蛋白表达纯化实验步骤(参考资料)

合集下载

蛋白表达纯化流程

蛋白表达纯化流程第一章蛋白表达纯化一、诱导表达分析1) 把测序正确的表达质粒转化到合适的表达宿主菌中并涂布在相应抗性的LB 平板上培养过夜;2) 分别挑两个单克隆于3ml含抗生素的LB培养基中培养过夜;3) 按1%接种过夜培养的菌液于4ml含抗生素LB培养基中37度培养2-3小时;4) 加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导表达3个小时左右，取样做蛋白电泳分析目标蛋白的表达情况。

二、蛋白纯化2.1重组蛋白的提取2.1.1 提取缓冲液20 mM Tris-HCl (pH8.0) 或者其他推荐使用的缓冲体系。

如需溶解难溶蛋白或者包涵体还可加入8 M urea 或 6 M guanidine hydrochloride 。

Note: 处理(His)6融合蛋白时可以加入5–50 mM imidazole 以减少上柱时的非特异性吸附。

2.1.2 方法1)发酵液离心收集菌体(at 7 000–8 000 g for 10 minutes or 1 000–1 500 g for 30minutes at +4 °C)。

2)弃去上清液，加入适当的20 mM Tris-HCl (pH8.0)，重悬；3)离心收集菌体同上，弃去上清液，将装有菌体的离心管置于冰中。

4)每ml菌体加入50ul冰冷的提取缓冲液重悬菌体。

5)冰浴中超声裂解菌体(超声2秒，停止6秒)，之后取样进行SDS-PAGE电泳分析。

Note:超声破菌应尽量使用最短的时间，长时间的进行可能会破坏蛋白功能。

还应避免产生泡沫，因为这样会使蛋白变性和导致宿主蛋白与融合蛋白协同纯化。

6)离心使细胞碎片沉降(at 12 000 g for 10 minutes at +4 °C)。

7)小心将上清液移到干净的容器中，并取样进行SDS-PAGE电泳分析。

Note:含有8 M urea的样品可以直接电泳上样，但含有6 M guanidine hydrochloride的样品必须换成8 M urea才可上样。

his蛋白纯化操作步骤全

His蛋白的纯化一目的蛋白样液的收集1：-20度冰箱中取出pet30a-p26甘油菌2：菌种复苏，将5ul P26菌种加入到5ml K+ LB培养基中(1:1000加入卡纳抗生素的LB培养基)，以未加菌的K+ LB培养基作空白对照，37度摇床培养12-16h。

3：扩大培养，将5ml过夜培养的P26菌液按照1:100的比例接种到500ml K+ LB培养基中,摇床培养至OD值为0.6（2h左右）4：诱导表达，扩培后的菌种中加入1mg/ml iptg，使iptg最终浓度1ug/ml(1mmol/l ) 37度摇床培养4h，置-70度保存或立即进行下步操作5:收集包涵体，离心，5000r 15min,弃去上清液(可置于-20度保存)6:溶解包涵体，用PBS重悬细胞沉淀（约每毫升沉淀加5mlPBS）,放在冰上用超声波细胞粉碎机破菌（有效时间30-40min，超5s,停10s,及时换冰防止温度过高使蛋白质变性）7：蛋白提取液的收集，离心，5000r 15min取上清（可4度保存），菌体保存，测菌体中目的蛋白含量大小使用8：介质处理，取出底帽滴出多余液体，柱子顶部朝上直立固定好，蒸馏水洗涤一次，再用2倍树脂体积的1*binding buffer平衡柱子，最后用1*binding buffer配置成50%的树脂。

