常用的系统包括昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母菌表达系统等。
其中，哺乳动物细胞表达系统能够实现高产量、高质量的蛋白质表达，因此被广泛应用于蛋白质制备。
三、重组蛋白纯化技术1. 亲和层析法亲和层析法是一种将目标蛋白质从混合物中分离出来的技术。
该技术的依据是一种特定的与目标蛋白质具有相互作用的配体分离柱。
在该技术中，目标蛋白质与配体分离柱上的特定功能团结合，非特异性的蛋白质能够在洗脱过程中被去除。
2. 总体分离法总体分离法是将目标蛋白从混合物中分离出来，采用离心、可溶性和非可溶性的分离方法。
其中，在采用可溶性分离的方式时，常用的方法有两相法、分配层析等。
四、新兴技术及应用前景近年来，3D打印技术的应用逐渐渗透到生物医疗领域，并开始用于制备组织工程器官和人造蛋白质等领域。
重组蛋白的表达与纯化技术研究
重组蛋白的表达与纯化技术研究随着基因工程和生物技术的发展，重组蛋白的表达及纯化技术在生物医药领域得到了广泛应用。
重组蛋白是通过将目标基因转移到宿主表达系统中，利用宿主细胞表达并合成特定蛋白的技术。
表达后的蛋白需要经过纯化、鉴定和活性分析，以确保获得高纯度和高活性的蛋白。
本文将介绍重组蛋白的表达与纯化技术研究的相关内容。
重组蛋白表达技术是通过将目标基因克隆到表达载体中，然后将表达载体转入宿主细胞中进行表达。
常用的表达系统包括大肠杆菌、酿酒酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。
在选择表达载体时，需要考虑载体的复制数、启动子的强度和宿主细胞的适应性。
而在选择宿主细胞时，需要考虑宿主细胞的生长特性、表达能力以及宿主细胞的酶切位点等因素。
表达载体和宿主细胞的选择将直接影响重组蛋白的表达水平和纯化效果。
在重组蛋白的表达过程中，除了选择适合的表达系统外，还需要优化培养条件和表达工艺。
培养基的组成、培养温度、培养时间、诱导条件等因素都会影响蛋白的表达水平和纯度。
常见的优化方法包括调整培养基的成分、优化培养条件和诱导条件、构建工程菌株以及使用辅助因子等。
通过合理的优化，可以提高蛋白的表达水平和纯度，为后续的纯化工作奠定基础。
重组蛋白的纯化是确保蛋白质高纯度和高活性的关键步骤。
常见的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、逆流色谱和层流洗脱等技术。
亲和层析是通过目标蛋白与特异性结合剂之间的亲和力选择性地捕获目标蛋白。
离子交换层析是利用蛋白质与带电离子交换剂间的相互作用进行纯化。
凝胶过滤层析则是根据蛋白分子大小进行分离纯化。
逆流色谱和层流洗脱则是利用目标蛋白与静电荷间的相互作用进行分离。
通过合理选择和组合这些方法，可以获得高纯度和高活性的重组蛋白。
在纯化过程中，还需要进行蛋白质的结构鉴定和活性分析。
结构鉴定可以通过质谱分析、核磁共振、X射线晶体学等技术来实现。
活性分析则是通过特定的活性测定方法来验证蛋白的功能和活性。
重组蛋白简介介绍
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重组蛋白简介介绍
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• 重组蛋白概述 • 重组蛋白的生产与制备 • 重组蛋白的应用领域 • 重组蛋白的研究进展与前景
01
重组蛋白概述
定义与概念
定义
重组蛋白是指利用基因工程技术 ，将目标基因片段插入到合适的 表达载体中，并在宿主细胞中进 行表达、纯化所获得的蛋白质。
概念
重组蛋白技术允许研究人员在体 外生产大量具有特定功能的蛋白 质，以供基础研究、药物开发、 生物治疗等多种应用。
。
