木瓜蛋白酶的提取纯化实验报告
木瓜蛋白酶的纯化和鉴定方法研究
木瓜蛋白酶的纯化和鉴定方法研究木瓜蛋白酶（Papain）是一种广泛存在于木瓜中的天然酶，具有优异的蛋白水解能力和广泛的应用领域。
对于木瓜蛋白酶的纯化和鉴定方法的研究，可以为其在食品、药物和生物技术等领域的应用提供重要的理论和实践基础。
纯化木瓜蛋白酶的常用方法主要包括：硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析等。
首先，通过将木瓜果肉或木瓜乳剂进行初步的提取和分离，得到粗木瓜酶液或浓缩液。
接下来，通过酸性、碱性或酶处理等方法，将杂质蛋白质去除，然后经过一系列的层析纯化步骤，最终获得纯度较高的木瓜蛋白酶。
其中，离子交换层析是最常用的纯化方法之一。
离子交换层析是根据蛋白质与固定在固定相上带电的离子交换基团之间的相互作用进行纯化的。
通常使用阳离子交换剂如DEAE-Sepharose CL-6B或阴离子交换剂如CM-Sepharose CL-6B作为固定相，可实现木瓜蛋白酶与其他蛋白质之间的分离。
通过控制缓冲液的pH和离子强度，可以调节木瓜蛋白酶在层析柱上的吸附和洗脱，从而实现对其的纯化。
凝胶过滤层析是另一种常见的纯化方法，其基本原理是根据蛋白质分子大小的差异进行纯化。
凝胶过滤层析对分子量较大且较纯的蛋白质具有较好的分离效果。
在纯化木瓜蛋白酶时，可以选择适当的凝胶过滤层析介质，如Sephadex G-75或Sephadex G-100等，将混合溶液在凝胶柱上进行层析，分离出目标蛋白质。
除了纯化方法的研究外，正确鉴定木瓜蛋白酶的纯度和活性也是非常重要的。
鉴定木瓜蛋白酶的常用方法主要包括：SDS-PAGE电泳、活性测定和质谱鉴定等。
其中，SDS-PAGE电泳是一种常用的蛋白质分子量分析方法，它可将蛋白质按照分子量大小进行分离和定量。
通过在分离凝胶上染色或通过Western blotting方法检测，可以确定木瓜蛋白酶的纯度和分子量。
活性测定是评价木瓜蛋白酶酶活性的重要手段。
常用的活性测定方法包括卟啉-酪蛋白分光光度法、酪蛋白分解能力法等。
木瓜蛋白酶
食品添加剂木瓜蛋白酶学院:食品与营养工程学院专业:食品加工班级:食工102学号:010*******姓名:王瑞真木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶又称木瓜酶，是一类疏基蛋白酶。
广泛存在与番木瓜的根、茎、叶和果实内，在未成熟的乳汁中含量最丰富。
它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特色，因此在食品、医药、饲料、皮革及纺织等行业得到广泛应用[1]。
一、木瓜蛋白的组分工业用的木瓜蛋白酶一般都是未经纯化的多酶体系。
由木瓜乳胶提取粗制酶,除含有木瓜蛋白酶外,还含有半耽氨酸蛋白酶、纤维素酶、溶菌酶、谷氨酞胺以及低相对分子质量的疏基化合物,还有葡萄糖酶等。
其中大部分都是疏基蛋白酶,主要的两种组分是木瓜凝乳酶和木瓜蛋白酶[2]。
二、木瓜蛋白的结构木瓜乳汁中四种已知半肤氨酸蛋白酶的一级结构具有高度同源性,其氨基酸数目和同源性比较如表1所示。
除chymopapain含有8个半肤氨酸外,其余三种酶都只含有7个半肤氨酸。
25位的流基是活性位点,不参与二硫键的形成（chymopapain的117位琉基也不参与二硫键的形成 ）,其余疏基以相同的方式形成三个二硫键，具有同样的保守性。
人们在不同清晰下得到了四种酶的X 一射线结构。
四种酶的肤链折叠方式相似,形成两个大小相、构型不同的区域。
一个是由a一螺旋构成的L一区,另一个是由大量反向平行的片层构成的R一区。
活性位点氨基酸残基Cys25,Asn179和His159 就位于这些区域的表面,其中Cys25位于 L一区,起始a一螺旋上。
木瓜蛋白酶家族的Cys25 ，Gly23，Gly65 形成的S。
亚部位是一个大口袋，对底物专一性影响较小；S亚部位由于酶不同其氨基酸组成不同,几何形状亦不同,对酶的性质影响较大[3]。
三、木瓜蛋白酶的提取工艺1.过去的常规提取方法木瓜蛋白酶最原始的提取方法是烘干法，就是在番木瓜浆液中加入保护剂，然后将浆液离心取上清液放置于鼓风干燥箱中，在55～60℃烘干，粉碎后即得到粗酶制品。
木瓜蛋白酶的提取
木瓜蛋白酶的提取、分离纯化及其生物学研究综述及实验方法13生物技术第二大组第二小组组员：王玓玥（组长）、王子贺、王思瑶、王宇涛、王守鑫、谭国栋一、研究背景：在经济飞速发展的今天，人们的生活水平已远远不只在于吃饱穿暖，食品的安全和营养问题受到人们越来越多的关注，绿色健康的生活也成为大家共同的追求，木瓜蛋白酶以它自身耐热及特殊结构等特点被广泛的用于食品行业，如何分离纯化得到高纯度低成本的木瓜蛋白酶则是人们现在研究的重点，本小组便也以此为研究主题展开实验。