9：介质与核酸结合，从柱子上部加入蛋白提取液，4度旋转混匀1h，收集流出液(若需要流出液再重新过柱一次，以最大限度提高结合力)10：取10ml 1*binding buffer洗树脂，洗2次，流出液标记洗涤顺序保存11：样品的收集，取10个1.5mlEP管分别标记1,2,3……10，每次取1ml 1*elution buffer加入树脂内滴入标记1-10的EP管内每管6滴（第8管的目的蛋白含量已经很低,10管即可，若需要可适当增加）12：树脂的保存，若样品体积大于柱子体积，树脂10倍体积的PBS重新平衡后可马上使用，若不使用可用蒸馏水洗涤树脂，加入20%乙醇10ml -20度保存（一种蛋白树脂可重复使用，注意不要超过树脂的结合能力）二检测收集的样品中目的蛋白量的大小13：取13个1.5mlEP管，分别标记1#，2#，3#……10#，A,B,C从1号EP 管内取30ul样液于1#号EP管内，依次移取至10号于10#号，取30ul 10步中第一次收集的流出液于标记 A 的EP管中，取30ul第二次收集的流出液于标记 B 的EP管中,将7步中保留的菌体用少量pbs稀释并取30ul于标记C的EP管内。

蛋白纯化过柱具体步骤

蛋白纯化过柱具体步骤
《蛋白纯化过柱具体步骤》
蛋白纯化是生物化学研究中常见的实验技术，通过离子交换柱、亲和层析柱等手段，可以从复杂的混合物中分离纯化目标蛋白。

下面将介绍蛋白纯化过程中的具体步骤。

1. 条件优化
在开始纯化前，重要的第一步是优化实验条件。

这包括确定最佳的缓冲液、pH值、离子浓度和温度等。

这些条件将直接影响到纯化效果和目标蛋白的稳定性。

2. 准备离子交换柱
将离子交换树脂填充到柱中，并将其与离子交换缓冲液预先平衡。

离子交换柱具有吸附和解吸离子的能力，可以根据目标蛋白的特异性选择合适的树脂。

3. 样品负载
将混合物样品加入到经过预平衡的离子交换柱中。

样品中的蛋白将与柱中的树脂发生特定的吸附作用。

4. 柱洗脱
通过逐渐提高离子浓度或使用梯度洗脱缓冲液，将非特异性吸附的杂质从离子交换柱中洗脱。

目标蛋白则因为与柱上树脂的相互作用更强而保留在柱上。

5. 目标蛋白洗脱
选择合适的洗脱缓冲液，通过改变pH值、离子浓度或加入竞争性吸附剂等方法，将目标蛋白从离子交换柱上洗脱下来。

洗脱后的蛋白溶液即为纯化后的目标蛋白。

6. 纯化后处理
对纯化后的目标蛋白进行鉴定和定量分析。

可以使用SDS-PAGE或Western blot等技术来确定纯化效果和蛋白的纯度。

以上就是蛋白纯化过柱的具体步骤。

通过这一系列步骤的操作，可以从复杂的混合物中分离纯化目标蛋白，为后续的生物学研究提供纯净的蛋白样品。

蛋白表达纯化的实验原理

蛋白表达纯化的实验原理蛋白表达与纯化是生物学实验中常用的技术，可以用来研究和生产各种蛋白质。

本文将一步一步回答关于蛋白表达纯化实验的原理和步骤。

第一步：蛋白表达系统的选择蛋白表达系统是指用来制备和表达目标蛋白质的细胞或病毒载体。

常用的表达系统包括细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞等。

选择表达系统时需要考虑目标蛋白的性质、需求量和表达效率等因素。

第二步：构建表达载体表达载体是将目标蛋白的基因序列插入到细胞或病毒载体中，以实现蛋白表达的工具。

通常采用的方法是将目标基因通过限制性内切酶切割，然后与适当的载体连接。

第三步：细胞转染或感染将构建好的表达载体转染到细胞中，使目标蛋白基因在细胞内进行表达。

对于真核细胞（如哺乳动物细胞）可以通过转染的方式传递质粒DNA，而对于原核细胞（如大肠杆菌）可以通过热激转化或电穿孔等方法进行具体的转染。

第四步：培养表达细胞转染或感染后，需要将细胞培养到合适的条件下，以促进目标蛋白表达。

培养条件包括适宜的培养基、温度、氧气供应和营养物等。

此外，可以考虑添加特定的诱导剂或抑制剂，以调控蛋白表达的级别。

对于细菌目标蛋白表达，通常将细胞培养在含有抗生素的培养基上以选择表达带有目标基因的细菌。

第五步：蛋白表达检测为了确定目标蛋白是否在细胞中表达，可以使用多种方法进行检测。

常用的方法包括Western blot、ELISA、原位杂交、荧光染色等。

同时，可以通过调整培养条件或表达载体的构建来提高蛋白表达的水平。

第六步：蛋白纯化蛋白纯化是从表达系统中提取和纯化目标蛋白的过程。

纯化步骤的选择取决于目标蛋白的性质和所需的纯度。

常见的纯化方法包括亲和纯化、凝胶过滤、离子交换、大小排除层析、亲水性层析等。

此外，还可以使用亲和标签（如His标签、GST标签等）来辅助蛋白质的纯化。

第七步：蛋白质的鉴定和定量通过蛋白纯化后，需要对目标蛋白进行鉴定和定量。

