大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化(汇编)
超声破碎
大肠杆菌表达外源蛋白，在超声破碎的时候，用含有1%triton-X-100的PBS悬浮，然后超声的效果较好，1%triton-X-100的作用还是很明显的，对其他的一些细菌同样起作用，比如链霉菌。
细菌沉淀直接加样品1buffer，再加5ul的巯基乙醇，混匀，离心，煮沸10min，直接上样，染色脱色步骤如下:将胶放入适量的染色液微波炉里加热1min(下次适当补点醋酸即可),将染色液换成大量的水(自来水即可)在微波炉煮10min 就可以。
在表达重组蛋白后超声波破碎细胞，采用冰浴，400w，破2s停1s，但是不一会就产生大量泡沫，影响了破碎功率，pbs和tris缓冲液都是这样，最后都是破碎不完全，而我的目的蛋白就在这些未破碎的细胞中。
1*会产生气泡是因为你的探头位置没放好。
探头一定要接近底部，约1cm（我一般是距底部0.5mm）。
功率根据仪器不同会有所不同，但你可以观察液面，有波动但不要太剧烈就好。
2*破3S停10S，破个二三十次看看。
3*变幅杆位置摆放也要注意，听声音如果不对的话就要及时调整。
另外可以从菌浓度方面考虑。
在破碎时试着加大体积,强度最好不要超过60%.4*尝试超8s停8s,对有些菌体蛋白来说，你的方法很难散热，导致蛋白变性产生气泡，最好停顿时间稍长一些，这种情况多见于包涵体形式的蛋白。
链霉菌（放线菌）超声破碎的，用的方法条件是什么？前处理一般就是配置成一定浓度的菌悬液。
使用超声破碎时采用的具体条件是：(1)取细菌的24 h培养液于5 000 r／min 下离心5 min收集菌体．(2)用pH 7．5的Na2HPO -NaH2PO 缓冲液洗涤3次，再用该缓冲液将菌体配成1：3的菌悬液．置于40 mL 大塑料试管内．(3)将大塑料试管置于冰浴中，采用超声波破碎(功率200 W，1／2”探头，破碎30 s，间歇30 S)．(4)破碎液于12 000 r／min下高速冷冻离心30 min，收集细胞碎片和上清夜．超声破菌流程与上述基本一致，就是洗涤菌体也可以用预冷的生理盐水或pH8的Tris－HCl，洗涤一次就可以。
重组蛋白质的表达与纯化
重组蛋白质的表达与纯化重组蛋白质是指通过基因工程技术将目标蛋白的基因导入到宿主细胞中，使其在宿主中表达并纯化得到的蛋白质。
这项技术应用广泛，被广泛用于生物制药、医学研究以及工业生产等领域。
下面将详细介绍重组蛋白质的表达与纯化过程。
一、重组蛋白质表达过程1. 选择表达宿主重组蛋白质表达宿主的选择十分重要。
常用的表达宿主包括大肠杆菌（E. coli）、酵母（yeast）、哺乳动物细胞等。
不同的表达宿主具有不同的特点和适用范围。
例如，大肠杆菌是最常用的表达宿主之一，具有高表达水平、易操作、成本低等特点。
2.构建表达载体表达载体是将目标基因导入宿主细胞的载体。
常用的表达载体有质粒、病毒载体等。
质粒是最常用的表达载体，它可轻松被细菌胞内扩增，并在细胞内产生大量目标蛋白。
3.转染和表达将构建好的表达载体导入到宿主细胞中，实现转染。
转染有多种方法，如电穿孔法、化学法、微粒子轰击法等。
转染后，宿主细胞会开始表达目标基因，合成目标蛋白。
4.优化表达条件为了提高重组蛋白质的产量和纯度，需要对表达条件进行优化。
常见的优化方法包括调节培养基成分、改变培养条件、优化诱导剂浓度等。
二、重组蛋白质的纯化过程1.细胞破碎与分离表达宿主中产生的重组蛋白质往往与其他细胞组分混合在一起，需要通过细胞破碎与分离来获取目标蛋白。
细胞破碎方法包括机械法、超声法、高压法等。
分离方法包括离心、电泳、柱层析等。
2.柱层析柱层析是常用的蛋白质纯化方法之一，它基于蛋白质在柱中不同吸附剂上的亲和力差异来实现分离纯化。
常用的柱层析方法有离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析等。
3.其他纯化方法除了柱层析外，还有许多其他的纯化方法可供选择。
例如，凝胶电泳、过滤、冷冻干燥等。
这些方法通常用于进一步提纯和去除杂质，以获得纯度更高的重组蛋白质。
三、重组蛋白质应用与挑战重组蛋白质的应用广泛，涉及到生物制药、医学研究、农业等领域。
例如，通过重组蛋白质技术，可以生产用于治疗疾病的药物，如人胰岛素、白介素等。
大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化
8.大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化发布时间：2011年03月07日点击次数：：次8.大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化大肠杆菌表达系统遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点, 是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。
因此熟练掌握并运用大肠杆菌表达系统的基本原理和常规操作是对每一个研究生来说是非常必要的。
本章节介绍了实验室常用的大肠杆菌表达系统的构成特点，归纳了利用大肠杆菌表达系统纯化重组蛋白的基本流程和详细操作步骤，并且结合笔者的操作经验，总结了初学者在操作过程中可能遇到的问题和解决策略。
8.1大肠杆菌表达系统的选择与构建8.1.1表达载体的选择根据启动子的不同这些载体大致可以分为热诱导启动子，如λPL，cspA 等和另外一类就是广泛使用的IPTG诱导的启动子，如lac，trc，tac，T5/lac operator，T5/lac operator等。
根据表达蛋白质的类型可分为单纯表达载体和融合表达载体。
融合表达是在目标蛋白的N端或C端添加特殊的序列，以提高蛋白的可溶性，促进蛋白的正确折叠，实现目的蛋白的快速亲和纯化，或者实现目标蛋白的表达定位。
常用的用于亲和纯化融合标签包括 Poly-Arg，Poly-His, Strep-Tag Ⅱ，S-tag，MBP 等。
其中His-Tag 和GST-Tag 是目前使用最多的。
His Tag 大多数是连续的六个His 融合于目标蛋白的N端或C端，通过His 与金属离子：Cu2+>Fe2+>Zn2+>Ni2+ 的螯合作用而实现亲和纯化，其中Ni2+是目前使用最广泛的。
His 标签具有较小的分子量，融合于目标蛋白的N端和C端不影响目标蛋白的活性，因此纯化过程中大多不需要去除。
目前常使用的表达载体主要是由Novagen 提供的pET 系列和 Qiagen 公司提供的pQE 系列。
除了His 标签外，还原性谷胱甘肽S-转移酶是另一种实验室常用的融合标签。
大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化
8.大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化发布时间：2011年03月07日点击次数：：次8.大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化大肠杆菌表达系统遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点, 是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。
