重组蛋白IFNGA在大肠杆菌中的表达与纯化

高中组 11年级

生物化学

3人项目

重组蛋白IFNGA在大肠杆菌中的表达与纯化

重组蛋白IFNGA在大肠杆菌中的表达与纯化

摘要：

干扰素γ（Interferon gamma，IFN-γ）是体内重要的细胞因子，能够通过调控免疫相关基因的转录协调机体的免疫反应，具有抗病毒、抗肿瘤、增强免疫力能功能。目前对于IFN-α、IFN-β重组表达的较多，而关于IFN-γ 蛋白的纯化表达较少.因此,本研究使用PCR方法扩增IFN-γ基因，将IFN-γ基因分别插入原核表达载体pET-30构建重组表达质粒pET-30--IFN-γ，转化大肠杆菌BL21和Rosetta菌株，在IPTG诱导下表达IFN-γ，SDS-PAGE分析重组表达蛋白。结果表明：成功构建重组表达质粒pET-30-IFN-γ；表达产物主要以包涵体形式存在；经Ni2+-NTA亲和层析纯化，获得高纯度重组蛋白。本实验纯化的蛋白有望在今后用于医学和生物学研究中。

关键词：干扰素；IFN-γ 蛋白；大肠杆菌表达系统；重组表达；蛋白纯化；

一、研究背景

干扰素（IFN）是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制病毒（比如：乙肝病毒）的复制。其类型分为三类，α-（白细胞）型、β-（成纤维细胞）型，γ-（淋巴细胞）型；同时还可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。

其中，IFN-γ是体内重要的免疫调节因子，能通过与细胞表面受体结合，诱导病毒感染细胞产生多种抗病毒蛋白，使细胞内产生抗病毒状态而发挥抗病毒作用。在诱导效应因子表达的同时，由于IFN-γ能够提高细胞表面MHC分子的表达，增强免疫活性细胞对病原体的杀伤作用，从而协同促进了机体对病毒感染细胞的杀灭，而使机体处于抗病毒状态。虽然各种类型的干扰素均能介导细胞对病毒感染的反应，但IFN-γ 的免疫调节活性在协调免疫反应和确定机体长期的抗病毒状态中发挥更为重要的作用。其作用可大致总结为以下几点：①

抗增生作用。这是干扰素能用于治疗多种肿瘤的原因。②抗病毒作用。当我们的机体感染病毒时，体内会产生大量的干扰素。③免疫调节作用。干扰素是天然免疫的一部分，但干扰素也参与多种特异性的细胞免疫，如增强感染的肝细胞表达被T淋巴细胞识别的蛋白质，帮助T细胞识别病毒感染的细胞等。④抗纤维化作用。这是为什么干扰素治疗的病人肝纤维化会明显好转。⑤干扰素还有抗新血管增生、促进细胞凋亡等多种功能。但在治疗慢性乙肝方面，抗病毒作用和免疫调节作用，以及抗纤维化作用可能是主要的。

由于IFN-γ 能够抑制细胞增生，促进细胞凋亡，抑制肿瘤血管生成，具有抗病毒及免疫调节活性，还可抑制癌基因的表达，因此引起了人们对其在治疗恶性肿瘤方面的关注。目前，已有文献报道将IFN-γ用于肝细胞癌（Hepatic cellular carcinoma，HCC）切除术后和消融术后，以预防复发，如Nishisuchi等对 30 例行 HCC 根治性术后患者进行长达 88 周的IFN-γ治疗，结果显示，IFN-γ 治疗可提高术后患者的累积生存率。Lin 等也对行消融术后的HCC 患者进行IFN-γ 治疗，结果发现IFN-γ 能够降低肿瘤复发率，提高患者生存率。IFN-γ局部用药，还可治疗暴露性肿瘤，如恶性黑色素瘤、恶性淋巴瘤、宫颈癌等。所以我们对其进行了分析与纯化，进一步了解其成分和结构，并纯化出有用蛋白进行加以利用。

二、研究目的

目前对于IFN-α、IFN-β重组表达的较多，而关于IFN-γ 蛋白的纯化表达较少；因此本研究希望通过实验研究，在大肠杆菌表达系统中成功表达IFN-γ 蛋白，并利用蛋白纯化技术获得较纯的IFN-γ 蛋白。

三、材料与方法

1. 大肠杆菌表达载体构建

1.1 材料

DH5a感受态细胞(TAKARA)；Antibotics(Sigma)；

Restriction enzyme(TAKARA)；DNA Ladder(Novoprotein)； pCold II；

载体(TAKARA)；

1.2 仪器及品牌

PCR仪(ThermoFisher)；水平电泳仪(大连竞脉)；凝胶成像仪(上海天能)；

台式离心机(湖南赛特)

1.3 方法

1.3.1 PCR扩增目的基因

设计引物，以含目的基因质粒为模板，PCR扩增IFN-gamma目的基因。

1.3.2 重组表达载体构建

经PCR扩增胶纯化获得目的基因，用Nde I 和Hind III酶切并胶纯化获得载体pCold II。目的基因片段与pCold II以Sea mLess cloning方法重组克隆，转化DH5a感受态细胞，PCR鉴定阳性克隆，并测序。

2. 大肠杆菌表达筛选

2.1 材料

XY1培养基(Novoprotein)；IPTG(Sigma)；Protein Molecular Marker(Novoprotein)；

Antibotics(Sigma)； Rosetta pLysS表达菌株(TAKARA)； Antibodies(Sigma)；2.2 仪器及品牌

高速冷冻离心机(Beckman)；摇床(上海博彩)；超声破碎仪(宁波新芝)；垂直电泳仪(上海天能)

2.3 方法

重组质粒转化BL21(DE3)表达菌株，37℃培养至OD600=0.8后，加IPTG(1mM) ，37℃诱导3 h，收菌。SDS-PAGE检测表达。

重组质粒转化BL21(DE3)表达菌株，37℃培养至OD600=0.8后，冷却后加IPTG(0.1mM) ，16℃诱导过夜，收菌。SDS-PAGE检测表达。

重组质粒转化Rosetta pLysS表达菌株，37℃培养至OD600=0.9后，加IPTG(1mM) ，37℃诱导3 h，收菌。SDS-PAGE检测表达。

重组质粒转化Rosetta pLysS表达菌株，37℃培养至OD600=0.9后，冷却后加IPTG(0.1mM) ，16℃诱导过夜，收菌。SDS-PAGE检测表达。

Antibotics(Sigma)； Rosetta pLysS表达菌株(TAKARA)； Antibodies(Sigma)；3. 蛋白纯化