重组蛋白的纯化与鉴定
分离纯化：利用色谱、电泳、 沉淀等技术，将重组蛋白从细 胞裂解液中分离出来，去除杂
质和其他蛋白。
蛋白质鉴定：通过质谱、氨基 酸测序、免疫学等方法，确认 重组蛋白的身份、结构和纯度
。
活性检测：采用体外酶活性测 定、细胞实验、动物实验等手 段，评价重组蛋白的生物活性 和功能。
经过上述生产与制备过程，可 以获得具有预期功能的重组蛋 白，为生物医学、生物技术等 领域的研究和应用提供有力支 持。
近年来，重组蛋白技术取得了显著的 研究成果，成功应用于医药、农业、 工业等领域，为生产和生活带来了诸 多便利。
研究热点
当前的研究热点主要集中在蛋白质工 程、基因编辑技术以及高通量表达筛 选等方面，以提高重组蛋白的产量、 稳定性和活性。
重组蛋白技术的挑战与发展方向
技术挑战
尽管重组蛋白技术取得了很大进展，但仍面临一些技术挑战 ，如蛋白质折叠与稳定性、表达系统的选择与优化、大规模 生产成本降低等。
发展方向
为解决这些挑战，未来的发展方向包括：1）改进表达系统， 如开发新型宿主细胞或优化现有表达系统；2）提高蛋白质折 叠与稳定性的预测与设计能力；3）采用高通量技术，加速重 组蛋白的筛选与优化过程。
重组蛋白的提取纯化原理
重组蛋白的提取纯化原理重组蛋白是指通过基因工程技术将外源基因导入到宿主细胞中，使其表达出目标蛋白。
重组蛋白具有广泛的应用价值，如药物研发、生物制药、农业生产等领域。
然而，重组蛋白的提取纯化是制约其应用的关键环节之一。
本文将从不同的角度介绍重组蛋白的提取纯化原理。
一、基于物理性质的提取纯化原理1. 离子交换层析离子交换层析是一种基于蛋白质表面电荷的分离技术。
其原理是利用离子交换树脂的静电吸附作用，将带有相反电荷的蛋白质分离出来。
离子交换层析适用于分离电荷差异较大的蛋白质，但对于电荷差异较小的蛋白质分离效果较差。
2. 凝胶过滤层析凝胶过滤层析是一种基于蛋白质分子大小的分离技术。
其原理是利用不同孔径大小的凝胶过滤树脂，将分子大小不同的蛋白质分离出来。
凝胶过滤层析适用于分离分子大小差异较大的蛋白质，但对于分子大小相近的蛋白质分离效果较差。
3. 亲和层析亲和层析是一种基于蛋白质与配体之间的特异性结合作用的分离技术。
其原理是利用亲和树脂上的配体与目标蛋白之间的特异性结合作用，将目标蛋白分离出来。
亲和层析适用于分离具有特异性结合能力的蛋白质，但对于没有特异性结合能力的蛋白质分离效果较差。
二、基于化学性质的提取纯化原理1. 氢氧化铝沉淀法氢氧化铝沉淀法是一种基于蛋白质表面亲水性的分离技术。
其原理是利用氢氧化铝与蛋白质表面的羧基和氨基之间的静电吸附作用，将蛋白质分离出来。
氢氧化铝沉淀法适用于分离亲水性较强的蛋白质，但对于亲水性较弱的蛋白质分离效果较差。
2. 盐析法盐析法是一种基于蛋白质表面电荷和溶液离子强度的分离技术。
其原理是利用盐对蛋白质表面电荷的影响，使蛋白质在高盐浓度下发生沉淀，从而分离出来。
盐析法适用于分离电荷差异较大的蛋白质，但对于电荷差异较小的蛋白质分离效果较差。
三、基于生物学性质的提取纯化原理1. 亲和纯化法亲和纯化法是一种基于蛋白质与其特异性结合分子之间的亲和性分离技术。
其原理是利用特异性结合分子与目标蛋白之间的亲和性结合作用，将目标蛋白分离出来。
重组蛋白的表达与分离纯化
基因工程重组蛋白的表达与分离纯化实验目的：1.了解基因工程重组表达载体的构建和筛选方法；2.掌握重组蛋白诱导表达的机理；3.掌握蛋白的分离纯化方法，并学会使用SDS-蛋白质凝胶电泳；实验原理：将外源基因克隆在含有lac启动子的pET-30表达载体中，让其在E.coli中表达。
先让宿主菌生长，lacI产生的阻遏蛋白与lacI操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录与表达，此时宿主菌正常生长。