因此熟练掌握并运用大肠杆菌表达系统的基本原理和常规操作是对每一个研究生来说是非常必要的。
本章节介绍了实验室常用的大肠杆菌表达系统的构成特点，归纳了利用大肠杆菌表达系统纯化重组蛋白的基本流程和详细操作步骤，并且结合笔者的操作经验，总结了初学者在操作过程中可能遇到的问题和解决策略。
8.1大肠杆菌表达系统的选择与构建8.1.1表达载体的选择根据启动子的不同这些载体大致可以分为热诱导启动子，如λPL，cspA 等和另外一类就是广泛使用的IPTG诱导的启动子，如lac，trc，tac，T5/lac operator，T5/lac operator等。
根据表达蛋白质的类型可分为单纯表达载体和融合表达载体。
融合表达是在目标蛋白的N端或C端添加特殊的序列，以提高蛋白的可溶性，促进蛋白的正确折叠，实现目的蛋白的快速亲和纯化，或者实现目标蛋白的表达定位。
常用的用于亲和纯化融合标签包括 Poly-Arg，Poly-His, Strep-Tag Ⅱ，S-tag，MBP 等。
其中His-Tag 和GST-Tag 是目前使用最多的。
His Tag 大多数是连续的六个His 融合于目标蛋白的N端或C端，通过His 与金属离子：Cu2+>Fe2+>Zn2+>Ni2+ 的螯合作用而实现亲和纯化，其中Ni2+是目前使用最广泛的。
His 标签具有较小的分子量，融合于目标蛋白的N端和C端不影响目标蛋白的活性，因此纯化过程中大多不需要去除。
目前常使用的表达载体主要是由Novagen 提供的pET 系列和 Qiagen 公司提供的pQE 系列。
除了His 标签外，还原性谷胱甘肽S-转移酶是另一种实验室常用的融合标签。
大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化(汇编)
大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化一可溶性蛋白的纯化（一）菌体的破碎1. 仪器与材料：-80℃冰箱；超声波细胞破碎仪；50mM PBS或50mM Tris-HCl pH 7.5；50ml 离心管；冷冻高速离心机2. 方法2.1反复冻融2.1.1收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。
2.1.2 菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mM PBS 或50mM Tris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH）重悬洗涤一次。
2.1.3 然后按原菌液体积的1/4加入缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂PMSF 和EDTA(带His标签不加)，PMSF终浓度为100μg/ml, EDTA的终浓度为。
取20μl重悬菌液进行电泳，检测蛋白表达的情况（是否表达，是可溶性表达还是包涵体表达）。
2.1.4 将菌液（经检测有表达）在-80度冰冻，室温融解，反复几次（反复冻融三次），由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
2.2 超声波处理(对超声波及热敏感的蛋白慎用)2.2.1 将反复冻融的菌液（必要时可加入1mg/ml 溶菌酶，缓冲液pH＞8.0，加入后需静置20min），进行超声破碎，超声条件：400W，工作5秒，间隔5秒，重复一定次数，（根据我们的仪器找出一个比较好的工作条件）。
直至菌体溶液变清澈为止，大约花费时间。
2.2.2 取少量经超声破碎后的菌液，10000rpm离心10分钟，分别对上清和沉淀进行检测，并用全菌作为阳性对照，检测菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。
注意事项：（1）超声破碎具体条件可根据实验情况而定，要掌握好功率和每次超声时间，降低蛋白被降解的可能。
（2）功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，应保持在4度左右，超声时保持冰浴。
（3）菌体破碎后总蛋白浓度的测定可用Bradford 法或者紫外吸收法。
（4）可通过SDS-PAGE 电泳观察菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。
大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化
大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化一可溶性蛋白的纯化（一）菌体的破碎1. 仪器与材料：-80℃冰箱；超声波细胞破碎仪；50mM PBS或50mM Tris-HCl pH 7.5；50ml 离心管；冷冻高速离心机2. 方法2.1反复冻融2.1.1收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。
2.1.2 菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mM PBS 或50mM Tris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH）重悬洗涤一次。
2.1.3 然后按原菌液体积的1/4加入缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂PMSF 和EDTA(带His标签不加)，PMSF终浓度为100μg/ml, EDTA的终浓度为。
取20μl重悬菌液进行电泳，检测蛋白表达的情况（是否表达，是可溶性表达还是包涵体表达）。
2.1.4 将菌液（经检测有表达）在-80度冰冻，室温融解，反复几次（反复冻融三次），由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
2.2 超声波处理(对超声波及热敏感的蛋白慎用)2.2.1 将反复冻融的菌液（必要时可加入1mg/ml 溶菌酶，缓冲液pH＞8.0，加入后需静置20min），进行超声破碎，超声条件：400W，工作5秒，间隔5秒，重复一定次数，（根据我们的仪器找出一个比较好的工作条件）。
直至菌体溶液变清澈为止，大约花费时间。
2.2.2 取少量经超声破碎后的菌液，10000rpm离心10分钟，分别对上清和沉淀进行检测，并用全菌作为阳性对照，检测菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。
注意事项：（1）超声破碎具体条件可根据实验情况而定，要掌握好功率和每次超声时间，降低蛋白被降解的可能。
（2）功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，应保持在4度左右，超声时保持冰浴。
（3）菌体破碎后总蛋白浓度的测定可用Bradford 法或者紫外吸收法。
（4）可通过SDS-PAGE 电泳观察菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。
在大肠杆菌中表达重组蛋白的流程
在大肠杆菌中表达重组蛋白的流程
在大肠杆菌中表达重组蛋白的流程通常包括以下步骤：