二、木瓜蛋白酶基本介绍：木瓜蛋白酶，又称木瓜酶，是一种蛋白水解酶。
木瓜蛋白酶是番木瓜中含有的一种低特异性蛋白水解酶，广泛地存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。
木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸，属于巯基蛋白酶，它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特点，这种蛋白水解酶，分子量为23406，由一种单肽链组成，含有212个氨基酸残基。
至少有三个氨基酸残基存在于酶的活性中心部位，他们分别是Cys25、His159和Asp158，当Cys25被氧化剂氧化或与金属离子结合时，酶的活力被抑制，而还原剂半胱氨酸（或亚硫酸盐）或EDTA能恢复酶的活力木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。
它的外观为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性；木瓜蛋白酶溶于水和甘油，水溶液为无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。
木瓜蛋白酶是一种含巯基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，但几乎不能分解蛋白胨。
木瓜蛋白酶的最适合PH值6～7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点（pI）为8.75；木瓜蛋白酶的最适合温度55～65℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。
另外六个半胱氨酸残基形成了三对二硫键,且都不在活性部位。
木瓜蛋白酶实验指导
实验一木瓜蛋白酶的提取及其活性测定一、实验目的通过本实验，要求学习和掌握木瓜蛋白酶酶源的选取、木瓜乳汁的采集及蛋白酶粗酶制剂提取等的基本原理和方法；学习并掌握木瓜蛋白酶活性的测定方法以及酶样中蛋白质含量的测定。
二、实验原理木瓜蛋白酶大量存在于木瓜汁液中，是一种巯基蛋白酶，其分子量为23900。
木瓜蛋白酶最适pH随底物而异，当以酪蛋白为底物时，酶的最适pH为7。
据此原理，本实验以未成熟的木瓜果实为材料，从果皮中采集新鲜乳汁，利用木瓜蛋白酶在pH7.2的磷酸缓冲液、35℃条件下水解底物酪蛋白产生酪氨酸，酪氨酸在275nm处有最大吸收峰，根据吸光值的大小反映酪氨酸的浓度，进而反映木瓜蛋白酶催化水解的反应速率，以此衡量该酶的活性。
考马斯亮蓝G-250在酸性条件下能够与蛋白质结合，形成的络合物在595nm 处具有最大吸光值，且吸光值的大小与蛋白质的含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。
三、实验材料和用具1、实验材料：新鲜、未成熟的木瓜。
2、试剂：0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.2）；1%的酪蛋白溶液：称1g的酪蛋白用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.2）配至100mL；激活剂：用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.2）配制含半胱氨酸20mmol/L，EDTA 1mmol/L的混合液；10%三氯乙酸（TCA）：称10g的TCA定容至100 mL；考马斯亮蓝G-250：称0.1g考马斯亮蓝G-250溶于50mL90%乙醇溶液中，加入85%磷酸溶液100mL，用蒸馏水定容到1000mL。
3、仪器、用具：恒温水浴锅、电子天平、紫外-可见分光光度计、研钵、烧杯、量筒、试管、移液管、吸耳球、漏斗、滤纸、标签纸、试管架、牙签等。
四、实验步骤1．木瓜乳的采集选取挂果30天以上的木瓜果实，用湿棉布小心擦净表面，用牙签等利器，在果实的表面划若干条深约3mm的划痕，此时有大量白色乳汁流出，于木瓜底部用干净的烧杯收集乳汁，片刻后收集的乳汁便会凝固。
木瓜汁中提取木瓜蛋白酶--实验设计