然后向培养基中加入lac操纵子的诱导物IPTG，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则DNA外源基因大量转录并高效表达。
表达蛋白可经SDS-PAGE检测。
实验器材：1.仪器：高速冷冻离心机、恒温培养箱、高压灭菌锅、SDS-凝胶电泳仪、水浴锅、抽滤装置、AKTA液相色谱仪等；2.材料：LB培养基、溶菌酶、缓冲液A和B、氨苄青霉素、IPTG诱导剂、10%SDS等；实验内容：1.灭菌：①配置LB培养基20 ml*2 +100 ml*6(配方：酵母粉 0.5%，NaCl 1%，胰蛋白胨1%)；②黄、蓝枪头各一盒；2.菌体活化及扩培：①每瓶20 ml LB培养基中加入20 ul Amp后，再加入30~40 ul DH5α菌液，置于37℃恒温箱内，培养12~16 h；②活化后，在六瓶100 ml LB培养基中分别加入100 ul Amp后，再从20 ml活化后的菌液中取2 ml，置于37℃恒温箱内扩大培养，至少培养2.5 h以后加入IPTG 200ul，37℃，培养14~16h；3.细胞破碎及蛋白分离：①将菌液用大离心管收集，配平后，4000r/min，离心15 min，收集菌体；②用20 ml BufferA重悬菌体，4000r/min，再离心15 min，收集菌体；③用4 ml BufferA重悬菌体，加入溶菌酶40 ul混匀，静置15min；④再加入4 ml BufferB，混匀，75℃水浴保温1 h；⑤用高速冷冻离心机在4℃的条件下，8000r/min，离心20 min，收集上清液；⑥将上清液分装入几个浓缩管中，4℃，3000r/min浓缩一段时间至终体积为5-10ml，做好标记，备用；⑦实验过程中，配置五种AKTA液相色谱仪所需液体，并抽滤2遍；4.AKTA液相色谱分析及SDS凝胶电泳：①首先学习AKTA仪器的相关使用方法和注意事项，对仪器进行排气，平衡缓冲液冲洗等操作(该部分由老师操作演示)；②取5 ml浓缩后的液体过滤后上样，观察屏幕上紫外吸收曲线的变化，适时用离心管收集每个峰的样品，做好标号，备用。
基因工程的下游技术重组蛋白的表达、纯化和分析
2. 亲和层析柱的安装 把层析柱固定在铁支架上，柱下端出 口封闭。加入少量的无离子水，排去下端 的空气泡。取出20%乙醇浸泡的螯合凝胶 4mL到烧杯中，加入少量的无离子水制成 糊状，沿着贴紧柱内壁的玻璃棒把糊状凝 胶倒进柱内，打开下端的排水口，让亲和 凝胶剂随水流自然沉下。亲和层析剂为 45mL。
3. 1#：接50μL空载工程菌（含pUC18）过夜培 养物，25-28℃培养10 h-12h； 2# ：接 50μL 重组菌（含 pGFPuv ）过夜培养 物，25-28℃培养10 h-12h； 3#：接50μL重组菌（含pGFPuv ）过夜培养 物， 37℃培养至 O.D600 约为 0.5 （约 3h-4h) ， 然后加入20%葡萄糖50μL至终浓度为0.2%， 及100mM IPTG 5μL至终浓度为0.1mM，2528℃培养8h-10h或过夜； 6#：接500μL重组菌（含pGFPuv）过夜培养 物， 37℃培养至 O.D600 约为 0.5 （约 3h-4h) ， 然后只加入 100mM IPTG 50μL 至终浓度为 0.1 mM，25-28℃培养8h-10h或过夜。
一．实验目的 了解和掌握IPTG诱导表达的原理。 了解降解物阻遏的现象及其机理。
二．实验原理
操纵子是基因表达的协调单位。通常由2 个以上功能相关的结构基因以及一些调节 序列（如启动子序列、操纵序列等）组成。
乳糖操纵子由三个结构基因 Z 、 Y 、 A 和 操纵序列、启动子、 CAP 结合位点等调 节序列组成。
四．实验仪器
超净工作台、 恒温摇床、离心机等。
