大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化
蛋白的纯化
第二部分：蛋白的纯化如何区分蛋白表达在上清还是包涵体？破碎细胞后离心分别收集上清和沉淀，表达的蛋白可能分布在上清中也有可能分布在沉淀中，还有可能是二者中都有分布。
根据我们实验室的经验，超声碎菌之后，如果菌液比较清亮，沉淀比较少，那表达的蛋白基本上是可溶的。
但如果超声完之后，菌液是浑浊的，而且当离心之后，离下的沉淀比较多，而且沉淀的颜色也比较白，那基本上就是包涵体了。
包涵体是基因重组蛋白在大肠杆菌中高水平表达时所形成的无活性的蛋白质聚集体，难溶于氺，可溶于变性剂如尿素，盐酸胍等，其实，包涵体也就是我们常说的不可溶蛋白。
对于后者，可将上清和沉淀分别跑一个PAGE,看看上清中的量能达到多少，对于某些蛋白来说，一部分是以包涵体形式表达，一部分是以可溶的形式表达，而且量也不少，可以满足后续实验的需要，这个时候最好是纯可溶的，因为包涵体即使最后复性，活性也不太可信。
对于沉淀跑SDS-PAGE，如何处理，用什么使其溶解，还有在大肠杆菌中表达的蛋白，在提取过程中，使用什么蛋白提取缓冲液。
沉淀用Buffer B重悬，（组成：8M尿素+10mMTRIS base+100mM NaH2PO4，用NaOH调节pH到8.0),1克沉淀（湿重）加5ml Buffer B,使其充分溶解（可以放在微量震荡器上震荡20min），然后室温下12000转离心20min，留上清，弃沉淀。
取10ul上清加入10ul 2xSDS上样缓冲液，就可以跑PAGE了。
无论是纯可溶蛋白还是包涵体，在菌体裂解这一步我用的都是Lysis Buffer（组成：10mM 咪唑+300mM NaCl+50mM NaH2PO4,用NaOH调节pH到8.0)每克菌体（湿重）加2-5ml Lysis Buffer，充分悬起后，加入溶菌酶4度作用半小时就可以超声破碎了。
包涵体，简单的说就是翻译的蛋白没有正确折叠而聚集在一起形成的，主要的是疏水作用。
实际上就是很多个蛋白分子，这些蛋白并不是交联在一起的，用高浓度的尿素和盐酸胍可以使他们变性，解聚。
超声破碎
大肠杆菌表达外源蛋白，在超声破碎的时候，用含有1%triton-X-100的PBS悬浮，然后超声的效果较好，1%triton-X-100的作用还是很明显的，对其他的一些细菌同样起作用，比如链霉菌。
细菌沉淀直接加样品1buffer，再加5ul的巯基乙醇，混匀，离心，煮沸10min，直接上样，染色脱色步骤如下:将胶放入适量的染色液微波炉里加热1min(下次适当补点醋酸即可),将染色液换成大量的水(自来水即可)在微波炉煮10min 就可以。
在表达重组蛋白后超声波破碎细胞，采用冰浴，400w，破2s停1s，但是不一会就产生大量泡沫，影响了破碎功率，pbs和tris缓冲液都是这样，最后都是破碎不完全，而我的目的蛋白就在这些未破碎的细胞中。
1*会产生气泡是因为你的探头位置没放好。
探头一定要接近底部，约1cm（我一般是距底部0.5mm）。
功率根据仪器不同会有所不同，但你可以观察液面，有波动但不要太剧烈就好。
2*破3S停10S，破个二三十次看看。
3*变幅杆位置摆放也要注意，听声音如果不对的话就要及时调整。
另外可以从菌浓度方面考虑。
在破碎时试着加大体积,强度最好不要超过60%.4*尝试超8s停8s,对有些菌体蛋白来说，你的方法很难散热，导致蛋白变性产生气泡，最好停顿时间稍长一些，这种情况多见于包涵体形式的蛋白。
链霉菌（放线菌）超声破碎的，用的方法条件是什么？前处理一般就是配置成一定浓度的菌悬液。
使用超声破碎时采用的具体条件是：(1)取细菌的24 h培养液于5 000 r／min 下离心5 min收集菌体．(2)用pH 7．5的Na2HPO -NaH2PO 缓冲液洗涤3次，再用该缓冲液将菌体配成1：3的菌悬液．置于40 mL 大塑料试管内．(3)将大塑料试管置于冰浴中，采用超声波破碎(功率200 W，1／2”探头，破碎30 s，间歇30 S)．(4)破碎液于12 000 r／min下高速冷冻离心30 min，收集细胞碎片和上清夜．超声破菌流程与上述基本一致，就是洗涤菌体也可以用预冷的生理盐水或pH8的Tris－HCl，洗涤一次就可以。
重组蛋白质的表达与纯化
重组蛋白质的表达与纯化重组蛋白质是指通过基因工程技术将目标蛋白的基因导入到宿主细胞中，使其在宿主中表达并纯化得到的蛋白质。
这项技术应用广泛，被广泛用于生物制药、医学研究以及工业生产等领域。
下面将详细介绍重组蛋白质的表达与纯化过程。
一、重组蛋白质表达过程1. 选择表达宿主重组蛋白质表达宿主的选择十分重要。
常用的表达宿主包括大肠杆菌（E. coli）、酵母（yeast）、哺乳动物细胞等。
不同的表达宿主具有不同的特点和适用范围。
例如，大肠杆菌是最常用的表达宿主之一，具有高表达水平、易操作、成本低等特点。
2.构建表达载体表达载体是将目标基因导入宿主细胞的载体。
常用的表达载体有质粒、病毒载体等。