可以使用SDS-PAGE、Western blot、质谱分析等方法来确定蛋白质的分子量和纯度。

蛋白表达纯化实验步骤之欧阳文创编

蛋白表达纯化实验步骤(待改进)1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。

2、设计蛋白表达引物。

引物要去除信号肽,要加上适当的酶切位点和保护碱基。

3、RT-PCR,KOD酶扩增获取目的基因c DNA.4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。

5、转化到DH5α感受态细菌中扩增,提质粒。

6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。

表达菌株如Bl21(DE3)、Rosetta gami(DE3)、Bl21 codon(DE3)等。

7、蛋白的诱导表达。

1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右,加入IPTG,浓度梯度从25μM到1m M。

37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。

2)SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。

注:目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带。

3)将有表达的菌株10%甘油保种,保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围。

甘油是用0.22μm过滤除菌的,储存浓度一般是30%-60%,使用时自己计算用量。

4)用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(140-180rpm),诱导过夜作为包涵体检测样品。

注意:1.如果表达的蛋白对菌体有毒性,可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。

葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽,不会影响后面的表达。

2.保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反复冻融。

8、包涵体检测。

方案见附件29、如有上清表达,则扩大摇菌。

1)取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=1.5,约5h左右,视菌种的活性而异,也可过夜摇菌。

2)将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度,250rpm摇至OD= 1.0左右(约2.5h~3h),然后加IPTG(浓度同包涵体检测中使用的浓度。

)注:菌液浓度要适当的浓一些,否则第二天收集不到足够的菌体,因为低温低转速细菌生长非常缓慢。

表达蛋白质纯化实验参考手册

蛋蛋白白质质纯纯化化实实验验室实实验验手手册册 2007年 10月第一章外源基因在大肠杆菌中的表达一、通过聚合酶链式反应（PCR）将靶基因亚克隆到质粒载体上（一）PCR 引物设计的基本原则与 PCR 反应组分和条件1. PCR 引物设计的基本原则（1）引物与靶基因间配对的碱基一般为 1520。

（2）引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象，引物 G + C含量宜在 4555%左右。

（3）引物内部不应形成二级结构，两个引物之间尤其在 3’末端不应有互补链存在。

（4）引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性。

可用计算机进行辅助检索分析。

（5）引物 3’末端一般以单个 C或 G结尾。

2. PCR 反应组分和条件PCR 反应体系一般选用 50 μl体积，其中含有：10×Reaction buffer，5 μl2 个引物，各 12.525 pmol (终浓度各 0.250.50 μmol/L)4 种底物（dATP + dCTP + dGTP + dTTP），各 200μmol/L模板 DNA，100 ng左右Taq DNA 聚合酶，2.53 UPCR 反应条件一般为：（1）94℃，5分钟（2）94℃变性 3060 秒（3）5055℃退火 3060秒（4）7072℃延伸 3060秒℃ 10分钟（5）725共进行 2535次循环。