木瓜汁中提取木瓜蛋白酶一、粗酶制备（冻存、调整浓度）1.蛋白质浓度（考xx蓝法）二、纯化和固定化1.双水相（PEG/磷酸盐）萃取，再过阳离子纯化；2.粗酶直接亲和磁珠纯化和固定化（咪唑梯度洗，电泳看效果）；3.先双水相，取PEG相（上清）用亲和磁珠纯化和固定化；三、纯度1.快速蛋白质液相色谱；2.非变性碱性蛋白质电泳；四、酶活性1.水解酪蛋白活性（固定化率和活力回收率、固定化酶的温度、pH等、重复使用）；2.水解IgG检测特异性；五、载体/相表征亲和磁珠：TEM、粒径、电势、磁滞回线、红外；双水相：一、xx木瓜制备粗酶[1,2]1.新鲜的木瓜用去离子水洗干净，再用不锈钢刀在果实上做了4到6个纵向2-3mm深的切口，让分泌出的乳胶顺着果实向下滴入冰浴的烧杯中。
-20 ℃存放。
（或者10mL汁液加90mL pH 6.0的PBS，搅拌15min，4℃9000×g离心取上清（除去不溶物），最后测定并调整上清中的蛋白质的浓度。
）2.将解冻后的乳胶与40mM半胱氨酸按3:1(w/v)的比例混合，用6MHCl将悬浮液调整为pH 5.6，在4 ℃搅拌15 min，过滤并用6 M NaOH将滤液pH调整为9.0，4 ℃ 9000×g离心取上清（除去不溶物），最后测定上清中的蛋白质含量，然后用水/PBS调节。
可省略。
3.[1]NitsawangS,Hatti-KaulR,KanasawudP.PurificationofpapainfromCaricapapayalatex:Aqueoustwo-phaseextractionversustwo-stepsaltprecipitation[J].Enzyme & Microbial Technology, 2006, 39(5):1103-1107.[2] Rocha M V, Giacomo M D, Beltramino S, et al. A sustainable affinity partitioningprocess to recover papain from Carica papaya, latex using alginate as macro-ligand[J].Separation & Purification Technology, 2016, 168:168-176.。
木瓜蛋白酶活性实验报告
一、实验目的1. 了解木瓜蛋白酶的性质和作用机理。
2. 探究不同条件对木瓜蛋白酶活性的影响。
3. 通过实验验证木瓜蛋白酶在食品加工中的应用潜力。
二、实验原理木瓜蛋白酶是一种含疏基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力。
木瓜蛋白酶的活性受pH、温度、离子强度等因素的影响。
本实验通过测定木瓜蛋白酶在不同pH、温度和离子强度下的活性，探讨其活性影响因素。
三、实验材料1. 木瓜蛋白酶样品2. 酚酞指示剂3. 酶反应缓冲液4. 硫酸铜溶液5. 碘液6. pH计7. 恒温水浴锅8. 移液器9. 试管四、实验方法1. pH对木瓜蛋白酶活性的影响（1）取5支试管，分别加入0.5ml酶反应缓冲液，编号为1、2、3、4、5。
（2）分别向5支试管中加入0.1ml木瓜蛋白酶样品，编号为1、2、3、4、5。
（3）分别向5支试管中加入0.5ml不同pH的酶反应缓冲液（pH 2、4、6、8、10）。
（4）将5支试管置于37℃恒温水浴锅中保温10分钟。
（5）向5支试管中加入0.5ml酪蛋白溶液，摇匀。
（6）观察并记录各试管溶液的颜色变化。
2. 温度对木瓜蛋白酶活性的影响（1）取5支试管，分别加入0.5ml酶反应缓冲液，编号为1、2、3、4、5。
（2）分别向5支试管中加入0.1ml木瓜蛋白酶样品，编号为1、2、3、4、5。
（3）分别将5支试管置于0℃、20℃、37℃、50℃、70℃恒温水浴锅中保温10分钟。
（4）向5支试管中加入0.5ml酪蛋白溶液，摇匀。
（5）观察并记录各试管溶液的颜色变化。
3. 离子强度对木瓜蛋白酶活性的影响（1）取5支试管，分别加入0.5ml酶反应缓冲液，编号为1、2、3、4、5。
（2）分别向5支试管中加入0.1ml木瓜蛋白酶样品，编号为1、2、3、4、5。
（3）分别向5支试管中加入不同离子强度的硫酸铜溶液（0.01mol/L、0.05mol/L、0.1mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L）。
木瓜蛋白酶提取
0.615
500
15.35 7675.0 27.50
211.1
硫酸铵一次纯 化上清
+
乙 4'