质粒是最常用的表达载体，它可轻松被细菌胞内扩增，并在细胞内产生大量目标蛋白。
3.转染和表达将构建好的表达载体导入到宿主细胞中，实现转染。
转染有多种方法，如电穿孔法、化学法、微粒子轰击法等。
转染后，宿主细胞会开始表达目标基因，合成目标蛋白。
4.优化表达条件为了提高重组蛋白质的产量和纯度，需要对表达条件进行优化。
常见的优化方法包括调节培养基成分、改变培养条件、优化诱导剂浓度等。
二、重组蛋白质的纯化过程1.细胞破碎与分离表达宿主中产生的重组蛋白质往往与其他细胞组分混合在一起，需要通过细胞破碎与分离来获取目标蛋白。
细胞破碎方法包括机械法、超声法、高压法等。
分离方法包括离心、电泳、柱层析等。
2.柱层析柱层析是常用的蛋白质纯化方法之一，它基于蛋白质在柱中不同吸附剂上的亲和力差异来实现分离纯化。
常用的柱层析方法有离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析等。
3.其他纯化方法除了柱层析外，还有许多其他的纯化方法可供选择。
例如，凝胶电泳、过滤、冷冻干燥等。
这些方法通常用于进一步提纯和去除杂质，以获得纯度更高的重组蛋白质。
三、重组蛋白质应用与挑战重组蛋白质的应用广泛，涉及到生物制药、医学研究、农业等领域。
例如，通过重组蛋白质技术，可以生产用于治疗疾病的药物，如人胰岛素、白介素等。
蛋白的纯化
第二部分：蛋白的纯化如何区分蛋白表达在上清还是包涵体？破碎细胞后离心分别收集上清和沉淀，表达的蛋白可能分布在上清中也有可能分布在沉淀中，还有可能是二者中都有分布。
根据我们实验室的经验，超声碎菌之后，如果菌液比较清亮，沉淀比较少，那表达的蛋白基本上是可溶的。
但如果超声完之后，菌液是浑浊的，而且当离心之后，离下的沉淀比较多，而且沉淀的颜色也比较白，那基本上就是包涵体了。
包涵体是基因重组蛋白在大肠杆菌中高水平表达时所形成的无活性的蛋白质聚集体，难溶于氺，可溶于变性剂如尿素，盐酸胍等，其实，包涵体也就是我们常说的不可溶蛋白。
对于后者，可将上清和沉淀分别跑一个PAGE,看看上清中的量能达到多少，对于某些蛋白来说，一部分是以包涵体形式表达，一部分是以可溶的形式表达，而且量也不少，可以满足后续实验的需要，这个时候最好是纯可溶的，因为包涵体即使最后复性，活性也不太可信。
对于沉淀跑SDS-PAGE，如何处理，用什么使其溶解，还有在大肠杆菌中表达的蛋白，在提取过程中，使用什么蛋白提取缓冲液。
沉淀用Buffer B重悬，（组成：8M尿素+10mMTRIS base+100mM NaH2PO4，用NaOH调节pH到8.0),1克沉淀（湿重）加5ml Buffer B,使其充分溶解（可以放在微量震荡器上震荡20min），然后室温下12000转离心20min，留上清，弃沉淀。
取10ul上清加入10ul 2xSDS上样缓冲液，就可以跑PAGE了。
无论是纯可溶蛋白还是包涵体，在菌体裂解这一步我用的都是Lysis Buffer（组成：10mM 咪唑+300mM NaCl+50mM NaH2PO4,用NaOH调节pH到8.0)每克菌体（湿重）加2-5ml Lysis Buffer，充分悬起后，加入溶菌酶4度作用半小时就可以超声破碎了。
包涵体，简单的说就是翻译的蛋白没有正确折叠而聚集在一起形成的，主要的是疏水作用。
实际上就是很多个蛋白分子，这些蛋白并不是交联在一起的，用高浓度的尿素和盐酸胍可以使他们变性，解聚。
超声波破碎细胞的常见问题
超声波破碎细胞的常见问题大肠杆菌表达外源蛋白，在超声破碎的时候，用含有1%triton-X-100的PBS悬浮，然后超声的效果较好，1%triton-X-100的作用还是很明显的，对其他的一些细菌同样起作用，比如链霉菌。
细菌沉淀直接加样品1buffer，再加5ul的巯基乙醇，混匀，离心，煮沸10min，直接上样，染色脱色步骤如下:将胶放入适量的染色液微波炉里加热1min(下次适当补点醋酸即可),将染色液换成大量的水(自来水即可)在微波炉煮10min 就可以。
在表达重组蛋白后超声波破碎细胞，采用冰浴，400w，破2s停1s，但是不一会就产生大量泡沫，影响了破碎功率，pbs和tris缓冲液都是这样，最后都是破碎不完全，而我的目的蛋白就在这些未破碎的细胞中。
1*会产生气泡是因为你的探头位置没放好。
探头一定要接近底部，约1cm（我一般是距底部0.5mm）。
功率根据仪器不同会有所不同，但你可以观察液面，有波动但不要太剧烈就好。
2*破3S停10S，破个二三十次看看。
3*变幅杆位置摆放也要注意，听声音如果不对的话就要及时调整。
另外可以从菌浓度方面考虑。
在破碎时试着加大体积,强度最好不要超过60%.4*尝试超8s停8s,对有些菌体蛋白来说，你的方法很难散热，导致蛋白变性产生气泡，最好停顿时间稍长一些，这种情况多见于包涵体形式的蛋白。
问：链霉菌（放线菌）超声破碎的，用的方法条件是什么？答：前处理一般就是配置成一定浓度的菌悬液。