循环是步骤（2）和（4）(二) 质粒 DNA的小量制备1、传统方法（1）用灭菌牙签挑单菌落于 3 ml LB 培养液中，37℃培养过夜。

（2）在每个 EP管中倒入 1 ml 左右的过夜培养物，6,000 rpm 离心 1分钟以收集菌体。

（3）将菌体重悬于 100 μl 4℃预冷的溶液 I中，并加入 200 μl新配制的溶液 II, 盖紧管口，快速颠倒离心管 67次，然后，冰浴 5 分钟。

生化实验：蛋白提纯

实验操作
一、分段盐析 1 取血清2mL加入刻度离心管中，再逐滴加入饱和
硫酸铵液2mL，静置10分钟。！！！逐滴加入，边加边摇匀。 2 将2张过滤纸置于漏斗上，蒸馏水润湿。 3 将盐析液于滤纸过滤，取澄清过滤液待用。二、凝胶柱制备 1 将层析柱在支架上垂直装好，检查层析柱是否漏水。 2 将小烧杯中凝胶用玻璃棒搅匀，一次性倒入层析柱中 3 凝胶上层保持有1CM蒸馏水。 4 准备好层析洗脱液收集试管，10支，做好编号。胶长于凝胶柱一半以上，胶体要均匀，不可有气泡，裂隙
三、分子筛层析
1 滴管取1ml盐析液（约凝胶胶床表面的平整。，开始收集洗脱液， 15滴/管。
2 待样品快进入胶体，在凝胶上加入蒸馏水，保持蒸馏水于一定高度。
3 收集洗脱液同时，检测每管洗脱液中蛋白含量，取一半洗脱液加入等量三氯乙酸，取白色沉淀最多管为蛋白纯化样品。
4 继续蒸馏水洗脱凝胶柱，直至洗脱液用氯化钡检测无白色沉淀，将凝胶倒回至小烧杯。
四、电泳
1 醋酸纤维素膜粗糙面划点样线 2 巴比妥缓冲液中完全浸湿，不可有白班 3 用盖玻片于点样线处分别点样：
① 原血清 ②蛋白纯化样品 4 双手拿膜，放于电泳槽中，点样端放于负极
！！！快速，膜不可出现白斑点样线不要置于电泳槽纱布上盖玻片垂直点样，血清量少，蛋白量多
实验原理
一、分段盐析
二、分子筛层析
三、电泳
实验结果与讨论
（一）实验结果 1 层析过程中收集洗脱管蛋白含量
表格表示，蛋白含量用＋，－号表示
2 电泳结果将醋酸纤维素膜贴于实验报告册标明：标题、正负极、电泳方向、加样线、样品名称
（二）实验结论
（三）实验分析
（四）思考题：醋酸纤维素膜电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳的区别与优缺点。