0.292 500
7.09 3545.0 10.00
35.5
硫酸铵二次纯 化沉淀
醇 9'
0.228 500
5.46 2730.0 10.00 27.3 乙醇沉淀
编号
稀释倍 待测管吸
数
光度
1
10000. 0
1.348
18.28 9140.0 12.50
4.06 2030.0 10.00
络氨酸标 准液
酶活(u)
蛋白质 （酶） 含量(mg)
68911.9 169.1
95.6 114.3 20.3
乙醇沉淀
硫酸铵一次 纯化上清
硫酸铵二次 纯化沉淀
酶比活 (u/mg)
乙醇+硫酸铵
410.0
粗提
5’ 5000 0.284 0.201
35.5
1090.0
硫酸铵二次 纯化沉淀
9’ 5560.0 0.479 0.308
62,850. 1 27.3 2300.0 乙醇沉淀
9’’ 5560.0 0.433 0.314
70,314.0 27.3 2570.0 透析
乙 编号 醇1
吸光度值
稀释倍数
标准曲线查 得值浓度 （ug/ml)
测得蛋白质 浓度(ug/ml)
在 275nm 处侧吸 光值
吸光 度 A
A0
取酪氨酸溶液，以蒸馏水为空白，测定吸光度
An
硫 编号 酸1 铵2
吸光度值
0.676
稀释倍数
标准曲线查 得值浓度 （ug/ml)
木瓜蛋白酶的提取与分离纯化的方法
木瓜蛋白酶的提取与分离纯化的方法木瓜蛋白酶（papain）是一种天然的蛋白酶，广泛应用于食品、制药等行业中。
其提取与分离纯化的方法可以分为以下几个步骤：1.选择合适的木瓜品种：不同品种的木瓜蛋白酶活性不同，因此选择具有较高酶活性的木瓜品种对提取纯化效果至关重要。
2.酶源准备：将选好的木瓜切成小块，去掉果肉，保留果实中的细胞浆和硬实质。
然后将木瓜块浸泡于缓冲液中，以提取木瓜蛋白酶。
3.离心分离：将浸泡木瓜块的混合液进行离心分离，以去除果肉等杂质，得到较为纯净的木瓜蛋白酶液。
4.澄清液处理：将离心分离得到的液体通过滤纸或滤膜进行澄清，去除悬浮的固体颗粒。
5.蛋白酶的分离：通过离心、超滤、透析等手段，将木瓜蛋白酶与其他蛋白质分离，得到较为纯净的蛋白酶液。
6.结晶纯化：可以采用醇沉淀、浓缩、结晶等方法对蛋白酶进行纯化。
其中，醇沉淀方法是常用的分离纯化方法之一，通过醇的添加，使蛋白酶蛋白质聚集并沉淀下来，然后进行洗涤、溶解等操作，最终得到纯净的木瓜蛋白酶。
7.洗脱：将获得的木瓜蛋白酶溶解于缓冲液中，使其达到所需的适宜酶活性和稳定性。
8.酶活性测定：用适当的方法测定提取分离纯化后的木瓜蛋白酶的活性，以确定其纯化程度和活性。
需要注意的是，木瓜蛋白酶的提取与分离纯化过程中，应注意保持温度、pH值等参数的控制，以防止酶的失活或蛋白质的降解。
同时，在纯化过程中需要使用无菌操作，以防止细菌、病毒等污染物的引入。
总结起来，木瓜蛋白酶的提取与分离纯化的方法包括酶源准备、离心分离、澄清液处理、蛋白酶的分离、结晶纯化、洗脱和酶活性测定等步骤。
通过合理的步骤设置和操作，可以得到较为纯净、高活性的木瓜蛋白酶，以满足工业和科研的需求。
木瓜蛋白酶的提取纯化实验报告
木瓜蛋白酶的分离纯化一、目的（1）它是利用未成熟的番木瓜（Carica papaya）果实中的乳汁中提取粗酶液，并进一步纯化，获得高纯度的木瓜蛋白酶。
（2）通过此次试验，熟悉掌握木瓜蛋白酶分离纯化的基本步骤和原理，了解离心分离，萃取等实验技术。
二、原理木瓜蛋白酶（ Papain ）是一种巯基蛋白酶，它分解比胰脏蛋白水解酶更多、更广泛的蛋白底物。
它也具有脂酶活力。
其分子量约为 23000 左右。
在 25 ℃ , pH6.2 时， 1 分钟生成1umol酪氨酸的酶量为 1 单位。
木瓜蛋白酶是单条肽链，有 211 氨基酸残基折叠成两部分形成裂缝，酶分子只有 1 个巯基，对酶活力是必需的，激活剂有半胱氨酸，硫化物，亚硫酸盐和 EDTA ；抑制剂有巯基试剂，包括重金属和羧基试剂和过氧化氢。
酪蛋白是一种蛋白质，它被木瓜蛋白酶降解生成的酪氨酸在紫外光区275nm 处有吸收峰，根据测定 275nm 处的吸收值，可以判定木瓜蛋白酶的酶活力。
吸收值的大小与酪氨酸含量的多少有关，吸收值大说明酪氨酸含量高，也就是说木瓜蛋白酶分解的酪蛋白多，酶活力高。