使用超声破碎时采用的具体条件是：(1)取细菌的24 h培养液于5 000 r／min 下离心5 min收集菌体．(2)用pH 7．5的Na2HPO -NaH2PO 缓冲液洗涤3次，再用该缓冲液将菌体配成1：3的菌悬液．置于40mL大塑料试管内．(3)将大塑料试管置于冰浴中，采用超声波破碎(功率200 W，1／2”探头，破碎30 s，间歇30 S)．(4)破碎液于12 000 r／min下高速冷冻离心30 min，收集细胞碎片和上清夜．超声破菌流程与上述基本一致，就是洗涤菌体也可以用预冷的生理盐水或pH8的Tris－HCl，洗涤一次就可以。
在大肠杆菌中表达重组蛋白的流程
在大肠杆菌中表达重组蛋白的流程
在大肠杆菌中表达重组蛋白的流程通常包括以下步骤：
1. 克隆：首先需要将目标基因克隆到适当的表达载体中。
这可以通过PCR扩增目标基因，然后将其与表达载体连接，形成重组质粒。
2. 转化：将重组质粒转化到大肠杆菌细胞中。
可以使用化学方法（如热冲击法）或电穿孔法将质粒导入细胞。
3. 选择：转化后，将细胞分散在含有适当抗生素的琼脂平板上培养。
只有带有重组质粒的细胞能够存活并形成菌落。
4. 培养：将含有重组细胞的培养液转移到适当的培养基中，并在适当的条件下培养。
这可能包括调节温度、pH值和搅拌速度等。
5. 表达：在培养期间，目标基因会被大肠杆菌细胞转录和翻译为蛋白质。
使用适当的启动子和调控序列，可实现目标蛋白的高效表达。
6. 细胞破碎：一旦细胞达到最佳表达水平，就需要破碎细胞以释放目标蛋白。
这可以通过多种方法实现，如超声波、高压破碎或化学方法。
7. 纯化：通过使用各种分离和纯化技术（如亲和层析、凝胶过滤、离子交换层析等），从细胞裂解液中纯化目标蛋白。
以上是在大肠杆菌中表达重组蛋白的一般流程。
具体的步骤和条件可能因实验设计和目标蛋白的特性而有所不同。
蛋白质纯化方法
含组氨酸标签的蛋白的诱导表达及纯化一.用IPTG诱导启动子在大肠杆菌中表达克隆化基因所需特殊试剂：1M IPTG1.将目的基因与IPTG诱导表达载体连接，构成重组质粒并转化相应的表达用的大肠杆菌。
将转化体铺于含相应抗生素的LB平板，37℃培养过夜。
通过酶切序列分析等筛选带有插入片段的转化体。
2.分别挑取对照菌和重组菌1个菌落，接种于1ml含有相应抗生素的LB培养液中，37℃通气培养过夜。
3.取100微升过夜培养物接种于5ml含有相应抗生素的LB培养液中（各10份），适当的温度（20－37℃）震荡培养4小时，至对数中期（A550＝0.1-1.0）。
4.对照菌和重组菌各取1ml未经诱导的培养物于离心管中，剩余培养物中加入IPTG至终浓度分别为0.5，1.0，1.5，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0mM相同的温度继续通气培养。
5.在诱导的1，2，3，4，5个小时取1ml样品于Ep管中。
细菌的生长速率严重影响外源蛋白的表达，因此必须对接种菌量，诱导前细菌生长时间和诱导后细菌密度进行控制。
生长过度或过速会加重细菌合成系统的负担，导致包涵体的形成。
生长温度可能是影响大肠杆菌高度表达目的蛋白的最重要因素。
低温培养能在一定程度上抑制包涵体的形成。
IPTG的浓度对表达水平的影响也非常大。
所以通过试验确定最佳的培养条件是很必要的。
6.将所有样本室温最高速度离心1分钟，弃上清，沉淀重悬于100微升1×SDS蛋白上样缓冲液中，100℃加热5分钟，室温最高速度离心1分钟，取15微升样品上样于SDS聚丙烯酰胺凝胶，用SDS－PAGE观察表达产物条带，从而确定优化的培养条件。
二.大量表达靶蛋白1.取保存的重组大肠杆菌菌液150微升接种于30毫升含相应抗生素的LB培养液中，在100毫升锥形瓶中，300rpm，37℃通气过夜培养。
2.取16毫升过夜培养物接种于800ml含相应抗生素的LB培养液，在2L的锥形瓶中用预实验所确定的最佳诱导温度，300rpm，通气培养4小时，至对数生长中期。
纯化大肠杆菌的方法
纯化大肠杆菌的方法
首先，准备工作是非常重要的。
在进行大肠杆菌的纯化前，需要准备好所需的实验器材和试剂，包括培养基、离心管、离心机、超声波破碎机等。
同时，要确保实验室环境的清洁和无菌操作。
其次，进行大肠杆菌的培养和收获。
首先将大肠杆菌接种到含有适当抗生素的培养基中，进行培养。
培养时间和条件根据具体实验而定，一般需要在37摄氏度下培养12-16小时。
培养后，使用离心机将培养液进行离心，收集细菌沉淀。
接下来是大肠杆菌的破碎和裂解。
将收集到的细菌沉淀用适当的缓冲液进行悬浮，然后使用超声波破碎机进行破碎和裂解。
这一步是为了破坏细菌细胞壁，释放细胞内的目标蛋白。
然后进行蛋白的纯化和分离。
通过离心、过滤、层析等方法，将目标蛋白从混合物中分离出来，得到较纯的蛋白样品。
这一步需要根据目标蛋白的特性选择合适的纯化方法，如亲和层析、离子交换层析等。
最后是对纯化后的蛋白进行检测和分析。
使用SDS-PAGE凝胶电
泳、Western blotting等方法对纯化后的蛋白进行检测和鉴定，确
保蛋白的纯度和活性。