蛋白质纯化实验技术报告

蛋白质纯化实验技术报告蛋白质是生物体内最基本的组成成分之一，它在维持生命的各个方面都起着重要的作用，因此，研究蛋白质的纯化技术具有重要的科学意义和应用价值。

本文将从蛋白质的纯化目的、方法选择、实验步骤和结果分析等方面进行详细介绍。

一、纯化目的二、方法选择蛋白质的纯化方法多种多样，常用的包括盐析、凝胶过滤、离子交换、亲和层析、逆流层析等。

在选择方法时，需要根据蛋白质的特性、溶液条件和设备条件等因素进行综合考虑。

三、实验步骤1.细胞破碎和初步纯化：将含有目标蛋白质的细胞悬液经离心分离细胞碎片，得到上清液，进行初步纯化。

2.过滤和沉淀：使用滤膜或沉淀物去除杂质，得到蛋白质溶液。

3.层析纯化：根据蛋白质的性质选择适当的层析柱，如离子交换柱、亲和柱等，进行层析纯化。

4.打破和再层析：对于较复杂的蛋白质混合物，可以使用还原剂或表面活性剂等打破蛋白质复合物，然后再次进行层析纯化，以提高纯化效果。

5.纯化评价：使用聚丙烯酰胺凝胶电泳或质谱等方法对纯化后的蛋白质样品进行评价，确认其纯度和活性。

四、结果分析根据实验结果，可以评估所选纯化方法的有效性和适用性，判断所得纯化样品的纯度和活性。

同时，还需对纯化条件进行优化，以进一步提高纯化效果。

五、结论本实验采用了其中一种纯化方法成功地获得了目标蛋白质的高纯度和高活性样品，并对其进行了初步的理化性质分析。

结果表明，所选的纯化方法具有较高的有效性和适用性，可以应用于进一步的研究和应用。

综上所述，蛋白质纯化实验是一项复杂而重要的工作，需要根据蛋白质的特性和实验条件等因素进行综合考虑，以选择合适的纯化方法。

通过详细的实验步骤和结果分析，可以得出纯化效果的评价和结论，并为进一步的研究提供有价值的参考。

大量纯化蛋白的简易步骤

纯化蛋白的简易步骤纯化1.配制培养基LB, 挑取菌种至含有抗生素的LB液体培养基中(50ml+1管菌种)，37 ℃ 220rpm培养。

2.取10mL培养的菌液转接到1000 mL新鲜的LB抗性培养基中，37 ℃220 rpm培养至OD600≈0.4-0.5。

3.将培养箱温度调至20℃，转速调至180rpm，继续培养约0.5h-1h（取出1mL菌液作为诱导前对照）。

之后加入1 M IPTG至终浓度为0.1-1 mM（本次实验的浓度为0.1mM），继续诱导培养大约9-10小时（取出1mL菌液作为诱导后对照）。

4.4℃，4000rpm离心，15min收集菌体。

沉淀可冻于-80℃保存（做蛋白结晶尽量不要冻存）。

5.配制buffer A，如下6.加入适当的buffer A （含有100mM PMSF 1：100、10mg/mL Dnase 1: 1000、2M MgCl21:2000）。

1000mL菌液收的菌，加入30mL即可，太少超声时容易起泡。

7.混匀后冰上放置20Min，期间不时的震荡。

混合物使用液压破碎（比超声破碎好）。

8.离心10000rpm，4℃，45min，彻底去除菌体碎片，取上清备用。

（一定不要菌体碎片！取4ul+4ulLB 作为binding前的对照）9.Ni beads的预处理：取适量beads，加入适量的buffer A，如800uL beads（1000mL菌液沉淀）加入1mL buffer A，800rpm，2.5min，洗3次。

10.将步骤6所得的上清与预处理好的beads加入50mL的离心管中，封口膜封口后，静音混匀器4℃binding1-2h（时间过长蛋白易降解）。

11.将binding后的溶液过柱（取4ul+4ulLB 作为binding后的对照），加入10CV wash buffer，放置10min后冲洗（取4ul+4ulLB 作为wash后的对照）。

Wash buffer: buffer A+20mM imidazole12.洗好的beads加入适量（5CV）的elution buffer，放置10min后洗脱。

蛋白质纯化实验步骤

蛋白质纯化实验步骤引言:蛋白质是生物体内重要的基本组成部分，对于深入了解蛋白质的结构和功能具有重要意义。

蛋白质纯化是一个关键步骤，可以从复杂的混合物中分离出目标蛋白质，并去除杂质。

下面将介绍一种常用的蛋白质纯化实验步骤。

一、样品制备在开始蛋白质纯化实验之前，首先需要准备样品。

样品可以是细胞提取物、培养基中的蛋白质等。

样品制备的关键是要保证样品的完整性和纯度，避免蛋白质的降解和杂质的污染。

二、离心将样品进行离心，以去除细胞碎片和细胞核等大颗粒物质。

离心过程中，可以根据颗粒物质的大小和密度来选择合适的离心条件，如转速、离心时间等。

三、初步分离将离心后的上清液取出，进行初步分离。

可以采用一些常用的分离技术，如离子交换色谱、凝胶过滤等。

这些技术可以根据蛋白质的电荷、大小等特性进行分离，从而使目标蛋白质得到部分纯化。

四、亲和层析亲和层析是一种常用的蛋白质纯化技术，通过利用目标蛋白质与某种亲和剂之间的特异性相互作用来实现纯化。

亲和剂可以是金属离子、抗体、配体等，可以根据目标蛋白质的性质和特点来选择合适的亲和剂。

五、凝胶电泳凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和分析技术，通过电场作用使蛋白质在凝胶中迁移，根据蛋白质的大小和电荷来实现分离。