三、实验材料番木瓜汁；PEG (聚乙二醇，分子量为6000)； (NH4)2SO4；三氯乙酸(TCA)；酪氨酸；考马斯亮蓝四、仪器设备（ 1 ）离心机 4000-1000rpm （冷冻式或非冷冻式）（ 2 ） 752 紫外分光光度计（ 3 ）水浴箱（ 4 ）冰箱（ 5 ）榨汁机五、玻璃器皿（以组为单位）试管（ 6 ）， 100 mL 烧杯（ 2 ），吸管（ 1 ）、玻棒（ 1 ），试剂瓶（ 1000 mL 、 500 mL 、 250 mL 等），移液管或移液器5mL(1) 、 1mL(2) 、 0.5mL （ 1 ），漏斗（ 3 ），滤纸（ 3-6 ）等六、实验试剂配制及实验步骤（一）酪氨酸的标准曲线将上述各管混匀，静置2min, 测定各管的A 275nm，做标准曲线，曲线如下：（二）粗酶活测定1 试剂（ 1 ） 3mg/ml 木瓜蛋白酶液（用 0.1mol/L 的磷酸缓冲液， pH 7.2 配制）（ 2 ）0.1mol/L 的磷酸缓冲液， pH 7.2（ 3 ）用 0.1mol/L 磷酸缓冲液（ pH 7.2 ）配制含 80mmol/L 半胱氨酸（ 4 ）1% 酪蛋白溶液：用 0.1mol/L 磷酸缓冲液（ pH 7.2 ）配制（ 5 ）15% 三氯乙酸（ TCA ）溶液2 方法量取酶液0.2 mL，加入激活剂0.25 mL于带塞试管中，在37℃水浴中保温8 min，吸取预热37℃酪蛋白液（质量分数为1%）1 mL加入此管，在37℃水浴中反应10 min，加入三氯乙酸（TCA）2 mL摇匀，静置5 min；另取样液（已激活）0.3 mL置另一带塞试管中，加入TCA 2 mL，37℃保温10 min后，加入预热至37℃的酪蛋白液1 mL，静置5 min，测2个管的A275 nm值，同时做2个平行试验。
木瓜蛋白酶的提取
木瓜蛋白酶的提取一、实验内容与目的从青木瓜中提取木瓜蛋白酶，用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度。
通过本实验，掌握天然活性化合物的提取和蛋白质浓度的测定技术。
二、实验原理（一）木瓜天然酶木瓜蛋白酶（papain），简称木瓜酶，又称为木瓜酵素。
他是一种含硫基（—SH）肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，它还具有合成功能，能把蛋白质水解物合称为蛋白质。
木瓜蛋白酶溶于水和甘油，水溶液无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇。
氯仿和乙醚等有机溶剂。
其最适pH为5.7（一般3~9.5皆可），在中性或偏酸性时亦有作用，等电点18.75；最适温度为55~60℃（一般10~85℃皆可），耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，受还原性物质激活。
木瓜蛋白酶广泛存在于番木瓜（Carica papaya）茎叶和果实中，以未成熟果实的乳汁中为最高。
提取未成熟的番木瓜果实中的乳汁，采用现代生物工程技术提炼可得纯天然生物酶制品。
（二）考马斯亮蓝结合法（Bradford法）测定蛋白质浓度的原理在一定范围内，考马斯亮蓝G250蛋白复合物呈色后，在595nm下，吸光度与蛋白质含量关系呈线性关系，故可以用蛋白质浓度的测定。
三、实验材料1.材料青木瓜2.试剂氢氧化钠、磷酸、考马斯亮蓝G250、牛血清蛋白、95%乙醇3.主要仪器设备离心机、磁力搅拌器、刀片、电子天平、紫外可见分光光度计、冰箱、pH计。
四、实验步骤（一）木瓜蛋白酶的提取（1）用薄不锈钢刀片沿未成熟的番木瓜过时的纵线将果皮割破，深度为2~3nm，根据果实大小的不同，每个果实可以切5~10条刀口。
（2）将木瓜放于一个大烧杯中，适度挤压木瓜，使木瓜乳汁流入大烧杯中。
（3）将手机的乳液按1:1量加入蒸馏水，搅拌1h，用NaOH将pH调至9.0。
（4）将乳液用离心机在3500r/min的条件下，离心15min。
木瓜蛋白酶提取实验方案课件资料
实验设计题目：木瓜蛋白酶的提取,纯化分离及其生物学研究一、实验原理：木瓜蛋白酶（papain）又称木瓜酶，广泛存在于番木瓜的根、茎、叶和果实，未成熟果实的乳汁中含量最丰富。
是一种含疏基（-SH）肽链的内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力；同时还具有合成的功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。
工业用的木瓜蛋白酶一般都是未经纯化的多酶体系。
现已知经木瓜乳汁干燥而得的木瓜蛋白酶至少含有四种主要酶类：木瓜蛋白酶（papain）、木瓜凝乳蛋白酶（chymopapain）、木瓜蛋白酶Ω（papaya proteinaseΩ）、木瓜凝乳蛋白酶M（chymopapain M），其中木瓜凝乳蛋白酶的含量最多，占可溶性蛋白的45%。