通过以上步骤，可以得到较为纯净和活性较高的大肠杆菌蛋白
样品。
这种方法不仅适用于纯化大肠杆菌蛋白，也可以根据具体情
况进行相应的改进和优化，以满足不同实验的需求。
总之，纯化大肠杆菌的方法是一个复杂而又重要的过程，需要
仔细操作和科学设计。
只有通过严格的实验操作和精准的技术手段，才能得到理想的纯化效果。
希望本文介绍的方法对您有所帮助，谢
谢阅读。
重组人抗血栓蛋白在大肠杆菌中的自诱导表达及纯化
重组人抗血栓蛋白在大肠杆菌中的自诱导表达及纯化龚志飞;杨翔;颜法宝;陈强;孙小强;华子春【摘要】旨在优化重组人抗血栓蛋白(rHAP)工程菌的自诱导培养基,以提高菌体产量及可溶性的重组rHAP蛋白含量.选取蛋白胨、酵母提取物、甘油、葡萄糖为因素,各取4个水平,采用正交表L16(45)进行试验设计,时影响菌体生长和可溶性rHAP表达水平的乳糖浓度进行了优化.结果表明自诱导培养基碳氮源的最优配比:2％蛋白胨,1.5％酵母,0.5％甘油,0.03％葡萄糖,0.2％乳糖.此时表达菌密度OD600和可溶性rHAP目标蛋白表达量分别是未优化前的2.04倍和2.85倍.在20 L发酵表达时,rHAP工程菌OD600值高迭93,菌体温量为1 620 g/20L.利用Q-Sepharose和SP-Sepharose纯化,Western blotting结果表明表达蛋白为目的融合蛋白.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2011(000)012【总页数】7页(P192-198)【关键词】抗血栓蛋白;优化培养;发酵;纯化;鉴定【作者】龚志飞;杨翔;颜法宝;陈强;孙小强;华子春【作者单位】常州大学石油化工学院,常州213164;常州靶标生物医药研究所有限公司,常州213164;南京大学常州高新技术研究院,常州213164;常州靶标生物医药研究所有限公司,常州213164;南京大学常州高新技术研究院,常州213164;常州靶标生物医药研究所有限公司,常州213164;南京大学常州高新技术研究院,常州213164;常州大学石油化工学院,常州213164;南京大学常州高新技术研究院,常州213164【正文语种】中文重组人抗血栓蛋白（rHAP）[1]正是利用蛋白质工程和基因工程技术，将人胎盘抗凝蛋白与水蛭素C端结构域结合在一起的一种新的抗凝蛋白，分子量大小约为38 kD。
初步研究表明，重组人胎盘抗凝蛋白变体保留了Annexin V和血小板结合的性质，同时又具有明显的凝血酶抑制活性，而且其凝血酶抑制活性具有明显的剂量依赖关系[2]。
超声破碎细胞问题汇总
超声破碎细胞问题汇总2008年12月11日星期四 15:31大肠杆菌表达外源蛋白，在超声破碎的时候，用含有1%triton-X-100的PBS悬浮，然后超声的效果较好，1%triton-X-100的作用还是很明显的，对其他的一些细菌同样起作用，比如链霉菌。
细菌沉淀直接加样品1buffer，再加5ul的巯基乙醇，混匀，离心，煮沸10min，直接上样，染色脱色步骤如下:将胶放入适量的染色液微波炉里加热1min(下次适当补点醋酸即可),将染色液换成大量的水(自来水即可)在微波炉煮10min 就可以.在表达重组蛋白后超声波破碎细胞，采用冰浴，400w，破2s停1s，但是不一会就产生大量泡沫，影响了破碎功率，pbs和tris缓冲液都是这样，最后都是破碎不完全，而我的目的蛋白就在这些未破碎的细胞中。
？1*会产生气泡是因为你的探头位置没放好。
探头一定要接近底部，约1cm（我一般是距底部0.5mm）。
功率根据仪器不同会有所不同，但你可以观察液面，有波动但不要太剧烈就好。
2*破3S停10S，破个二三十次看看。
3*变幅杆位置摆放也要注意，听声音如果不对的话就要及时调整。
另外可以从菌浓度方面考虑。
在破碎时试着加大体积,强度最好不要超过60%.4*尝试超8s停8s,对有些菌体蛋白来说，你的方法很难散热，导致蛋白变性产生气泡，最好停顿时间稍长一些，这种情况多见于包涵体形式的蛋白。
链霉菌（放线菌）超声破碎的，用的方法条件是什么？前处理一般就是配置成一定浓度的菌悬液。
使用超声破碎时采用的具体条件是：(1)取细菌的24 h培养液于5 000 r／min 下离心5 min收集菌体．(2)用pH 7．5的Na2HPO -NaH2PO 缓冲液洗涤3次，再用该缓冲液将菌体配成1：3的菌悬液．置于40 mL大塑料试管内．(3)将大塑料试管置于冰浴中，采用超声波破碎(功率200 W，1／2”探头，破碎30 s，间歇30 S)．(4)破碎液于12 000 r／min下高速冷冻离心30 min，收集细胞碎片和上清夜．超声破菌流程与上述基本一致，就是洗涤菌体也可以用预冷的生理盐水或pH8的Tris－HCl，洗涤一次就可以。
超声波破碎细胞的常见问题有哪些
(3)将大塑料试管置于冰浴中，采用超声波破碎(功率200W， 1/2”探头，破碎30s，间歇30S).
(4)破碎液于12000r/min下高速冷冻离心30min，收集细胞碎片 和上清夜.