凝胶电泳可以用于检测和鉴定目标蛋白质，同时也可以用于纯化蛋白质。

六、柱层析柱层析是一种常用的蛋白质纯化技术，通过将样品溶液通过填充在柱子中的吸附剂层析，实现蛋白质的分离和纯化。

柱层析可以根据蛋白质的性质和特点来选择合适的吸附剂，如离子交换柱、凝胶过滤柱等。

七、透析透析是一种常用的蛋白质纯化技术，通过溶液之间的渗透压差来实现目标蛋白质的分离和杂质的去除。

透析可以用于去除一些小分子杂质，如盐类、小分子药物等。

八、浓缩浓缩是一种常用的蛋白质纯化技术，通过去除大量的水分来提高目标蛋白质的浓度。

常用的浓缩技术有深度过滤、超滤等，可以根据蛋白质的分子量和颗粒大小来选择合适的浓缩方法。

九、纯化验证在蛋白质纯化实验结束之后，需要对纯化后的目标蛋白质进行验证。

蛋白质表达与纯化步骤

蛋白质表达与纯化步骤一、蛋白质表达的那些事儿蛋白质表达就像是一场神奇的魔法秀，要让小小的基因变成实实在在的蛋白质呢。

咱先得从基因开始说起。

基因就像是一个藏着宝藏密码的小纸条，我们要把这个密码找出来，然后送到一个特殊的“工厂”里，这个“工厂”就是细胞啦。

在细胞这个“大工厂”里，有各种各样的“小工人”，也就是各种酶和分子机器。

我们要把基因送到细胞里，就像是把宝藏密码送到工厂里一样。

不过这可不是随随便便就能送进去的，得用一些特殊的方法，就像你要进一个很严格的地方得有通行证一样。

比如说，我们可以用一些载体，这些载体就像是小飞船，带着基因这个“乘客”进入细胞。

而且呀，不同的细胞就像不同的工厂，有的擅长生产这种蛋白质，有的擅长生产那种蛋白质。

所以我们得挑选合适的细胞。

要是选错了细胞，就可能像把做蛋糕的配方送到做鞋子的工厂一样，完全不对路嘛。

1. 基因的准备我们得先把想要表达的基因从它原来的地方给找出来。

这有时候就像在一个超级大的图书馆里找一本特定的书一样难。

我们可能得用一些特殊的工具，像是限制酶，它就像一把小剪刀，可以把基因从长长的DNA链上准确地剪下来。

然后我们还得把基因整理得干干净净的，不能有其他乱七八糟的东西混在里面，就像我们要把书擦干净，不能有灰尘一样。

2. 载体的选择载体的种类可多啦。

有质粒载体，它就像一个小小的环状“快递盒”，可以把基因装在里面。

还有病毒载体，这就更酷了，就像用一个小病毒来当快递员，不过这个病毒是经过我们改造的，不会让人生病的哦。

选择载体的时候，我们要考虑很多东西，比如这个载体能不能在我们选定的细胞里生存呀，它能装多少基因呀，就像我们选快递盒的时候要考虑大小和能不能送到目的地一样。

二、蛋白质纯化的趣味之旅当蛋白质在细胞里被表达出来后，就像一堆宝贝混在沙子里一样，我们得把蛋白质这个宝贝给挑出来，这就是蛋白质纯化啦。

这可不容易呢，因为细胞里有各种各样的东西，有其他的蛋白质，有核酸，还有各种小分子。

蛋白质的表达、分离、纯化实验流程

蛋白质的表达、分离、纯化实验流程蛋白质表达、分离、纯化可以：（1）探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理；（2）供作结构与功能的研究；（3）作为催化剂、营养剂等。