木瓜蛋白酶易溶于水和甘油，水溶液为无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于有机溶剂。
它的最适pH值为5.7（一般3～9.5皆可），在中性或偏酸性时亦有作用；最适温度为55～60℃（一般10～85℃皆可），耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。
本实验主要采取有机溶剂沉淀法结合硫酸铵分级沉淀法来提取番木瓜中的木瓜蛋白酶。
有机溶剂沉淀法：有机溶剂能降低溶液的电解常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导溶解度的降低，另外，有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法。
有机溶剂分段沉淀法它常用于蛋白质或酶的提纯。
使用的有机溶剂多为乙醇和丙酮。
高浓度有机溶剂易引起蛋白质变性失活，操作必须在低温下进行，并在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以避免局部浓度过大。
硫酸铵分级沉淀法：硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。
高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。
各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。
酶的提取综述实验报告(3篇)
第1篇一、实验背景酶作为一种生物催化剂，在生物化学、医药、食品加工等领域具有广泛的应用。
酶的提取是研究酶性质和应用的基础，本实验报告对酶的提取方法进行综述，包括提取原理、常用提取方法、提取条件以及应用前景等。
二、实验目的1. 了解酶的提取原理和常用提取方法。
2. 掌握酶提取过程中的关键因素，如pH、温度、溶剂等。
3. 分析酶提取在各个领域的应用前景。
三、实验原理酶的提取原理主要基于酶的物理和化学性质。
酶作为一种蛋白质，具有特定的三维结构，能够在特定的条件下发挥催化作用。
酶的提取通常包括以下步骤：1. 细胞破碎：将含有酶的细胞或组织破碎，释放酶蛋白。
2. 酶的纯化：通过层析、离心、沉淀等方法，将酶蛋白从其他蛋白质和杂质中分离出来。
3. 酶的稳定化：通过添加稳定剂等方法，提高酶的稳定性。
四、实验方法1. 细胞破碎方法：- 机械破碎：采用研磨、超声波等方法。
- 化学破碎：采用酶解、溶胀等方法。
2. 酶的纯化方法：- 离心分离：根据酶蛋白的密度和形状，通过离心分离。
- 层析法：根据酶蛋白的亲和性、电荷等性质，通过层析法分离。
- 沉淀法：通过改变pH、盐浓度等方法，使酶蛋白沉淀。
3. 酶的稳定化方法：- 添加稳定剂：如磷酸盐、糖类等。
- 调节pH和温度：保持酶的活性。
五、实验结果与分析1. 细胞破碎方法：- 机械破碎：适用于酶蛋白含量较高的细胞，但可能导致酶活性降低。
- 化学破碎：适用于酶蛋白含量较低的细胞，但可能引入杂质。
2. 酶的纯化方法：- 离心分离：简单易行，但纯度较低。
- 层析法：纯度较高，但操作复杂。
- 沉淀法：操作简单，但纯度较低。
3. 酶的稳定化方法：- 添加稳定剂：能提高酶的稳定性，但可能影响酶活性。
- 调节pH和温度：能保持酶的活性，但可能影响酶的稳定性。
六、实验讨论1. 酶的提取方法应根据酶蛋白的性质、含量、应用领域等因素综合考虑。
2. 提取过程中，应尽量减少酶的活性损失，提高提取效率。
木瓜蛋白酶的提取纯化实验报告
木瓜蛋白酶的提取纯化实验报告实验报告：木瓜蛋白酶的提取纯化摘要：本实验旨在提取和纯化木瓜蛋白酶。
首先将木瓜果肉和磷酸盐缓冲液混合，经过搅拌、离心和滤过将悬浮液收集。
然后使用硫酸铵沉淀法对混合液进行蛋白质沉淀，再经过柱层析纯化得到木瓜蛋白酶。
通过测定酶活，纯化程度和回收率，验证提取和纯化方法的有效性。
结果表明，经过提取纯化的木瓜蛋白酶具有较高的纯化程度和酶活，回收率较高。
1.引言木瓜蛋白酶是一种广泛存在于木瓜中的蛋白酶，具有广谱的活性，可以降解多种蛋白质。
因此，木瓜蛋白酶在食品、制药等工业中具有广泛的应用价值。
本实验旨在研究提取和纯化木瓜蛋白酶的方法，为其进一步应用奠定基础。
2.材料与方法2.1材料：-木瓜果肉-磷酸盐缓冲液-硫酸铵-超滤膜-柱层析填料2.2方法：1)将木瓜果肉剁碎后加入磷酸盐缓冲液中，搅拌均匀。
2)将混合液经过离心，收集上清液。
3)对上清液进行反复滤过，去除颗粒杂质。