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2.破3S停10S，破个二三十次看看。
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3.变幅杆位置摆放也要注意，听声音如果不对的话 就要及时调整。另外可以从菌浓度方面考虑。在破碎时 试着加大体积,强度zui好不要超过60%.
4.尝试超8s停8s,对有些菌体蛋白来说，你的方法很 难散热，导致蛋白变性产生气泡，zui好停顿时间稍长一 些，这种情况多见于包涵体形式的蛋白。
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在表达重组蛋白后超声波破碎细胞，采用冰浴，400w，破2s停1s ，但是不一会就产生大量泡沫，影响了破碎功率，pbs和tris缓冲液都 是这样，zui后都是破碎不完全，而我的目的蛋白就在这些未破碎的细 胞中。
1.会产生气泡是因为你的探头位置没放好。探头一定要接近底部 ，约1cm(我一般是距底部0.5mm)。功率根据仪器不同会有所不同，但 你可以观察液面，有波动但不要太剧烈就好。
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链霉菌(放线菌)超声破碎的，用的方法条件是什么? 前处理一般就是配置成一定浓度的菌悬液。 使用超声破碎时采用的具体条件是： (1)取细菌的24h培养液于5000r/min下离心5min收集菌体. (2)用pH7.5的Na2HPO-NaH2PO缓冲液洗涤3次，再用该缓冲 液将菌体配成1：3的菌悬液.置于40mL大塑料试管内.
超声波破碎细胞的常见问题有哪些
试验箱
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大肠杆菌表达外源蛋白，在超声破碎的时候，用含 有1%triton-X-100的PBS悬浮，然后超声的效果较好， 1%triton-X-100的作用还是很明显的，对其他的一些细菌 同样起作用，比如链霉菌。
(完整版)1-大肠杆菌重组蛋白表达提取及纯化实验
第一天1、配置LB培养基：酵母粉15g、胰蛋白胨30g、氯化钠30g，定容至3000ml。
调节PH至7.4（2M NaOH），高压蒸汽灭菌20分钟，37℃保存。
分装成15瓶（每瓶200ml）。
2、接种（超净台要提前杀菌通风）取4瓶上述培养基，每瓶加200µlAMP（1:1000）、60µl菌液。
37℃过夜。
第二天1、扩大培养（超净台）4瓶扩至16瓶，每瓶培养基加200µlAMP，摇床培养1小时左右。
2、诱导（超净台）加40µlIPTG，加完后去除封口的除牛皮纸，扎口较松。
25℃摇床培养4小时。
3、离心获取菌体4℃，8000rpm离心25分钟。
注意配平。
4、超声波破碎菌体离心后去上清，向沉淀加入（600mlPB裂解液、300µl溶菌酶、3mlPMSF）。
将菌液转入2个烧杯中，冰浴超声波破菌，400W，75次，每次6秒，间隔2秒。
离心收集上清液。
600mlPB裂解液：20mM/L PB，10mM/L EDTA，5%甘油，1mM/L DTT，调节PH至7.4。
超声波破碎：首先用去离子水清洗探头，再将盛有菌液的小烧杯置于有冰水混合物的大烧杯中，冰水界面略高于菌液面即可。
探头浸没于菌液中，不可伸入过长。
注意破菌过程中由于冰的融化导致的液面变化。
5、抽滤（双层滤纸)洗胶（GST）。
将上述上清液抽滤，滤液与GST胶混合，磁力搅拌过夜。
第三天1、抽滤蛋白-胶混合液，滤液取样20µl，留电泳。
2、洗杂蛋白，用1×PBS+PMSF(1000:1)约400ml，洗脱若干次，用移液枪吸去上层泡沫（杂蛋白），至胶上无泡沫为止。
3、洗脱目的蛋白，洗脱液加50ml，分3次进行（15+15+15），每次加入后间歇搅拌，自然静置洗脱15分钟，抽滤，勿使胶干，合并洗脱液，取样20µl，留电泳。
用洗脱液调零，测OD280。
（OD值达到1.5为佳）4、将洗脱液置于透析袋中（透析袋应提前煮好），将透析袋置于2L透析液1中，加入磁珠置于4℃冰箱内磁力搅拌器上，4小时后换为透析液2。
重组结核杆菌融合蛋白工艺流程
重组结核杆菌融合蛋白工艺流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!重组结核杆菌融合蛋白工艺流程重组结核杆菌融合蛋白是一种新型疫苗，可以用于预防结核病。
大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化
⼤肠杆菌表达系统与蛋⽩表达纯化8.⼤肠杆菌表达系统与蛋⽩表达纯化⼤肠杆菌表达系统遗传背景清楚，⽬的基因表达⽔平⾼，培养周期短，抗污染能⼒强等特点, 是分⼦⽣物学研究和⽣物技术产业化发展进程中的重要⼯具。
因此熟练掌握并运⽤⼤肠杆菌表达系统的基本原理和常规操作是对每⼀个研究⽣来说是⾮常必要的。