五．操作步骤 1. 挑取含pUC18质粒工程菌及含pGFPuv质 粒工程菌单菌落，分别接种于含氨苄青霉 （终浓度为100μg/mL，以下同)的5mL的 LB培养基中，于37℃、250rpm过夜培养 12h-14h至对数生长期。 2. 取 3 支已灭菌的大试管，分别加入 5mL 含 有氨苄青霉素的 LB 培养液，编号为 1# ， 2#，3#，另取一个250mL的灭菌三角瓶， 编号为6#，加入50mL含氨苄青霉素的 LB 培养液。
重组蛋白纯化工艺建立
重组蛋白纯化工艺建立
重组蛋白纯化工艺的建立是一个涉及多个步骤的复杂过程。
以下是一个基本的步骤概述：
1. 设计和构建表达载体：首先，需要设计和构建一个包含目标基因的表达载体。
这个载体通常包括一个启动子、目标基因和一个终止子。
启动子和终止子用于控制目标基因的表达，而目标基因则编码所需的重组蛋白。
2. 转化和筛选宿主细胞：将构建好的表达载体转化到适当的宿主细胞中，并进行筛选，以获得能够高效表达目标蛋白的细胞株。
3. 蛋白表达和纯化：在选定的宿主细胞中诱导目标蛋白的表达，并通过离心、过滤等步骤收集细胞或上清液。
然后，利用适当的纯化方法，如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等，去除杂质，获得纯度较高的重组蛋白。
4. 纯化工艺优化：对纯化工艺进行优化，以提高目标蛋白的纯度、产量和稳定性。
这可能涉及改变纯化步骤的顺序、调整纯化条件（如pH值、离子强度等）或使用不同的纯化方法等。
5. 质量控制：对纯化后的重组蛋白进行质量控制，以确保其符合预期的纯度、活性和稳定性等要求。
这可能包括使用SDS-PAGE、Western blot等方法检测蛋白的纯度和大小，以及使用生物活性测定等方法检测蛋白的活性。
需要注意的是，具体的纯化工艺会因目标蛋白的性质、宿主细胞的选择以及下游应用的需求而有所不同。
因此，在实际操作中，需要根据具体情况进行灵活调整和优化。
生物化学中的蛋白质表达和纯化
生物化学中的蛋白质表达和纯化蛋白质是细胞中最基本的生物大分子之一，具有重要的结构和功能作用。
在生化实验研究中，常常需要大量的蛋白质作为实验材料。
蛋白质表达和纯化技术是生物化学研究中的关键技术之一。
本文将简要介绍蛋白质表达和纯化的原理和方法。
一、蛋白质表达技术蛋白质表达是将目的基因转录成RNA后再翻译成蛋白质的过程。
蛋白质表达主要有原核细胞和真核细胞两种方法。
原核细胞表达系统主要利用大肠杆菌，真核细胞表达系统则使用哺乳动物细胞，其主要的表达技术有以下几种：（一）重组蛋白质大规模表达重组蛋白质是指人为构建的同源或异源蛋白序列，利用基因工程技术将其导入到表达宿主中进行高效表达的蛋白质。
大肠杆菌是目前最常用的宿主。
一般来说，要将目的基因插入到选择性表达载体中，选用合适的启动子和终止子，将目的蛋白质与标签结合。
表达宿主随后被转化，蛋白质在生长过程中表达出来，随后进行纯化和鉴定。
（二）GST融合蛋白表达GST融合蛋白是利用GST (glutathione S-transferase)标签的蛋白质，将GST和目的蛋白质融合在一起表达，然后通过Glutathione 亲和层析纯化方法纯化目的蛋白质。
GST融合蛋白可以提高目的蛋白质的稳定性和可溶性，使得其在细胞内表达更加稳定。
（三）His标签蛋白表达His标签是一种聚组氨酸标签，可以与Ni2+螯合，因此可采用Ni2+亲和层析的方法纯化。
His标签融合蛋白表达时选择了较少的氨基酸标签，对目标蛋白的生物学性质和功能影响较小。
二、蛋白质纯化技术蛋白质表达和纯化是蛋白质生物化学研究的关键。
通常情况下，表达宿主细胞中的蛋白质必须经过纯化才能得到纯净的蛋白质，获得足够高纯度的蛋白质可用于测定其结构和功能。