1. 克隆：首先需要将目标基因克隆到适当的表达载体中。
这可以通过PCR扩增目标基因，然后将其与表达载体连接，形成重组质粒。
2. 转化：将重组质粒转化到大肠杆菌细胞中。
可以使用化学方法（如热冲击法）或电穿孔法将质粒导入细胞。
3. 选择：转化后，将细胞分散在含有适当抗生素的琼脂平板上培养。
只有带有重组质粒的细胞能够存活并形成菌落。
4. 培养：将含有重组细胞的培养液转移到适当的培养基中，并在适当的条件下培养。
这可能包括调节温度、pH值和搅拌速度等。
5. 表达：在培养期间，目标基因会被大肠杆菌细胞转录和翻译为蛋白质。
使用适当的启动子和调控序列，可实现目标蛋白的高效表达。
6. 细胞破碎：一旦细胞达到最佳表达水平，就需要破碎细胞以释放目标蛋白。
这可以通过多种方法实现，如超声波、高压破碎或化学方法。
7. 纯化：通过使用各种分离和纯化技术（如亲和层析、凝胶过滤、离子交换层析等），从细胞裂解液中纯化目标蛋白。
以上是在大肠杆菌中表达重组蛋白的一般流程。
具体的步骤和条件可能因实验设计和目标蛋白的特性而有所不同。
大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化
8.大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化大肠杆菌表达系统遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点，是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。
因此熟练掌握并运用大肠杆菌表达系统的基本原理和常规操作是对每一个研究生来说是非常必要的。
本章节介绍了实验室常用的大肠杆菌表达系统的构成特点，归纳了利用大肠杆菌表达系统纯化重组蛋白的基本流程和详细操作步骤，并且结合笔者的操作经验，总结了初学者在操作过程中可能遇到的问题和解决策略。
8.1大肠杆菌表达系统的选择与构建根据启动子的不同这些载体大致可以分为热诱导启动子，如入PL, cspA等和另外一类就是广泛使用的IPTG诱导的启动子，如lac，trc ，tac，T5/lac operator ，T5/lac operator 等。
根据表达蛋白质的类型可分为单纯表达载体和融合表达载体。
融合表达是在目标蛋白的N端或C端添加特殊的序列，以提高蛋白的可溶性，促进蛋白的正确折叠，实现目的蛋白的快速亲和纯化，或者实现目标蛋白的表达定位。
常用的用于亲和纯化融合标签包括Poly-Arg，Poly-His, Strep-Tag II，S-tag，MBP等。
其中His-Tag 和GST-Tag 是目前使用最多的。
His Tag大多数是连续的六个His融合于目标蛋白的N端或C端，通过His与金属离子：Ci2+>Fe2+>Zn2+>Ni2+的螯合作用而实现亲和纯化，其中Ni2+是目前使用最广泛的。
His标签具有较小的分子量，融合于目标蛋白的N端和C端不影响目标蛋白的活性，因此纯化过程中大多不需要去除。
目前常使用的表达载体主要是由Novagen提供的pET系列和Qiagen公司提供的pQE系列。
除了His标签外，还原性谷胱甘肽S-转移酶是另一种实验室常用的融合标签。
它可以通过还原性谷胱甘肽琼脂糖亲和层析而快速纯化。
此外，与His相比，GST很多时候能够促进目标蛋白的正确折叠，提高目标蛋白表达的可溶性，因此，对于那些用his标签表达易形成包涵体的蛋白，可以尝试用GST融合表达来改进。
超声破碎细胞问题汇总
超声破碎细胞问题汇总2008年12月11日星期四 15:31大肠杆菌表达外源蛋白，在超声破碎的时候，用含有1%triton-X-100的PBS悬浮，然后超声的效果较好，1%triton-X-100的作用还是很明显的，对其他的一些细菌同样起作用，比如链霉菌。
细菌沉淀直接加样品1buffer，再加5ul的巯基乙醇，混匀，离心，煮沸10min，直接上样，染色脱色步骤如下:将胶放入适量的染色液微波炉里加热1min(下次适当补点醋酸即可),将染色液换成大量的水(自来水即可)在微波炉煮10min 就可以.在表达重组蛋白后超声波破碎细胞，采用冰浴，400w，破2s停1s，但是不一会就产生大量泡沫，影响了破碎功率，pbs和tris缓冲液都是这样，最后都是破碎不完全，而我的目的蛋白就在这些未破碎的细胞中。
？1*会产生气泡是因为你的探头位置没放好。
探头一定要接近底部，约1cm（我一般是距底部0.5mm）。
功率根据仪器不同会有所不同，但你可以观察液面，有波动但不要太剧烈就好。
2*破3S停10S，破个二三十次看看。
3*变幅杆位置摆放也要注意，听声音如果不对的话就要及时调整。
另外可以从菌浓度方面考虑。
在破碎时试着加大体积,强度最好不要超过60%.4*尝试超8s停8s,对有些菌体蛋白来说，你的方法很难散热，导致蛋白变性产生气泡，最好停顿时间稍长一些，这种情况多见于包涵体形式的蛋白。
链霉菌（放线菌）超声破碎的，用的方法条件是什么？前处理一般就是配置成一定浓度的菌悬液。
使用超声破碎时采用的具体条件是：(1)取细菌的24 h培养液于5 000 r／min 下离心5 min收集菌体．(2)用pH 7．5的Na2HPO -NaH2PO 缓冲液洗涤3次，再用该缓冲液将菌体配成1：3的菌悬液．置于40 mL大塑料试管内．(3)将大塑料试管置于冰浴中，采用超声波破碎(功率200 W，1／2”探头，破碎30 s，间歇30 S)．(4)破碎液于12 000 r／min下高速冷冻离心30 min，收集细胞碎片和上清夜．超声破菌流程与上述基本一致，就是洗涤菌体也可以用预冷的生理盐水或pH8的Tris－HCl，洗涤一次就可以。
大肠杆菌包涵体表达重组蛋白的纯化和复性
Purification and renaturation of recombinant proteins produced in Escherichia coli as inclusion bodies
Application Note
Key words: Purification, renaturation, eukaryotic genes, recombinant proteins, inclusion bodies, E. coli, gel filtration,
Ionexchange
HIC
Dilution or Dialysis
Fig. 1. General scheme for the extraction, solubilization and re-naturation (refolding) of eukaryotic proteins (recombinant proteins) produced as insoluble inclusion bodies in the cytoplasm of Escherichia coli cells. In some instances, the procedure used for refolding can result in a significant purification of the solubilized and denatured recombinant protein. The dotted squares indicate alternative methods for the refolding process.