本章节介绍了实验室常⽤的⼤肠杆菌表达系统的构成特点，归纳了利⽤⼤肠杆菌表达系统纯化重组蛋⽩的基本流程和详细操作步骤，并且结合笔者的操作经验，总结了初学者在操作过程中可能遇到的问题和解决策略。
8.1⼤肠杆菌表达系统的选择与构建8.1.1表达载体的选择根据启动⼦的不同这些载体⼤致可以分为热诱导启动⼦，如λPL，cspA 等和另外⼀类就是⼴泛使⽤的IPTG诱导的启动⼦，如lac，trc，tac，T5/lac operator，T5/lac operator等。
根据表达蛋⽩质的类型可分为单纯表达载体和融合表达载体。
融合表达是在⽬标蛋⽩的N端或C端添加特殊的序列，以提⾼蛋⽩的可溶性，促进蛋⽩的正确折叠，实现⽬的蛋⽩的快速亲和纯化，或者实现⽬标蛋⽩的表达定位。
常⽤的⽤于亲和纯化融合标签包括 Poly-Arg，Poly-His, Strep-Tag Ⅱ，S-tag，MBP等。
其中His-Tag 和GST-Tag 是⽬前使⽤最多的。
His Tag ⼤多数是连续的六个His 融合于⽬标蛋⽩的N端或C端，通过His 与⾦属离⼦：Cu2+>Fe2+>Zn2+>Ni2+ 的螯合作⽤⽽实现亲和纯化，其中Ni2+是⽬前使⽤最⼴泛的。
His 标签具有较⼩的分⼦量，融合于⽬标蛋⽩的N端和C端不影响⽬标蛋⽩的活性，因此纯化过程多不需要去除。
⽬前常使⽤的表达载体主要是由Novagen 提供的pET 系列和Qiagen 公司提供的pQE 系列。
除了His 标签外，还原性⾕胱⽢肽S-转移酶是另⼀种实验室常⽤的融合标签。
它可以通过还原性⾕胱⽢肽琼脂糖亲和层析⽽快速纯化。
1-大肠杆菌重组蛋白表达提取及纯化实验(最新整理)
第一天1、配置LB培养基：酵母粉15g、胰蛋白胨30g、氯化钠30g，定容至3000ml。
调节PH至7.4（2M NaOH），高压蒸汽灭菌20分钟，37℃保存。
分装成15瓶（每瓶200ml）。
2、接种（超净台要提前杀菌通风）取4瓶上述培养基，每瓶加200µlAMP（1:1000）、60µl菌液。
37℃过夜。
第二天1、扩大培养（超净台）4瓶扩至16瓶，每瓶培养基加200µlAMP，摇床培养1小时左右。
2、诱导（超净台）加40µlIPTG，加完后去除封口的除牛皮纸，扎口较松。
25℃摇床培养4小时。
3、离心获取菌体4℃，8000rpm离心25分钟。
注意配平。
4、超声波破碎菌体离心后去上清，向沉淀加入（600mlPB裂解液、300µl溶菌酶、3mlPMSF）。
将菌液转入2个烧杯中，冰浴超声波破菌，400W，75次，每次6秒，间隔2秒。
离心收集上清液。
600mlPB裂解液：20mM/L PB，10mM/L EDTA，5%甘油，1mM/L DTT，调节PH至7.4。
超声波破碎：首先用去离子水清洗探头，再将盛有菌液的小烧杯置于有冰水混合物的大烧杯中，冰水界面略高于菌液面即可。
探头浸没于菌液中，不可伸入过长。
注意破菌过程中由于冰的融化导致的液面变化。
5、抽滤（双层滤纸)洗胶（GST）。
将上述上清液抽滤，滤液与GST胶混合，磁力搅拌过夜。
第三天1、抽滤蛋白-胶混合液，滤液取样20µl，留电泳。
2、洗杂蛋白，用1×PBS+PMSF(1000:1)约400ml，洗脱若干次，用移液枪吸去上层泡沫（杂蛋白），至胶上无泡沫为止。
3、洗脱目的蛋白，洗脱液加50ml，分3次进行（15+15+15），每次加入后间歇搅拌，自然静置洗脱15分钟，抽滤，勿使胶干，合并洗脱液，取样20µl，留电泳。
用洗脱液调零，测OD280。
（OD值达到1.5为佳）4、将洗脱液置于透析袋中（透析袋应提前煮好），将透析袋置于2L透析液1中，加入磁珠置于4℃冰箱内磁力搅拌器上，4小时后换为透析液2。
用超声波破碎仪在破碎大肠杆菌时的技巧
超声波破碎仪在破碎大肠杆菌时的技巧
破碎大肠杆菌用于提取表达外源蛋白，在使用超声波破碎仪之前，用含有1%triton-X-100的PBS悬浮，然后再破碎效果较好，1%triton-X-100的作用还是很明显的，对其他的一些细菌同样起作用，比如链霉菌。
细菌沉淀直接加样品1 buffer，再加5μl的巯基乙醇，混匀，离心，煮沸10min，直接上样，染色脱色步骤如下:将胶放入适量的染色液微波炉里加热1min(下次适当补点醋酸即可),将染色液换成大量的水(自来水即可)在微波炉煮10min 就可以。
在表达重组蛋白后用超声波破碎细胞，采用冰浴，400w，破2s 停1s，但是不一会就产生大量泡沫，影响了破碎功率， pbs和tris缓冲液都是这样，最后都是破碎不完全，而我的目的蛋白就在这些未破碎的细胞中。
1*会产生气泡是因为你的探头位置没放好。
超声波破碎仪探头一定要接近底部，约1cm（推荐是距底部0.5mm）。
功率根据仪器不同会有所不同，但你可以观察液面，有波动但不要太剧烈就好。
2*破3s停10s，破碎20-30个循环观察效果。
3*探头位置摆放也要注意，听声音如果不对的话就要及时调整。
另外可以从菌浓度方面考虑。
在使用超声波破碎时试着加大体积,振幅最好不要超过60%.