实验步骤一：材料准备1. 实验材料：大肠杆菌BL21、LB 液体培养基、氨苄青霉素、Washing Buffer、Elution Buffer、IPTG、蒸馏水、胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠2. 实验仪器：摇床、离心机、层析柱、离心管、移液枪、枪头盒、烧杯、玻璃棒二：实验操作1.试剂准备：2.2. 获得目的基因①PCR 方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR 循环获得所需基因片段。

②通过RT-PCR 方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR 循环获得产物。

3. 构建重组表达载体①载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit 或冻融法回收载体大片段。

②PCR 产物双酶切后回收，在T4DNA 连接酶作用下连接入载体。

4. 获得含重组表达质粒的表达菌种①将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp 或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。

②测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作。

否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。

③以此重组质粒DNA 转化表达宿主菌的感受态细胞。

5. 氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导①接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21 菌株于 5 mL LB 液体培养基中（含100 ug/mL 氨苄青霉素），37 ℃震荡培养过夜。

②按1:50 或1:100 的比例稀释过夜菌，一般转接 1 mL 过夜培养物于100 mL（含100 ug/mL 氨苄青霉素）LB 液体培养基中，37 ℃震荡培养至OD600 = 0.6 - 0.8（最好0.6，大约需3 h）。

蛋白的表达纯化

蛋白的表达纯化一、溶液配制1×SDS凝胶上样缓冲溶液配方：Tris-HCl pH6.8 50mmol/L巯基乙醇 5%SDS 2%溴酚蓝 0.1%甘油 10%蛋白纯化配制以下溶液，用于重组蛋白的镍螯合层析分离：低浓度咪唑缓冲液（Low imidazole buffer, L-buffer）Na2HPO4- NaH2PO4 pH7.4 20mMNaCl 0.5mol/LImidazole 25mM高浓度咪唑缓冲液（High imidazole buffer, H-buffer）Na2HPO4- NaH2PO4 pH7.4 20mMNaCl 0.5mol/LImidazole 500mM二、天然条件下小量纯化目的蛋白步骤：1)当诱导表达的菌体浓度达到一定程度时，测定培养物的OD600值，4℃，12000rpm离心5min，收集菌体。