(完整版)1-大肠杆菌重组蛋白表达提取及纯化实验
第一天1、配置LB培养基：酵母粉15g、胰蛋白胨30g、氯化钠30g，定容至3000ml。
调节PH至7.4（2M NaOH），高压蒸汽灭菌20分钟，37℃保存。
分装成15瓶（每瓶200ml）。
2、接种（超净台要提前杀菌通风）取4瓶上述培养基，每瓶加200µlAMP（1:1000）、60µl菌液。
37℃过夜。
第二天1、扩大培养（超净台）4瓶扩至16瓶，每瓶培养基加200µlAMP，摇床培养1小时左右。
2、诱导（超净台）加40µlIPTG，加完后去除封口的除牛皮纸，扎口较松。
25℃摇床培养4小时。
3、离心获取菌体4℃，8000rpm离心25分钟。
注意配平。
4、超声波破碎菌体离心后去上清，向沉淀加入（600mlPB裂解液、300µl溶菌酶、3mlPMSF）。
将菌液转入2个烧杯中，冰浴超声波破菌，400W，75次，每次6秒，间隔2秒。
离心收集上清液。
600mlPB裂解液：20mM/L PB，10mM/L EDTA，5%甘油，1mM/L DTT，调节PH至7.4。
超声波破碎：首先用去离子水清洗探头，再将盛有菌液的小烧杯置于有冰水混合物的大烧杯中，冰水界面略高于菌液面即可。
探头浸没于菌液中，不可伸入过长。
注意破菌过程中由于冰的融化导致的液面变化。
5、抽滤（双层滤纸)洗胶（GST）。
将上述上清液抽滤，滤液与GST胶混合，磁力搅拌过夜。
第三天1、抽滤蛋白-胶混合液，滤液取样20µl，留电泳。
2、洗杂蛋白，用1×PBS+PMSF(1000:1)约400ml，洗脱若干次，用移液枪吸去上层泡沫（杂蛋白），至胶上无泡沫为止。
3、洗脱目的蛋白，洗脱液加50ml，分3次进行（15+15+15），每次加入后间歇搅拌，自然静置洗脱15分钟，抽滤，勿使胶干，合并洗脱液，取样20µl，留电泳。
用洗脱液调零，测OD280。
（OD值达到1.5为佳）4、将洗脱液置于透析袋中（透析袋应提前煮好），将透析袋置于2L透析液1中，加入磁珠置于4℃冰箱内磁力搅拌器上，4小时后换为透析液2。
大肠杆菌重组蛋白纯化步骤
大肠杆菌重组蛋白纯化步骤《大肠杆菌重组蛋白纯化步骤》
嘿，朋友们！今天咱们来聊聊大肠杆菌重组蛋白纯化的那些事儿。
这事儿听起来好像挺复杂，其实一步一步来，也没那么难理解。
然后呢，把收集到的大肠杆菌给弄破，让里面的蛋白能跑出来。
这就好比打开一个装满宝藏的盒子，得打破外面的壳儿才能拿到宝贝。
可以用超声破碎或者化学试剂啥的来帮忙，把细胞壁和细胞膜打破，让蛋白能自由活动。
沉淀下来的蛋白还不够纯呢，还得再进一步提纯。
这时候可以用层析的办法，就像过筛子一样，不同大小、性质的东西会在不同的地方被拦住或者通过。
比如说凝胶过滤层析，根据蛋白的大小来分开；离子交换层析呢，就根据蛋白带电的情况来筛选。
弄完这些，还得看看咱们提纯的蛋白纯不纯。
这就像是检查我们挑出来的珍珠是不是真的完美无瑕。
可以用 SDSPAGE 电泳这样的方法，看看蛋白的条带是不是单一的，要是单一的，那恭喜啦，咱们的蛋白纯化得不错！
整个过程里，每一步都得小心操作，就像呵护小宝宝一样。
温度、酸碱度这些条件都得控制好，不然蛋白可能就不开心，质量就不好啦。
其实大肠杆菌重组蛋白纯化说简单也简单，说复杂也复杂。
只要咱们有耐心，一步一步稳稳地来，总能得到咱们想要的纯纯的蛋白。
多做几次，熟练了，也就觉得没那么难啦！大家加油，相信都能搞定这个小挑战！。
大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化
⼤肠杆菌表达系统与蛋⽩表达纯化8.⼤肠杆菌表达系统与蛋⽩表达纯化⼤肠杆菌表达系统遗传背景清楚，⽬的基因表达⽔平⾼，培养周期短，抗污染能⼒强等特点, 是分⼦⽣物学研究和⽣物技术产业化发展进程中的重要⼯具。
因此熟练掌握并运⽤⼤肠杆菌表达系统的基本原理和常规操作是对每⼀个研究⽣来说是⾮常必要的。
本章节介绍了实验室常⽤的⼤肠杆菌表达系统的构成特点，归纳了利⽤⼤肠杆菌表达系统纯化重组蛋⽩的基本流程和详细操作步骤，并且结合笔者的操作经验，总结了初学者在操作过程中可能遇到的问题和解决策略。
8.1⼤肠杆菌表达系统的选择与构建8.1.1表达载体的选择根据启动⼦的不同这些载体⼤致可以分为热诱导启动⼦，如λPL，cspA 等和另外⼀类就是⼴泛使⽤的IPTG诱导的启动⼦，如lac，trc，tac，T5/lac operator，T5/lac operator等。
根据表达蛋⽩质的类型可分为单纯表达载体和融合表达载体。
融合表达是在⽬标蛋⽩的N端或C端添加特殊的序列，以提⾼蛋⽩的可溶性，促进蛋⽩的正确折叠，实现⽬的蛋⽩的快速亲和纯化，或者实现⽬标蛋⽩的表达定位。
常⽤的⽤于亲和纯化融合标签包括 Poly-Arg，Poly-His, Strep-Tag Ⅱ，S-tag，MBP等。