4*尝试超8s停8s,对有些菌体蛋白来说，通常方法很难散热，导致蛋白变性产生气泡，最好停顿时间稍长一些，这种情况多见于包涵体形式的蛋白。
如果换用Branson超声波破碎仪来进行工作，由于热耗较小，停顿周期可适当减小。
大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化
大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化一可溶性蛋白的纯化（一）菌体的破碎1.仪器与材料：-80℃冰箱；超声波细胞破碎仪；50mmpbs或50mmtris-hclph7.5；50ml离心管；冷冻高速离心机2.方法2.1反复冻融2.1.1搜集菌液500ml，等分后10份，4000r/min4℃Vergt15min，弃上清。
2.1.2菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mmpbs或50mmtris-hcl（选择使蛋白稳定的缓冲液和ph）重悬洗涤一次。
2.1.3然后按原菌液体积的1/4重新加入缓冲液轻高悬菌体，并重新加入蛋白酶抑制剂pmsf和edta(拎his标签不提)，pmsf终浓度为100μg/ml,edta的终浓度为。
挑20μl 轻高悬菌液展开电泳，检测蛋白抒发的情况（与否抒发，就是可溶性抒发还是涵括体抒发）。
2.1.4将菌液（经检测有表达）在-80度冰冻，室温融解，反复几次（反复冻融三次），由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
2.2超声波处置(对超声波及热脆弱的蛋白禁用)2.2.1将反复冻融的菌液（必要时可加入1mg/ml溶菌酶，缓冲液ph＞8.0，加入后需静置20min），进行超声破碎，超声条件：400w，工作5秒，间隔5秒，重复一定次数，（根据我们的仪器找出一个比较好的工作条件）。
直至菌体溶液变清澈为止，大约花费时间。
2.2.2挑少量经超音波碎裂后的菌液，10000rpmVergt10分钟，分别对上清和结晶展开检测，用全菌做为阳性对照，检测菌体碎裂程度及目标条带占到总蛋白的含量。
注意事项：（1）超音波碎裂具体条件可以根据实验情况而的定，必须掌控不好功率和每次超音波时间，减少蛋白被水解的可能将。
（2）功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，应保持在4度左右，超声时保持冰浴。
（3）菌体碎裂后总蛋白浓度的测量需用bradford法或者紫外稀释法。
（4）可通过sds-page电泳观察菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。
蛋白质的表达、纯化及检测-分子实验报告
实验目的1.了解外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达情况2.学会用SDS-PAGE电泳法分离不同分子量的蛋白质3.学习通过亲和层析法纯化目的蛋白4.学会考马斯亮蓝染色法和蛋白质杂交法检测蛋白质实验原理1.外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达：将外源基因克隆在特殊的表达载体中，让其在E. coli中表达，该表达载体上含有lac操作子的启动子。
在不加诱导剂的条件下培养宿主菌，lacI基因表达的阻遏蛋白LacI与lac操作子结合，使外源基因不能表达；向培养基中加入诱导物IPTG后，LacI阻遏蛋白变构失活，不能与lac操作子结合，外源基因就表达。
2.蛋白质SDS-PAGE电泳分离：SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。
其分离原理是根据蛋白质分子量的差异，因为SDS-PAGE的样品处理液及缓冲液的加入破坏了蛋白质的二级、三级、四级等结构，并使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物，稳定地存在于均一的溶液中，SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷，远远超过其原来所带的电荷，从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计，消除了不同分子之间原有的电荷差别，其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小，这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基。
3.考马斯亮蓝法检测蛋白质：考马斯亮蓝是一种蛋白质染料，主要有R-250和G-250两种类型。
考马斯亮蓝可以和蛋白肽链中碱性氨基酸残基或芳香族氨基酸残基（Arg，Trp，Tyr，His，Phe）结合。
考马斯亮蓝R250多用于聚丙烯酰胺凝胶电泳后蛋白质条带的染色；因为考马斯亮蓝R250中的R代表Red，偏红，红蓝色，与蛋白质结合虽然比较缓慢，但是染料可以穿透凝胶，染胶效果好，染色后为蓝色，且与胶的结合可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。
4.基因融合就是将两个或多个开放读码框按一定顺序连接在一起，融合阅读框架的表达产物是一个杂和蛋白。
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大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化
一可溶性蛋白的纯化
（一）菌体的破碎
1. 仪器与材料：-80℃冰箱；超声波细胞破碎仪；50mM PBS或50mM Tris-HCl pH 7.5；50ml 离心管；冷冻高速离心机
2. 方法
2.1反复冻融
2.1.1收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。
2.1.2 菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mM PBS 或50mM Tris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH）重悬洗涤一次。
2.1.3 然后按原菌液体积的1/4加入缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂PMSF 和EDTA(带His标签不加)，PMSF终浓度为100μg/ml, EDTA的终浓度为。
取20μl重悬菌液进行电泳，检测蛋白表达的情况（是否表达，是可溶性表达还是包涵体表达）。
2.1.4 将菌液（经检测有表达）在-80度冰冻，室温融解，反复几次（反复冻融三次），由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
2.2 超声波处理(对超声波及热敏感的蛋白慎用)
2.2.1 将反复冻融的菌液（必要时可加入1mg/ml 溶菌酶，缓冲液pH＞8.0，加入后需静置20min），进行超声破碎，超声条件：400W，工作5秒，间隔5秒，重复一定次数，（根据我们的仪器找出一个比较好的工作条件）。
直至菌体溶液变清澈为止，大约花费时间。
2.2.2 取少量经超声破碎后的菌液，10000rpm离心10分钟，分别对上清和沉淀进行检测，并用全菌作为阳性对照，检测菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。
注意事项：
（1）超声破碎具体条件可根据实验情况而定，要掌握好功率和每次超声时间，降低蛋白被降解的可能。
（2）功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，应保持在4度左右，超声时保持冰浴。
（3）菌体破碎后总蛋白浓度的测定可用Bradford 法或者紫外吸收法。
（4）可通过SDS-PAGE 电泳观察菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。
二包涵体蛋白的纯化
1 菌体的破碎（加溶菌酶处理包涵体效果可能不好，包涵体中总是有残留的溶菌酶，你看看有没有不加溶菌酶的，这个先保留好了）
1.1仪器与材料：超声波细胞破碎仪；20mM PBS或20mM Tris-HCl pH 7.5；裂解液buffer A；溶菌酶10mg/ml；50ml ，15ml离心管；冷冻离心机
1.2 方法
(1) 收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。
（2）菌体沉淀中加入相同菌液体积的20mM PBS 或20mM Tris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH，一般为7.5-8.0），重悬洗涤2-3次，弃掉上清。
（3）然后沉淀按原菌液体积每500ml以15ml预冷的裂解液bufferA重悬。
(有的文献为每克湿菌加4ml -10ml裂解液)
（4）每毫升悬液中加入100ul 10mg/ml溶菌酶（即溶菌酶终浓度1mg/ml）。
在冰上孵育15min
（5）对15ml悬液进行超声破碎，超声条件：400W，工作5秒，间隔5秒，重复一定次数。
超声破碎时保持冰浴。
具体条件可根据实验情况而定。
（6）4℃，4000 rpm/min离心20分钟所得沉淀即为包涵体。
注意事项：融合蛋白的分子量如果大于150KD时，用超声波破碎很容易将目标蛋白打碎而造成降解，故可用溶菌酶先做处理.