4)将上清液与硫酸铵混合，使其浓度达到80%，沉淀蛋白质。
5)使用超滤膜对上清液进行浓缩，得到蛋白质浓缩液。
6)将蛋白质浓缩液加入柱层析柱，经过洗脱得到纯化酶溶液。
7)对纯化后的酶溶液进行酶活测定、纯化程度测定和回收率计算。
3.结果与讨论经过提取纯化，得到的木瓜蛋白酶具有较高的酶活。
酶活测定结果显示，提取纯化后的酶活达到了5000单位/毫升。
与未经提取纯化的酶溶液相比，酶活提高了约2倍，表明提取纯化方法可以有效提高木瓜蛋白酶的酶活。
纯化程度测定结果显示，经过柱层析纯化后，木瓜蛋白酶的纯化程度较高。
使用SDS-方法对柱层析纯化前后的样品进行分析发现，纯化后的酶样品中只存在单一的酶带，而纯化前的样品中存在多个酶带，进一步说明了提取纯化方法的有效性。
回收率计算结果显示，经过提取纯化后，木瓜蛋白酶的回收率较高。
计算结果表明，提取纯化后酶的回收率在80%以上，较未经处理的酶溶液回收率有明显提高。
综上所述，本实验通过提取和纯化方法成功得到了酶活高、纯化程度较高且回收率较高的木瓜蛋白酶样品。
高纯度木瓜蛋白酶的分离纯化和性质研究_王丽彬
Proc Natl Acad Sci US A,1970,67(4):187821885.[5] K odama E N,M cCaffrey R P,Y usa K,et al.antileukem icactivity andmechanism of action of cordycepin against term inal deoxynucleotidyl trans ferase2positive(TdT+)leukem ic cells[J].Biochem Pharm, 2000,59(3):2732281[6] Sugar A M,M cCaffrey R P.Antifungal activity of3′2deoxyadenosine(cordycepin)[J].Antim icrob Agents Chem other,1998,42(6):14242 1427.[7] Ahn YJ,Park S J,Lee S G,et al.C ordycepin:selectivegrowth inhibitorderived from liquid culture of cordyceps m ilitaris against Clostridium spp[J].J Agric F ood Chem,2000,48(7):274422748.[8]Choy J H,K wak S Y,Park J S,et al.Intercalative nanohybrids of nucle2oside m onophosphates and DNA in layered metal hydroxide[J].J Am Chem S oc,1999,121(6):139921400.[9]Choy J H,K wak S Y,Jeong YJ,et al.Inorganic layered double hydrox2ides as nonviral vectors[J].Angew Chem Int Ed Engl,2000,39(22): 404124045.[10]K wak S Y,Jeong Y J,Park J S,et al.Bio2LDH nanohybrid for genetherapy[J].S olid S tate I onics,2002,151(1):2292234.[11]Y ang Q Z,Sun D J,Zhang C G,et al.Synthesis and characterization ofpoly oxyethylene sulfate intercalated M g2Al2Nitrate layered double hy2 droxide[J].Langmuir,2003,19(14):557025574.[12]Ling J Y,Y ang J,Y ang Q Z,S tudy on intercalative nanohybrid ofcordycepin lay ored double hydroxide[J].Chinese Chem ical Letter, 2003,14(10):109721101.[13]王伯坛,李玉松,黄高升,等.病理学技术[M].北京:人民卫生出版社,2000:2952302.高纯度木瓜蛋白酶的分离纯化和性质研究王丽彬,张 ,王 (中国药科大学生命科学与技术学院,江苏南京210009) 摘 要:目的建立木瓜蛋白酶的分离纯化工艺路径。
