生物化学实验报告：Western blotting检测大肠杆菌重组蛋白

实验三 Western blotting检测大肠杆菌重组蛋白

一、实验目的

利用Western Blotting技术，定性（或定量）检测苦荞黄酮醇合酶基因（Flavon ol synthase gene, FtFLS）在大肠杆菌表达宿主菌Escherichia coli BL(DE3)中的诱导表达。

二、实验原理

黄酮醇合酶（FLS，EC 1.14.11.23）属于2-ODD家族，催化黄酮醇合成支路中最后一步氧化反应，也是直接合成黄酮醇的反应。FLS可以使二氢黄酮醇在C3链中C2和C3之间氧化形成双键，从而生成黄酮醇：a Dihydroflavonol + 2-oxoglutarate + O2 a Flavonol + succinate + CO2 + H2O。

本实验采用PCR的方法，在苦荞黄酮醇合酶基因（FtFLS）ORF起始密码子前引入KpnІ酶切位点，去掉终止密码并引入Bam H І酶切位点。克隆引入酶切位点后的FtFLS到表达载体pET-30b(+)质粒中，其表达产物分别在N-末端和C-末端各含有6 ×His标签。重组质粒（pET-30b(+)-FtFLS）经鉴定后转化表达宿主菌E. coli BL21(DE3)并使用IPTG进行诱导表达。收集诱导0 h、2 h、4 h、6 h和8 h的产物，经SDS-PAGE后用于考马斯亮蓝R-250染色或Western blotting分析。

Western blotting的标准流程如下：蛋白质首先通过SDS-PAGE胺凝胶电泳分离，通过电泳转移到固相支持物上（硝酸纤维素膜、PVDF膜和尼龙膜）；将膜上未反应的位点封闭起来，以抑制抗体的非特异性吸附，固定的蛋白质即可与特异性的多克隆或单克隆抗体相互作用并通过放射、生色或化学发光的方法进行定位。

本实验采用小鼠抗聚组氨酸单克隆抗体（Anti-His tag IgG，一抗）与重组FtF LS蛋白的N-末端和C-末端6 ×His发生抗原-抗体特异反应，再利用辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG（peroxidase-Goat Anti- Mouse IgG，二抗）与一抗发生特异结合，最后使用DAB进行显色。DAB即：二氨基联苯胺（3, 3'-diaminobenzidine），是过氧化物酶（Peroxidase）的生色底物。DAB在过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化和积累，形成浅棕色不溶性产物。该方法常用于检测过氧化物酶的活性，它灵敏度高，特异性好，在免疫组化，原位杂交，Western blotting等膜显色中

应用广泛。

三、操作步骤

3.1 样品的制备

原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测大肠杆菌重组蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。

材料与试剂：

重组pET-30b(+)-FtFLS质粒、表达宿主菌E. coli BL21(DE3)、LB固体培养基（Kan 50μg/mL）、LB 液体培养基（10mL、50mL）、Kan（50 mg/mL）、IPTG（24 mg/mL）、PBS缓冲液、5 X SDS上样缓冲液。

仪器与设备：

恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、酒精灯、消毒酒精（75%）、棉球、接种环、台式离心机、冰盘、Tip（10 μL、200 μL、1 mL）、微量加样器（10 μL、200 μL、1 mL）、离心管（1.5 mL、10 mL）。

操作步骤：

①含重组质粒pET-30b(+)-FtFLS的表达宿主菌E. coli BL21(DE3)划线于LB 固体培养基（Kan抗性），37℃培养16 h。

②挑选单菌落，接种至10 mL LB培养基（按0.1%加入Kan，10 μL）于37 ℃过夜培养，即为种子液。

③按2 %的接种量（1 mL）将种子液接种到50 mL LB Kan培养基中（按0.1%加入Kan，50 μL），于37 ℃培养OD600至0.5（约2.5 h）。

④加入IPTG至终浓度为1 mmol/L（100 μL），置于25℃连续诱导表达8 h，分别取诱导前0 h，诱导后2 h、4 h、6 h和8 h的培养液5 mL于10 mL离心管中，置于冰水混合物上备用。

⑤诱导完毕后，各样品于8000 rpm（12000 rpm易爆管）离心5 min收集沉淀，用等体积PBS（5 mL）重悬漂洗细胞2次，收集菌体。

⑥各管分别加入400 μL PBS重悬细胞，加入100 μL 5 X SDS上样缓冲液，置于沸水浴中10 min（注意防止爆管）。

注意事项：

①重组蛋白的诱导表达应进行正确的无菌操作并加入适宜浓度的抗生素，避免可能的污染。

②在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性。

③选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键。尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子。

④制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰。

⑤样品建议分装成合适的量（比如分装出20ul检测蛋白质定量用），然后保存与-20°或-80℃中长期保存，但要注意不要反复冻融，因为会使蛋白的抗原特性发生改变。

3.2 SDS-PAGE

SDS-PAGE（SDS变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳）的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异。因为SDS-PAGE上样缓冲液含有SDS和巯基乙醇（2-ME）或二巯基赤藓醇（DTT），其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键、分子内氢键、破坏蛋白质的高级结构、形成SDS-蛋白质复合物。该复合物形成榛状结构，平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子，使其带有大量的负电荷（蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖），从而消除了不同分子之间原有的电荷差别。

材料与试剂：

①分离胶缓冲液（1.5 mol/L Tris-HCl，0.4% SDS，pH 8.8）。

②浓缩胶缓冲液（0.5 mol/L Tris-HCl，0.4% SDS，pH 6.8）。

③30%丙烯酰胺/N, N'-亚甲基双丙烯酰胺（Arc/Bis）：29.2 g Acr，0.8 g Bis，定

容至100 mL。

④10%过硫酸铵（W/V），需新鲜配制。

⑤ 2 X 上样缓冲液（pH 8.0）：含0.5 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）2 mL，甘油2 m L，20% SDS 2 mL（W/V），0.1%溴酚蓝0.5 mL，2-β-巯基乙醇（2-ME）1.0 mL，定容至10 mL。