其中His-Tag 和GST-Tag 是⽬前使⽤最多的。
His Tag ⼤多数是连续的六个His 融合于⽬标蛋⽩的N端或C端，通过His 与⾦属离⼦：Cu2+>Fe2+>Zn2+>Ni2+ 的螯合作⽤⽽实现亲和纯化，其中Ni2+是⽬前使⽤最⼴泛的。
His 标签具有较⼩的分⼦量，融合于⽬标蛋⽩的N端和C端不影响⽬标蛋⽩的活性，因此纯化过程多不需要去除。
⽬前常使⽤的表达载体主要是由Novagen 提供的pET 系列和Qiagen 公司提供的pQE 系列。
除了His 标签外，还原性⾕胱⽢肽S-转移酶是另⼀种实验室常⽤的融合标签。
它可以通过还原性⾕胱⽢肽琼脂糖亲和层析⽽快速纯化。
大肠杆菌表达系统及蛋白表达纯化
8.大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化大肠杆菌表达系统遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点, 是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。
因此熟练掌握并运用大肠杆菌表达系统的基本原理和常规操作是对每一个研究生来说是非常必要的。
本章节介绍了实验室常用的大肠杆菌表达系统的构成特点，归纳了利用大肠杆菌表达系统纯化重组蛋白的基本流程和详细操作步骤，并且结合笔者的操作经验，总结了初学者在操作过程中可能遇到的问题和解决策略。
8.1大肠杆菌表达系统的选择与构建8.1.1表达载体的选择根据启动子的不同这些载体大致可以分为热诱导启动子，如λPL，cspA 等和另外一类就是广泛使用的IPTG诱导的启动子，如lac，trc，tac，T5/lac operator，T5/lac operator等。
根据表达蛋白质的类型可分为单纯表达载体和融合表达载体。
融合表达是在目标蛋白的N端或C端添加特殊的序列，以提高蛋白的可溶性，促进蛋白的正确折叠，实现目的蛋白的快速亲和纯化，或者实现目标蛋白的表达定位。
常用的用于亲和纯化融合标签包括 Poly-Arg，Poly-His, Strep-Tag Ⅱ，S-tag，MBP等。
其中His-Tag 和GST-Tag 是目前使用最多的。
His Tag 大多数是连续的六个His 融合于目标蛋白的N端或C端，通过His 与金属离子：Cu2+>Fe2+>Zn2+>Ni2+ 的螯合作用而实现亲和纯化，其中Ni2+是目前使用最广泛的。
His 标签具有较小的分子量，融合于目标蛋白的N端和C端不影响目标蛋白的活性，因此纯化过程中大多不需要去除。
目前常使用的表达载体主要是由Novagen 提供的pET 系列和Qiagen 公司提供的pQE 系列。
除了His 标签外，还原性谷胱甘肽S-转移酶是另一种实验室常用的融合标签。
它可以通过还原性谷胱甘肽琼脂糖亲和层析而快速纯化。
1-大肠杆菌重组蛋白表达提取及纯化实验(最新整理)
第一天1、配置LB培养基：酵母粉15g、胰蛋白胨30g、氯化钠30g，定容至3000ml。
调节PH至7.4（2M NaOH），高压蒸汽灭菌20分钟，37℃保存。
分装成15瓶（每瓶200ml）。
2、接种（超净台要提前杀菌通风）取4瓶上述培养基，每瓶加200µlAMP（1:1000）、60µl菌液。
37℃过夜。
第二天1、扩大培养（超净台）4瓶扩至16瓶，每瓶培养基加200µlAMP，摇床培养1小时左右。
2、诱导（超净台）加40µlIPTG，加完后去除封口的除牛皮纸，扎口较松。
25℃摇床培养4小时。
3、离心获取菌体4℃，8000rpm离心25分钟。
注意配平。
4、超声波破碎菌体离心后去上清，向沉淀加入（600mlPB裂解液、300µl溶菌酶、3mlPMSF）。
将菌液转入2个烧杯中，冰浴超声波破菌，400W，75次，每次6秒，间隔2秒。
离心收集上清液。
600mlPB裂解液：20mM/L PB，10mM/L EDTA，5%甘油，1mM/L DTT，调节PH至7.4。
超声波破碎：首先用去离子水清洗探头，再将盛有菌液的小烧杯置于有冰水混合物的大烧杯中，冰水界面略高于菌液面即可。
探头浸没于菌液中，不可伸入过长。
注意破菌过程中由于冰的融化导致的液面变化。
5、抽滤（双层滤纸)洗胶（GST）。
将上述上清液抽滤，滤液与GST胶混合，磁力搅拌过夜。
第三天1、抽滤蛋白-胶混合液，滤液取样20µl，留电泳。
2、洗杂蛋白，用1×PBS+PMSF(1000:1)约400ml，洗脱若干次，用移液枪吸去上层泡沫（杂蛋白），至胶上无泡沫为止。
3、洗脱目的蛋白，洗脱液加50ml，分3次进行（15+15+15），每次加入后间歇搅拌，自然静置洗脱15分钟，抽滤，勿使胶干，合并洗脱液，取样20µl，留电泳。
用洗脱液调零，测OD280。