（一）离子交换层析法离子交换层析法是利用蛋白质负荷（或正荷）的离子性质与相应的离子交换质团之间进行选择性结合的纯化方法。
离子交换层析法分为阴离子交换层析和阳离子交换层析两种。
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重组蛋白纯化概述蛋白的分离纯化是生物工程下游阶段一个比较重要的部分，尤其在基因工程重组蛋白的分离纯化中，上游过程的许多因素会直接影响到下游蛋白的分离，充分利用上游对下游的影响，对蛋白的纯化做一个全面的考虑和整体的设计。
是否带有亲和标签，His标签，GST标签等，不同的亲和标签选择不同的纯化方案；可能是可溶性表达，可能形成包涵体，可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤，而包涵体易于分离，纯度较高，但回收具有生物活性的蛋白却变的相当困难，需要对聚集的蛋白进行变复性，通常活性蛋白的得率比较低；是否对宿主细胞具有毒性，从而选择抗毒性的表达系统；怎样选择表达系统，是大肠杆菌表达系统，酵母表达系统还是CHO细胞表达系统，不同的表达系统和培养方法显著影响下游的处理过程，目标蛋白表达的定位（胞内、细胞内膜、周质空间和胞外），蛋白表达的量都依赖于所选择的表达系统；蛋白的化学性质，是否容易被蛋白酶降解，是否会和一些金属离子，化学成分发生反应；蛋白的物理性质，是否对温度敏感等。
从蛋白基因的获取，蛋白基因的克隆，蛋白的表达，做好一个整体的规划，将对纯化工作的方便快捷高效带来关键的影响。
基因工程构建的纯化标记有很多，通过改变 cDNA在被表达的蛋白的氨基端或羧基端加入少许几个额外氨基酸，这个加入的标记可用来作为一个有效的纯化依据。
GST融合载体，蛋白A融合载体，含组氨酸标记（Histidine-tagged）等，不同亲和标签的蛋白有不同的纯化方案。
一．含组氨酸标记（Histidine-tagged）重组蛋白的纯化（一）选择亲和标签时需要考虑的因素亲和标签与目标蛋白之间的作用是相互的，需要综合的考虑，既要考虑到对目标蛋白结构功能的影响，又要考虑到对标签与其配体亲和作用的影响，以及实际的用途。
（1）亲和标签是否会影响到目标蛋白的结构和功能，大多数情况首选短的多肽标签，这是因为短的肽标签对目标蛋白的结构影响最小，而大的亲和标签可能限制重组蛋白的折叠，影响蛋白质的生物学功能。
（2）亲和标签对蛋白质稳定性的影响，亲和标签的加入是否会影响到目标蛋白的真确折叠，是促进目标蛋白的可溶性，还是容易形成包涵体，会不会造成氨基酸C和N段地破坏，使目的蛋白表达不完全。
（3）亲和标签所融合的位置，亲和标签可以加在N端，可以加在C端，也进行串联。
多数情况下蛋白质的N端区域对蛋白质的功能不是太重要，所以在N端进行融合标签的融合常常能保留蛋白质的生物学功能。
由于N端DNA序列对蛋白质的转录翻译影响较大，所以标签加在N端对蛋白质的表达水平影响更大，优化标签的mRNA结构可使表达水平提高。
可能有些蛋白纯化后需要去除亲和标签C端融合在去除融合标签后在目标蛋白的C端会有几个氨基酸残留，而小心的选择剪切特异性的氨基酸序列就可以在去除N端亲和标签后得到天然的目标蛋白。
（4）亲和洗脱的条件，有些条件比较温和，而有些条件较为剧烈，选择的亲和表达系统应该不使目标蛋白变性。
（二）含组氨酸蛋白纯化的依据蛋白质表面的组氨酸与多种过渡金属离子如Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，Fe3+形成配位相互作用，从而能够吸附富含这类氨基酸的蛋白质，从而达到分离纯化的目的。
因此，固定有这些金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择性地纯化这类含有多个组氨酸的蛋白以及多肽和核苷酸。
