生物化学综合实验报告

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生物化学综合实验实验报告

项目名称：核酸的分离纯化及性质研究

指导教师：商亚芳

班级：食品科学与工程类13-04班

姓名：俞海清

学号：2013218687 日期：2015/07/02-07/03 小组成员：俞海清曾斯棋

核酸的分离纯化及其性质研究

摘要：提取植物组织DNA和动物肝脏的DNA，先要破碎细胞，然后通过离心获得沉淀。分理

出脱氧核糖蛋白（DNP）。利用阴离子除垢剂（SDS），将蛋白质和DNA 分离开来，用氯仿-异戊醇去蛋白质蛋白质变性，然后离心除去变性蛋白质，之后用乙醇将DNA沉淀出来，得到粗蛋白质。为了获得高纯度的DNA，采用适量的RNase来降解残留的RNA，再利用乙醇来

提取DNA，重复多次来获得较纯的DNA。再利用DNA紫外吸收特性测定DNA的纯度时，发现提取出来的DNA纯度比较高。利用二苯胺法测定DNA的含量，发现DNA含量偏低。DNA产率很低。最后采用琼脂糖凝胶电泳来分离DNA，测定DNA片段的分子质量。结果实验成功的在紫外线下观察出了标准DNA条带以及待测样品条带。

Abstract: In order to extract the plant’s DNA and the pluck’s DNA.we should break cells,then separate the e the SDS to break protein and DNA.Phenol – chloroforM – isoaMyl alcohol Mixture can make protein denaturation .place it on the centrifugal machine to remove the protein .Then,take let the DNA dip into ethylalcohol.it can separate the DNA .

In order to obtain high purity DNA, use the right amount of RNase to degradate residual RNA, recycled ethanol to extract DNA over and over ing ultraviolet absorption characteristics determine th

e purity o

f DNA .we found that the purity of DNA is high.Diphenylamine is used to check the content of DNA, the discovery of DNA’s content is low. DNA’s yield is very low.Finally, agarose gel electrophores is used to separate DNA and check molecular weight of DNA fragments.Under the uv light,we found standard DNA bandin

g and the banding whic

h belong to pending text sample successfully.

关键词：DNA 分离二苯胺乙醇琼脂糖凝胶电泳氯仿-异戊烷

Key words：DNA separate diphenylamine

ethylalcohol agarose gel electrophores

Phenol – chloroforM – isoaMyl alcohol Mixture

前言：

核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。核酸是由许多核苷酸

聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。核酸广泛存在于所有动植物细胞

微生物体内，生物体内的核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。无论是进行核酸结构，还是功能研究，首先需要对核酸进行分离和纯化。核酸样品质量将直接关系到实验的成败。在核

酸分离提取中最重要的是要防止核酸的生物降解,细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸的

磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。

实验原理：

1.植物组织中核酸的分离与纯化原理：DNA存在于细胞核中，天然状态的DNA

大多数是以脱氧核糖核蛋白的形式存在，从细胞中提取DNA时，一般先获得脱氧核糖

（DNP），在将蛋白质除去。阴离子去垢剂SDS可使DNA与蛋白质分离，再用含少量的氯仿去蛋白质，最后用乙醇把DNA从抽提液中沉淀出来。DNP与核糖核蛋白（RNP）在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大，利用这一特性可将二者分离。以NACL为例

RNP0.14mol/LNACL中溶解度很大，而DNP在其中的溶解度仅为纯水中的1%；当NACL浓度逐渐增大时，RNP的溶解度变化不大，而DNP的溶解度则随之增加；当NACL的浓度为1mol/L时，DNP的溶解度最大，为纯水中溶解度的2倍，因此通常可用1mol/LNACL提取DNA。进一步制备高纯度的DNA,可用适量的RNase处理提取液，以降解DNA中掺杂的RNA.为了防止提取过程中DNA被细胞中释放出来的DNase 降解以及DNA变性，整个提取过程应该在低温度下进行，同时可在研磨缓冲液中加柠檬酸三钠和Na2-EDTA抑制DNase的活性。提取的DNA是否为纯净，双链，高分子化合物，一般要通过紫外吸收，化学测定和电镜观察等方面的鉴定，本实验采用紫外吸收法。

2. 肝脏中DNA的提取及纯度鉴定原理：在细胞核内，核酸通常是与某些组织蛋白质结合成复合物-核糖核蛋白和脱氧核糖核蛋白形式存在的，因此，在制备核酸时，需先将组织或细胞匀浆或破碎，使之释放出核蛋白，再设法将这两大类蛋白分开，再通过蛋白质变性如苯酚，氯仿等，去垢剂如十二烷磺基硫酸钠或使用蛋白酶处理，除去蛋白质，使核酸与蛋白质分离，从而将核酸与蛋白质分离开。RNP和DNP在不同浓度的电解质溶液中的溶解度差异很大。如在高浓度氯化钠（12mol/L）溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度很大，核糖核蛋白的溶解度很小。在低浓度氯化钠溶液中（0.14mol/L）,DNP的溶解度很小，RNP的溶解度很大。因此，可以利用不同浓度的氯化钠，将两者分离。将抽提得到的核蛋白用SDS或苯酚处理使核蛋白解聚，DNA/RNA及与蛋白质分开；用氯仿-异戊醇将蛋白质沉淀除去，而DNA 则溶解于溶液中。经上述分离纯化后的核酸盐溶液，再利用其不溶于有机溶剂的性质，而使其在适当浓度的亲水有机溶剂（如乙醇）中呈絮状沉淀析出。重复进行上述处理，即可制成所要求纯度的脱氧核糖核酸制品。提纯的DNA或DNA钠盐为白色纤维状固体。为了防止DNA酶解，提取时加入EDTA。因为EDTA是抑制DNA酶活性最好的抑制剂之一，由于DNA 酶的酶解作用必须有Ca2+及Mg2+的存在，故只要在提取液中加入少量的金属螯合剂EDTA，就可使DNA酶失活。本实验采用动物新鲜肝脏为提取DNA的材料，通过组织匀浆，使细胞破碎，利用RNP和DNP在一定浓度氯化钠溶液中溶解度不同的特点，提取DNP。用SDS使蛋白质变性和核蛋白解聚，释放出DNA。用氯仿使蛋白质变性沉淀，离心去除。用乙醇作沉淀剂，得到较纯的DNA。用Rnsae去除RNA，再用氯仿使酶蛋白变性沉淀，离心去除，最后用乙醇作沉淀剂，得到更纯的DNA。DNA纯度鉴定需要测定A260，A230和A280的值，经验数据表明，高纯度DNA样品A260/A280的值在1.9左右，当比值高时说明样品中混杂有RNA，当比值低时表明样品中蛋白质没有脱净；而A260/A230应大于或等于2.0，若比值过小则表明有杂质（一般多酚类或色素）。因此，可利用A260/A280和A260/A230比值的大小来鉴定DNA样品的纯度。

3. 二苯胺法测定核酸的含量原理：脱氧核糖核酸中的α—脱氧核糖在酸性环境中变成ω—羟基—γ酮基戊醛与二苯胺试剂一起加热产生蓝色化合物，在595nm处有最大的吸收，在每毫升含DNA20~400微克范围内，光密度与DNA的浓度成正比，在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应的灵敏度。除DNA外，脱氧木糖，阿拉伯糖也有同样的反应。

DNA HO CH2C — CH2 CHO 蓝色化合物

酸性条件二苯胺

==

O

ω—羟基—γ酮基戊醛