（OD值达到1.5为佳）4、将洗脱液置于透析袋中（透析袋应提前煮好），将透析袋置于2L透析液1中，加入磁珠置于4℃冰箱内磁力搅拌器上，4小时后换为透析液2。
大肠杆菌重组质粒蛋白纯化
大肠杆菌重组质粒蛋白纯化1、挑单克隆至含有氨苄抗生素的2mlLB液体培养基37℃过夜培养。
2、接种活化好的菌液500ul至50ml含有氨苄抗生素的LB培养基37℃，250rpm培养2h 至OD600=0.5。
3、加500ul 0.5M 的IPTG28℃诱导培养2-3h。
4、取0.5ml菌液离心2min，去弃上清液，并用2X SDS-PAGE Sample Buffer重悬菌液，SDS-PAGE电泳检测诱导效率。
5、取剩余的菌液300rpm离心6min，去弃上清，并用5 ml Column Buffer重悬菌液，再至于-70℃冷冻。
6、将细胞置于冰浴中，然后用30%的功率超声波10s，再置于冰上20s。
重复10min。
7、12,000rmp，4℃离心10min。
轻轻倒出上清液置于冰上。
8、取200-500ul的支链淀粉树脂到15ml的离心管，简单离心。
用10ml的Column Buffer 冲洗2次去除上清液。
9、将粗体蛋白用支链淀粉树脂混匀并在4℃孵育4-6h。
10、3,000 rmp离心4-5min，弃去上清。
用12体积的Column Buffer润洗树脂20min，3次。
11、用0.5-1 mL column Buffer洗脱融合蛋白，并用10 mM的麦芽糖4℃孵育1-2h。
12、收集每次洗脱的第一和第二个片段。
Column Buffer20 mM Tris-HCl pH7.4200 mM NaCl1 mM EDTA1X Bacterial Protease inhibitor. 50ul PMSF-5ml Column Buffer2x SDS-PAGE sample buffer90 mM Tris·HCl, pH 6.820% (v/v) 甘油2 % (w/v) SDS0.02 % (w/v) 溴酚蓝0.1 M DTT试剂丙烯酰胺（Acr），亚甲基双丙烯酰胺（Bis），TEMED,过硫酸铵，SDS，Tris-base，Hcl，甘油，巯基乙醇，溴酚蓝，甘氨酸，考马斯亮蓝R-250，甲醇，冰醋酸，乙醇，乙酸钠，戊二醛，硫代硫酸钠，乙二胺四乙酸二钠等。
重组大肠杆菌目的蛋白的表达――蛋白电泳
重组大肠杆菌目的蛋白的表达――蛋白电泳一、实验流程二、实验安排第1次菌体超声破壁、离心、包涵体复性、装离子交换柱第2次测酶活、定蛋白离子交换层析层析样品进行浓缩、透析第3次浓缩、透析前、后样品测活、定蛋白装分子筛柱第4次分子筛层析，并对收集样品进行测活、定蛋白等第5次对分离纯化各样品进行蛋白电泳分析，并绘出分离纯化表三、实验操作第1次：菌体超声破壁、离心、包涵体复性、装离子交换柱实验顺序：超声破壁→离心→装离子交换柱→平衡→包涵体复性掌握要点：破壁原理装离子交换柱方法包涵体复性原理及方法第2 次：测酶活、定蛋白、离子交换层析分析、层析样品进行浓缩、透析实验顺序：测酶活→上柱→梯度洗脱→定蛋白→紫外吸收测蛋白峰→酶活曲线测定→收集样品→浓缩→透析涉及单元实验：测酶活、定蛋白、离子交换层析、浓缩、透析掌握要点：碱性磷酸单酯酶测活原理紫外吸收法绘蛋白浓度曲线方法离子交换层析原理及方法浓缩及透析常用方法第3次：浓缩、透析前、后样品测活、定蛋白、装分子筛柱实验顺序：浓缩透析前、后样品测活→考马斯亮蓝法定蛋白→装分子筛柱→平衡涉及单元实验：测活、定蛋白、装分子筛柱掌握要点：考马斯亮蓝法测蛋白浓度方法装分子筛柱方法第4次：分子筛层析，并对收集样品进行分析实验顺序：测活样品进行分子筛层析→紫外吸收测蛋白峰--酶活曲线测定→考马斯亮蓝法定蛋白涉及单元实验：破壁、离心、分子筛层析、复性掌握要点：分子筛层析原理对分离纯化各样品计算比活第5次：对分离纯化各样品进行蛋白电泳分析，并绘出分离纯化表实验顺序：蛋白电泳，同时进行数据分析涉及单元实验：蛋白电泳掌握要点：掌握蛋白电泳方法了解分离纯化样品纯度鉴定的各种方法绘制酶的分离纯化表。
酵母和大肠杆菌细胞的破碎及破碎率的测定
一、酵母和大肠杆菌细胞的破碎及破碎率的测定一、实验原理1.超声波破碎细胞的实验原理频率超过15～20kHz的超声波，在较高输入功率下（100～250W），通过超声波发生器和换能器的作用, 将电能转换为声能，震动波通过浸入在样品中的钛合金变速杆对破碎的各类细胞产生空化效应，从而起到破碎细胞等物质的作用。
2.采用紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验原理蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质溶液在270～280nm具有一个紫外吸收高峰。
在一定范围内，蛋白质溶液在最大吸收波长处的吸光度与其浓度成正比，服从朗伯比尔定律。