半胱氨酸和色氨酸与固定金属离子结合力要远小于组氨酸残基，对纯化影响不大。
螯合物的稳定性受单个组氨酸和半胱氨酸解离常数所控制，从而亦受流动相的pH和温度的影响，控制条件可以使不同蛋白质相互分离。
蛋白样品的预处理1．诱导方式:诱导方式的选择上，为了得到真确折叠的目的蛋白，表达菌种的生长情况，菌种是否健壮，是否是单克隆菌种，菌体的浓度是否适合诱导，生长状态不好的表达菌，一方面会造成目的蛋白的错误折叠，造成蛋白大小，形态等发生改变，另一方面会因为IPTG的加入，导致菌体的死亡或者降解。
低温度诱导有助于蛋白二硫键的正确折叠，但对于高温表达的蛋白不适合低温状态，温度过高容易导致包涵体的形成。
诱导剂：基因的诱导表达基于乳糖操纵子调节机制，没有乳糖存在的时候，阻碍物基因产生阻碍蛋白，阻碍蛋白和操纵子结合，抑制基因的表达；当有乳糖存在的时候，B-半乳糖苷酶和乳糖作用产生异半乳糖，异半乳糖和阻碍蛋白结合，解除抑制，激活基因，开始表达蛋白。
诱导的浓度的高低对目的蛋白的表达也会有产生影响。
BL21（DE3）, Rosetta(DE3)等大肠杆菌表达系统这些菌株都敲除了蛋白酶，并溶源了噬菌体DE3。
DE3是的一种衍生λ噬菌体，带有噬菌体21抗性区和lacI基因，lac UV5启动子，以及 T7 RNA聚合酶基因。
这一区段被插入int 基因，因此阻止了DE3在没有辅助噬菌体时整合到染色体上或从染色体切出。
一旦形成DE3溶原状态，就只有受IPTG诱导的lac UV5启动子指导T7 RNA聚合酶基因转录，在溶原培养体系中加入IPTG诱导T7 RNA聚合酶生产，继而质粒上的目的DNA 开始转录。
3.抽提方式：进行破壁之前应该选择合适的缓冲组分，合适的pH 要结合酸碱溶液的滴定调节，尽量低的离子强度，加入一些稳定成分稳定成分，EDTA螯合重金属离子，Triton X-100，NP40等表面活性剂，保护非极性表面等。
4.确定蛋白质样品的形态，浓度黏度体积。
有时候得到粗蛋白的时候，会观是否符合目的蛋白的一些性质，确保得到是目标蛋白。
粗蛋白的形态有没有明显的差异，浓度是否符合纯化的要求，是否有较多的干扰物质，核酸色素强结合成分。
5.优化表达条件（1）重组蛋白不表达或者表达量低。
如果重组蛋白不表达（包含体和可溶蛋白都没有）通过改变诱导剂浓度，诱导温度，时间等都不表达的时候，然后尝试更换菌株、质粒载体。
降低诱导后培养温度。
重组蛋白表达得越慢，其折叠效果就越好，大肠杆菌在4℃时依然可以表达重组蛋白，而将培养温度降低至25-30℃就能显著改善蛋白折叠。
此方法不适用于温度诱导的重组蛋白表达；减少诱导剂。
诱导剂浓度可以降低至1/10；选用Lac渗透酶缺陷型菌株，如Tuner、Rosetta等，也有很好的效果。
这类菌株能够使进入每个细胞的诱导剂浓度相同。
重组蛋白在所有细胞中的表达水平相当时，减少诱导剂的效果更好。
（2）检查密码子构成，使其适应宿主菌的密码子偏好。
稀有密码子，尤其是位于重组蛋白N端的和大量集中的稀有密码子，会降低mRNA稳定性，显著降低翻译速度，引起翻译提前中止、翻译移码和突变。
将这些稀有密码子（尤其是N 端！）突变为宿主偏好的密码子，能够显著提高表达水平。
改善蛋白稳定性。
能够引起蛋白降解的因素很多，从蛋白自身性质到宿主性质不一而足，如果重组蛋白在表达时就被降解，表达量和稳定性就会受到很大影响。
在大肠杆菌中表达重组蛋白，需要牢记N端法则：当N端第二个残基是Leu、Arg、Lys、Phe、Tyr和Trp时，重组蛋白半衰期只有2分钟，而小侧链的氨基酸残基，如Ala，则可以提高蛋白稳定性。
因此在设计载体时，要特别注意第二个密码子，避免上述残基的出现。
处理高毒性蛋白：毒性极高的重组蛋白，其本底表达就会杀死原核宿主，质粒容易丢失，使其在大肠杆菌中很难得到高表达。