2)用L-Buffer洗涤菌体一次，然后重悬至OD600=20，冰浴条件下超声破碎菌体细胞10min（功率320W）。

然后4℃，12000rpm离心30min。

3)取1ml上清转入1.5ml的干净离心管中，加入50ulNi-NTA Agrose，4℃轻柔混匀结合60min。

4)12000rpm离心10S，小心吸去上清。

5)用100ul的L-Buffer漂洗树脂，操作时要轻柔混匀。

12000rpm离心10S，小心吸去上清，漂洗两次。

6)用20ul的H-Buffer洗脱目的蛋白，操作时要轻柔混匀，12000rpm离心10S小心将上清转入干净小管中，洗脱四次。

7)SDS-PAGE分析各管组分。

1-大肠杆菌重组蛋白表达提取及纯化实验（最新整理）

1-大肠杆菌重组蛋白表达提取及纯化实验（最新整理）第一天1、配置LB培养基：酵母粉15g、胰蛋白胨30g、氯化钠30g，定容至3000ml。

调节PH至7.4（2M NaOH），高压蒸汽灭菌20分钟，37℃保存。

分装成15瓶（每瓶200ml）。

2、接种（超净台要提前杀菌通风）取4瓶上述培养基，每瓶加200μlAMP（1:1000）、60μl菌液。

37℃过夜。

第二天1、扩大培养（超净台）4瓶扩至16瓶，每瓶培养基加200μlAMP，摇床培养1小时左右。

2、诱导（超净台）加40μlIPTG，加完后去除封口的除牛皮纸，扎口较松。

25℃摇床培养4小时。

3、离心获取菌体4℃，8000rpm离心25分钟。

注意配平。

4、超声波破碎菌体离心后去上清，向沉淀加入（600mlPB裂解液、300μl溶菌酶、3mlPMSF）。

将菌液转入2个烧杯中，冰浴超声波破菌，400W，75次，每次6秒，间隔2秒。

离心收集上清液。

600mlPB裂解液：20mM/L PB，10mM/L EDTA，5%甘油，1mM/L DTT，调节PH至7.4。

超声波破碎：首先用去离子水清洗探头，再将盛有菌液的小烧杯置于有冰水混合物的大烧杯中，冰水界面略高于菌液面即可。

探头浸没于菌液中，不可伸入过长。

注意破菌过程中由于冰的融化导致的液面变化。

5、抽滤（双层滤纸)洗胶（GST）。

将上述上清液抽滤，滤液与GST胶混合，磁力搅拌过夜。

第三天1、抽滤蛋白-胶混合液，滤液取样20μl，留电泳。

2、洗杂蛋白，用1×PBS+PMSF(1000:1)约400ml，洗脱若干次，用移液枪吸去上层泡沫（杂蛋白），至胶上无泡沫为止。

3、洗脱目的蛋白，洗脱液加50ml，分3次进行（15+15+15），每次加入后间歇搅拌，自然静置洗脱15分钟，抽滤，勿使胶干，合并洗脱液，取样20μl，留电泳。

用洗脱液调零，测OD280。

（OD值达到1.5为佳）4、将洗脱液置于透析袋中（透析袋应提前煮好），将透析袋置于2L透析液1中，加入磁珠置于4℃冰箱内磁力搅拌器上，4小时后换为透析液2。

蛋白可溶表达与纯化的详细实验过程

蛋白可溶表达与纯化的详细实验过程丁香园chrispp作品。

一、证明目的蛋白有表达1、挑取一单菌落接种于含氨苄(Amp，终浓度为100g/mL)的3mL液体LB培养基中37℃，250rpm培养过夜。

2、将过夜培养菌液以1:100转接于含上述抗生素的100mL液体LB 中，37℃，250rpm，3.5h（大量培养至OD600＝0.6左右）。

3、取出1 mL菌液为未诱导的电泳对照，剩余培养液加入诱导物IPTG至终浓度为1 mmol/L，继续振荡培养4h。

4、以未诱导菌液与IPTG诱导后菌液作对比，SDS-PAGE检测。

结果如下：图11: pET-32aA3未诱导，2: pET-32aA3未诱导，3: pET-32aA3诱导后，4: pET-32aA3诱导后二、表达的情况，是可溶还是沉淀1、将上述的37℃诱导菌液离心（4℃，12000g，5min），弃上清（LB培养液），沉淀重悬于0.9% NaCl 溶液洗菌。

2、将重悬于0.9% NaCl的菌体溶液离心（4℃，12000g，5min），弃上清（0.9% NaCl洗菌液），得菌体，称菌体重量，重悬于8mL PBS（pH 7.0）缓冲液，缓冲液用量根据50~100mg/mL的菌液终浓度。

3、超声破菌：冰浴条件下，超声波破碎大肠杆菌，超声设置如下功率：400W，工作：15s，间隔：45s，全程时间：30min（30次左右）以菌液由白变透明，且不粘稠为依据（少量菌液用液氮反复冻融7次以上效果也不错，而且简单，但是DNA出来后会粘稠，可能加dna 酶后会好些，那样好离心，我是用接近最高转速离心的（没加dan酶），不然分不开）4、将超声波破碎的菌液离心（4℃，12000g，15min），分别收集上清和沉淀，各取1mL，加入1mL 2×上样缓冲液，沸水浴10min，SDS-PAGE检测。

结果如下：图21: pET-32aA3诱导上清，2: pET-32aA3诱导沉淀三、探索可溶表达条件有上述实验结果可知，目标蛋白在上清也有表达，即存在可溶性的表达，但是量很少，大部分也包涵体的形式存在（沉淀中），而包涵体的存在也证明了蛋白表达量很高，上清可溶蛋白的可操作性等因素都优于对包涵体蛋白的分离纯化，所以可通过探索可溶表达条件，最终来加大上清蛋白的含量，以利于下一步实验的进行。

蛋白表达纯化实验步骤之欧阳歌谷创作

蛋白表达纯化实验步骤(待改进)欧阳歌谷（2021.02.01）1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。