由于不同蛋白质中酪氨酸和色氨酸的含量及所处的微环境不同，故蛋白质溶液在280nm的吸光度值不同。
3.血球计算板使用原理计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格，而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格，而每个大方格又分成16个小方格。
但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。
a.16格×25格的血球计数板计算公式:细胞数/ml=100小格内细胞个数/100×400×10000×稀释倍数b. 25格×16格的血球计数板计算公式:细胞数/ml=80小格内细胞个数/80×400×10000×稀释倍数二、实验流程图1.啤酒酵母的破碎啤酒酵母培养（菌种纯化、扩大培养）→破碎前计数（采用紫外分光光度计定性检测蛋白）→细胞超声破碎（80 ml酵母细胞悬浮液置于100 ml容测OD280器中，浸没超声发射针1 cm ；频率中档超声4 s，间歇6 s，80-120次；0.5 ml 悬液稀释1000倍，电子显微镜观察、计数；另取1.5 ml酵母破碎液12000 r/min定性检测蛋白的释放情况；留4 ℃离心10 min取上清，紫外分光光度计测OD280取50ul上清加入2×SDS上清缓冲液，煮沸5 min，-20 ℃保存，待下次实验用。
实验六 GFP在大肠杆菌中的诱导表达和细菌蛋白的超声破碎抽提
实验六GFP在大肠杆菌中的诱导表达和细菌蛋白的超声破碎抽提[实验原理]把含有外源基因的表达载体转化的大肠杆菌在有相应抗菌素和诱导物的条件下培养，可以诱导外源蛋白在大肠杆菌中表达。
利用溶菌酶、反复冻融或超声波破碎的方法将诱导培养的细菌的细胞壁破碎后，可使那些可溶性的外源蛋白释放出来，再利用硫酸铵沉淀、蛋白质层析技术和制备电泳等方法能够将外源蛋白分离纯化出来，供进一步的研究使用。
有些过量表达的外源蛋白往往在细菌中形成不溶性的包涵体，细胞破碎、离心后这些包涵体出现在沉淀中，这样的蛋白需要用高浓度的尿素或SDS变性处理后才能溶解。
超声破碎时要产生大量的热，会引起蛋白的变性。
为了避免产生高温，超声时一般使用间隔的脉冲处理，而且应在冰浴中进行。
本实验使用超声波破碎法抽提蛋白，因为表达的外源蛋白GFP（绿色荧光蛋白）比较耐高温，故省去了冰浴。
[仪器、试剂和材料]1、pGLO转化的大肠杆菌2、LB培养液3、氨卞青霉素4、L-阿拉伯糖5、硫酸铵6、细菌蛋白抽提液（100mmol/L NaCl，10mmol/L EDTA，pH 8.0)7、恒温摇床8、小型高速离心机9、超声波组织细胞破碎仪10、玻璃试管，三角瓶11、1.5mL和5mL 塑料离心管12、“枪”，枪头[实验操作]1、大肠杆菌的诱导培养：从Amp+/LB琼脂板上培养的pGLO转化的大肠杆菌中挑取2-3个菌落，接种于Amp+（终浓度为50微克/mL）的5mL LB的玻璃试管中，培养两管，放恒温摇床中，37℃培养过夜。
将其中一管保存于4℃，另一管所有5mL的培养物加到装有150mL的LB培养液的三角瓶中，加入L-阿拉伯糖干粉150毫克和氨卞青霉素（终浓度为50微克/mL），恒温摇床上37℃振荡培养过夜。
2、超声破碎抽提：将诱导培养的大肠杆菌培养物转移到数只5mL离心管中，8000转/分离心5分钟，倾去上清液后，在沉淀上面再加培养物，继续离心，将所有的培养物都收集在一起。
2-1用超声波破碎仪在破碎大肠杆菌时的技巧
超声波破碎仪在破碎大肠杆菌时的技巧
破碎大肠杆菌用于提取表达外源蛋白，在使用超声波破碎仪之前，用含有1%triton-X-100的PBS悬浮，然后再破碎效果较好，1%triton-X-100的作用还是很明显的，对其他的一些细菌同样起作用，比如链霉菌。
细菌沉淀直接加样品1 buffer，再加5μl的巯基乙醇，混匀，离心，煮沸10min，直接上样，染色脱色步骤如下:将胶放入适量的染色液微波炉里加热1min(下次适当补点醋酸即可),将染色液换成大量的水(自来水即可)在微波炉煮10min 就可以。
在表达重组蛋白后用超声波破碎细胞，采用冰浴，400w，破2s 停1s，但是不一会就产生大量泡沫，影响了破碎功率， pbs和tris缓冲液都是这样，最后都是破碎不完全，而我的目的蛋白就在这些未破碎的细胞中。
1*会产生气泡是因为你的探头位置没放好。
超声波破碎仪探头一定要接近底部，约1cm（推荐是距底部0.5mm）。
功率根据仪器不同会有所不同，但你可以观察液面，有波动但不要太剧烈就好。
2*破3s停10s，破碎20-30个循环观察效果。
3*探头位置摆放也要注意，听声音如果不对的话就要及时调整。
另外可以从菌浓度方面考虑。
在使用超声波破碎时试着加大体积,振幅最好不要超过60%.