采用可表达T7溶菌酶的宿主。
T7溶菌酶是T7RNA聚合酶的抑制剂，采用含有T7溶菌酶质粒的宿主，如pLysS，可以降低重组蛋白在大肠杆菌快速生长期的本底表达量，在受到IPTG诱导时也能较好的表达蛋白。
（3）包涵体表达：包涵体蛋白折叠混乱、二硫键配对混乱、没有生物活性、变复性条件需要长时间摸索等，即使包涵体蛋白成功复性，其均一性和活性依然备受质疑。
但是包涵体表达也有其优势：能够很轻松的获得超高的表达量，不可溶的重组蛋白不会被宿主内的蛋白酶降解，重组蛋白的毒性被大大抑制，杂蛋白含量低（~10%），容易纯化等。
由于这些优点以及蛋白质复性条件的不断发展，表达包涵体蛋白逐渐为人们所接受，成为重组蛋白表达的一个常用方案。
与可溶蛋白相反，提高培养温度、延长培养时间、在较高的菌密度下诱导都有利于包涵体的形成；在破菌和变性溶解时加入还原剂能够打开错配的二硫键；在复性液中加入二硫键异构酶、脯氨酸异构酶、分子伴侣和蛋白的辅助因子可以帮助重组蛋白折叠；精氨酸和高分子量PEG能减轻蛋白分子的聚集；尝试多种物理手段，如透析、快速稀释和柱上复性等，有时对复性有奇效。
包涵体的表达相对简单，但其复性过程仍是依赖经验的，没有通用的方法可以套用。
（三）层析条件的选择1.离子交换剂的选择已知等电点的物质, 在高于其等电点的pH用阴离子交换剂, 在低于其等电点的pH用阳离子交换剂。
同时要考虑到该物质的稳定性及溶解度, 选择适当的pH 范围。
图1 蛋白质净电荷与pH的关系参照电泳的结果。
在中性或偏碱性条件下进行电泳, 向阳极移动较快的物质, 在同样条件下可被阴离子交换剂吸附, 向阴极移动或向阳极移动较慢的可被阳离子交换剂吸附。
2.缓冲液的选择（1）选用的pH 决定于被分离物质的等电点, 以及稳定性和溶解度。
选用的缓冲液离子, 其pK 值要接近于所要用的pH 值, 这样有较高的级冲能力, 可避免因缓冲离于与吸附剂相互作用而产生pH 改变。
（2）缓冲液离子应不影响被分离物的活性或干扰其测定。
应不影响被测物的溶解度, 或会加入一些必要的保护剂稳定目的蛋白，防止变性或者沉淀。
（3）对于阳离子交换剂应使用阴离子型级冲液(如磷酸、醋酸等); 用阴离子交换剂时应使用阳离子型级冲液(如Tr is 、胺盐、吡啶等), 以避免缓冲液离子被吸附而发生pH 改变。
（四）操作步骤1.离子交换剂的处理（1）不同的离子交换剂需要不同的处理，亲和层析填料，需要一整套的化学工艺，使其结合上一些亲和配基，例如用于纯化带His标签的Ni2+-sephrose 4B 就是将琼脂搪用环氧抓丙烷交联并加以适当处理而制成的，具有配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用强等特点。
（2）阴离子交换剂和阳离子交换剂的处理：采用碱一酸一碱的顺序洗。
将干纤维素粉洒在0.5M NaOH 溶液中(每克千纤维素粉约15 毫升碱液)使自然沉降, 浸泡约30分钟, 用耐酸漏斗抽滤。
如碱液呈黄色, 可重复洗至无色。
用水充分洗净(用pH试纸试呈中性)。
再用0.5 M HCl 洗, 再水洗, 再用N aOH 洗, 最后充分用水洗。
碱洗时难过薄, 可加NaCl至0.5M。
如仍难过滤, 可用10 倍水稀释, 使其沉降, 倾去上清液。
(3)调节到所需p H 用上述条件的起始缓冲液充分洗涤使达到所要的p H 和盐浓度。
2.装柱根据蛋白表达量的多少，装入适当的填料，用起始缓冲液充分平衡，用时候为了纯粹的收集蛋白，装柱没有太多的要求，当然应根据不同的实验目的采用的方法不一样，相对于需要蛋白紫外吸收图谱的，需要分辨率较好的或者是过分子筛的，装柱应该注意，装柱时的注意事项如下:(l)交换剂悬浮液的浓度要适当, 细拉子可以浓一些, 加抽滤滤饼体积一半的缓冲液即可。