2 包涵体的洗涤
(1) 将包涵体沉淀重悬于含有适量脲（1-4M）的Buffer A中，每克湿重加4-6ml 洗涤液。
(2) 超声波处理5秒打碎沉淀，继续用注射器吸入并挤出悬液，重复数次，4℃涡旋悬液30min。
或者高速搅拌悬液10min。
(3) 4℃，4000 rpm/min离心15分钟。
(4) 重复上述操作2次至上清液透明无色。
(5) 将包涵体沉淀重悬于Buffer A，4℃，4000 rpm/min离心15分钟，弃掉上清。
注意事项：
(1) 包涵体洗涤时增加NaCl浓度到0.5M，有助于包涵体中杂蛋白的溶解。
(2) 经提取洗涤后得到的包涵体，由还原SDS-PAGE电泳结合光密度扫描可知包涵体中目标蛋白的含量。
(3) 包涵体洗涤是纯化极重要的一步，不同培养条件下收集的菌液经洗涤可得到不同的纯度。
50mM Tris-HCl pH 8, 0.2mM EDTA, 100mM NaCl, 1% Triton x-100 （或2% 脱氧胆酸钠）1mM DTT 1mM PMSF 10mg/ml大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化
(4) 用通常的洗涤方法，如果包涵体达不到所需的纯度，可试用分级沉淀法初纯包涵体，步骤如下：
(1) 菌体破碎后将所得的包涵体悬浮于含6mol/L盐酸胍的Buffer A中，4℃涡旋悬液30min ，4000r/min离心20min，上清进行分级沉淀。
(2) 取一小部分上清用Buffer A稀释到盐酸胍浓度为4 M，然后4℃涡旋悬液15min，静置30min，4000r/min离心20min，上清继续稀释到3M，重复上面操作一直到
2M，把每次沉淀和上清跑SDS-PAGE电泳分析，看目标蛋白在哪个盐酸胍浓度下纯度最高。
(3) 摸索好条件后，直接将剩余上清直接用Buffer A稀释到所需的盐酸胍浓度，然后4℃涡旋悬液15min，静置30min，4000r/min离心20min，沉淀既为分级沉淀后的包涵体。
超声破碎
在建立表达条件过程中，小量制备样品可用小型超声细胞粉碎仪。
离心 1.0～1.5ml 诱导后的菌液收集菌体，然后视菌体的量加入300～500μl的缓冲液重悬细胞，然后置于冰上超声破碎。
因很多实验室有自己的小型超声粉碎器,各个操
作不尽相同，具体操作参考仪器说明书。
常规操作步骤如下（以100ml 培养液为例）：
（1）100 ml 诱导后的菌液（OD600=1.2 左右），12000 rpm，4℃离心2min，收集菌体。
（2）加入预冷的缓冲液50ml，重悬细胞洗涤菌体一次，12000 rpm，4℃离心2min，收集菌体；常规的操作所使用的缓冲液多为PBS 或者Tris-NaCl，针对不同的载体和纯化方法，选择相应的缓冲液。
对于一些蛋白酶敏感的目的蛋白，可以在整个操作过程中加入一些蛋白酶抑制剂。
（3）向沉淀中加入15ml的缓冲液同上（若菌体太浓，可加倍），充分悬浮，将菌悬液装在一个玻璃小烧杯中，置于冰水混合物中。
（4）破碎：将用缓冲液洗涤过的超声探头伸入到菌液中，不要接触烧杯底部，每处理30sec间隔1min使菌液冷却，输出强度为5～6，频率为60～70％。
（5）分离上清和沉淀：12000 rpm，4℃离心20min，分离上清和沉淀。
（6）SDS-PAGE 分析蛋白表达情况。
（7）准备纯化蛋白。
超声破碎注意事项与一些小的改进：
（1）破碎完全的判断：超声前菌悬液是浑浊的，超声完全后变的透明、清澈。
（2）如果超声时出现黑色沉淀，说明超声功率太强。
（3）超声时间太长、功率太高对蛋白活性肯定有影响。
（4）尽量防止泡沫的产生。
（5）大量破碎时将菌液置于一玻璃器皿中，破碎时放在冰水混合物中，以增加散热，减小对蛋白的破坏作用。
（6）破碎前的预处理，在破碎前可用溶菌酶（100μg/ml）处理破环细胞壁（10min，30℃），增加细胞的通透性。