4*尝试超8s停8s,对有些菌体蛋白来说，通常方法很难散热，导致蛋白变性产生气泡，最好停顿时间稍长一些，这种情况多见于包涵体形式的蛋白。
如果换用Branson超声波破碎仪来进行工作，由于热耗较小，停顿周期可适当减小。
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大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化
一可溶性蛋白的纯化
（一）菌体的破碎
1. 仪器与材料：-80℃冰箱；超声波细胞破碎仪；50mM PBS或50mM Tris-HCl pH 7.5；50ml 离心管；冷冻高速离心机
2. 方法
2.1反复冻融
2.1.1收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。
2.1.2 菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mM PBS 或50mM Tris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH）重悬洗涤一次。
2.1.3 然后按原菌液体积的1/4加入缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂PMSF 和EDTA(带His标签不加)，PMSF终浓度为100μg/ml, EDTA的终浓度为。
取20μl重悬菌液进行电泳，检测蛋白表达的情况（是否表达，是可溶性表达还是包涵体表达）。
2.1.4 将菌液（经检测有表达）在-80度冰冻，室温融解，反复几次（反复冻融三次），由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
2.2 超声波处理(对超声波及热敏感的蛋白慎用)
2.2.1 将反复冻融的菌液（必要时可加入1mg/ml 溶菌酶，缓冲液pH＞8.0，加入后需静置20min），进行超声破碎，超声条件：400W，工作5秒，间隔5秒，重复一定次数，（根据我们的仪器找出一个比较好的工作条件）。
直至菌体溶液变清澈为止，大约花费时间。
2.2.2 取少量经超声破碎后的菌液，10000rpm离心10分钟，分别对上清和沉淀进行检测，并用全菌作为阳性对照，检测菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。
注意事项：
（1）超声破碎具体条件可根据实验情况而定，要掌握好功率和每次超声时间，降低蛋白被降解的可能。
（2）功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，应保持在4度左右，超声时保持冰浴。
（3）菌体破碎后总蛋白浓度的测定可用Bradford 法或者紫外吸收法。
（4）可通过SDS-PAGE 电泳观察菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。
二包涵体蛋白的纯化
1 菌体的破碎（加溶菌酶处理包涵体效果可能不好，包涵体中总是有残留的溶菌酶，你看看有没有不加溶菌酶的，这个先保留好了）
1.1仪器与材料：超声波细胞破碎仪；20mM PBS或20mM Tris-HCl pH 7.5；裂解液buffer A；溶菌酶10mg/ml；50ml ，15ml离心管；冷冻离心机
1.2 方法
(1) 收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。
（2）菌体沉淀中加入相同菌液体积的20mM PBS 或20mM Tris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH，一般为7.5-8.0），重悬洗涤2-3次，弃掉上清。
（3）然后沉淀按原菌液体积每500ml以15ml预冷的裂解液bufferA重悬。
(有的文献为每克湿菌加4ml -10ml裂解液)
（4）每毫升悬液中加入100ul 10mg/ml溶菌酶（即溶菌酶终浓度1mg/ml）。
在冰上孵育15min
（5）对15ml悬液进行超声破碎，超声条件：400W，工作5秒，间隔5秒，重复一定次数。
超声破碎时保持冰浴。
具体条件可根据实验情况而定。
（6）4℃，4000 rpm/min离心20分钟所得沉淀即为包涵体。
注意事项：融合蛋白的分子量如果大于150KD时，用超声波破碎很容易将目标蛋白打碎而造成降解，故可用溶菌酶先做处理.
2 包涵体的洗涤
(1) 将包涵体沉淀重悬于含有适量脲（1-4M）的Buffer A中，每克湿重加4-6ml 洗涤液。
(2) 超声波处理5秒打碎沉淀，继续用注射器吸入并挤出悬液，重复数次，4℃涡旋悬液30min。
或者高速搅拌悬液10min。
(3) 4℃，4000 rpm/min离心15分钟。
(4) 重复上述操作2次至上清液透明无色。
(5) 将包涵体沉淀重悬于Buffer A，4℃，4000 rpm/min离心15分钟，弃掉上清。
注意事项：
(1) 包涵体洗涤时增加NaCl浓度到0.5M，有助于包涵体中杂蛋白的溶解。
(2) 经提取洗涤后得到的包涵体，由还原SDS-PAGE电泳结合光密度扫描可知包涵体中目标蛋白的含量。
(3) 包涵体洗涤是纯化极重要的一步，不同培养条件下收集的菌液经洗涤可得到不同的纯度。
50mM Tris-HCl pH 8, 0.2mM EDTA, 100mM NaCl, 1% Triton x-100 （或2% 脱氧胆酸钠）1mM DTT 1mM PMSF 10mg/ml大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化
(4) 用通常的洗涤方法，如果包涵体达不到所需的纯度，可试用分级沉淀法初纯包涵体，步骤如下：
(1) 菌体破碎后将所得的包涵体悬浮于含6mol/L盐酸胍的Buffer A中，4℃涡旋悬液30min ，4000r/min离心20min，上清进行分级沉淀。
(2) 取一小部分上清用Buffer A稀释到盐酸胍浓度为4 M，然后4℃涡旋悬液15min，静置30min，4000r/min离心20min，上清继续稀释到3M，重复上面操作一直到2M，把每次沉淀和上清跑SDS-PAGE电泳分析，看目标蛋白在哪个盐酸胍浓度下纯度最高。
(3) 摸索好条件后，直接将剩余上清直接用Buffer A稀释到所需的盐酸胍浓度，然后4℃涡旋悬液15min，静置30min，4000r/min离心20min，沉淀既为分级沉淀后的包涵体。
超声破碎
在建立表达条件过程中，小量制备样品可用小型超声细胞粉碎仪。
离心 1.0～1.5ml 诱导后的菌液收集菌体，然后视菌体的量加入300～500μl的缓冲液重悬细胞，然后置于冰上超声破碎。
因很多实验室有自己的小型超声粉碎器,各个操作不尽相同，具体操作参考仪器说明书。
常规操作步骤如下（以100ml 培养液为例）：
（1）100 ml 诱导后的菌液（OD600=1.2 左右），12000 rpm，4℃离心2min，收集菌体。
（2）加入预冷的缓冲液50ml，重悬细胞洗涤菌体一次，12000 rpm，4℃离心2min，收集菌体；常规的操作所使用的缓冲液多为PBS 或者Tris-NaCl，针对不同的载体和纯化方法，选择相应的缓冲液。
对于一些蛋白酶敏感的目的蛋白，可以在整个操作过程中加入一些蛋白酶抑制剂。
（3）向沉淀中加入15ml的缓冲液同上（若菌体太浓，可加倍），充分悬浮，将菌悬液装在一个玻璃小烧杯中，置于冰水混合物中。
（4）破碎：将用缓冲液洗涤过的超声探头伸入到菌液中，不要接触烧杯底部，每处理30sec间隔1min使菌液冷却，输出强度为5～6，频率为60～70％。
（5）分离上清和沉淀：12000 rpm，4℃离心20min，分离上清和沉淀。
（6）SDS-PAGE 分析蛋白表达情况。
（7）准备纯化蛋白。
超声破碎注意事项与一些小的改进：
（1）破碎完全的判断：超声前菌悬液是浑浊的，超声完全后变的透明、清澈。
（2）如果超声时出现黑色沉淀，说明超声功率太强。
（3）超声时间太长、功率太高对蛋白活性肯定有影响。
（4）尽量防止泡沫的产生。
（5）大量破碎时将菌液置于一玻璃器皿中，破碎时放在冰水混合物中，以增加散热，减小对蛋白的破坏作用。
（6）破碎前的预处理，在破碎前可用溶菌酶（100μg/ml）处理破环细胞壁（10min，30℃），增加细胞的通透性。