木瓜蛋白酶的提取及应用研究进展
木瓜蛋白酶的提取及应用研究进展赵电波，陈茜，张丽尧(郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州450002)摘要：本文主要介绍木瓜蛋白酶的组成，重点阐述提取方法、提取工艺的研究进展，进一步介绍木瓜蛋白酶在食品工业特别是在食品加工中的应用，并对其在医药、化工及未来食品加工方面的应用前景进行展望。
关键词：木瓜蛋白酶；提取工艺；食品加工；应用Progress of Extraction and Application of Technology of PapainZHAO Dianbo, CHEN Xi, ZHANG Liyao（College of Food and Biotechnology Engineering, Zhengzhou University of Light Industry, HenanZhengzhou 450002, P. R. China）Abstract: The composition of papain was described, and its extraction methods, research of extractiontechnology had been highlighted. Applications of papain in food industry, particularly in food processing itwas further described, and its applicationsinpharmaceutical, chemical industry and the future prospects offood processing have been prospected in this article.Key words:papain;extractiontechnology; food processing; application中图分类号：TS201.1文献标识码：A文章编号：1001-8123(2010)11-0019-05木瓜蛋白酶（papain）来源于未成熟番木瓜（Carica papaya）果实的新鲜乳汁，是一种含疏基（-SH）肽链的内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力；同时还具有合成的功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。
酶工程实验报告
酶工程实验报告指导老师：学号：20070830姓名：班级：生物技术班**师范大学生命科学学院07级2010-11-15生物工程实验指导（酶工程部分）实验一木瓜蛋白酶的分离纯化及酶活检测一、概述以半胱氨酸内肽酶为主（包括木瓜蛋白酶，简称PAP、木瓜蛋白酶Ω，简称CAR、木瓜凝乳蛋白酶，简称CHP和木瓜凝乳蛋白酶M，简称GEP）的木瓜蛋白酶是从植物番木瓜中分离纯化而得的一种混合酶。
这种酶广泛存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内，其中以为成熟的果实乳汁中含量最高，约占乳汁干中的40%。
其最大的用途是在食品工业方面，防除啤酒冷藏混浊，嫩化肉类，生产调味品，烘烤面包，乳酪制品及谷类和速溶食品的蛋白质强化生产。
在动物饲料加工方面，用于鱼蛋白浓缩物和油籽饼处理，能提高氮的可溶性指数和蛋白质的可分散指数。
少量在皮革工业作软化剂、纺织工业作丝织品脱胶清洁剂和废胶卷回收报等。
在医药方面，主要用于治胃炎、消化不良以及用于肉赘摘除、伤痕处理、脱毛、清洁皮肤和新近的裂腭整形外科及制木瓜凝乳蛋白酶注射剂治疗脊骨盘脱出症等。
木瓜蛋白酶是一种巯基蛋白酶，其专一性较差，能分解比胰脏蛋白酶更多的蛋白质。
木瓜蛋白酶是单条链，有211个氨基酸残基组，相对分子量23000。
木瓜凝乳蛋白酶，相对分子量36000，约占可溶性蛋白质的45%。
溶菌酶，相对分子量2500，约占可溶性蛋白质的20%。
木瓜蛋白酶为白色、淡褐色无定型粉末或颗粒。
略溶于水、甘油，不溶于乙醚、乙醇和氯仿。
水溶液无色至淡黄色，有时呈乳白色。
最适pH为5.0～8.0，微吸湿，有硫化氰臭。
最适温度65℃，易变性失活。
木瓜蛋白酶等电点pH＝9.6。
半胱氨酸、硫化物、亚硫酸盐和EDTA是木瓜蛋白酶激活剂，巯基试剂和过氧化氢是木瓜蛋白酶的抑制剂。
二、实验目的1、学习和掌握木瓜蛋白酶分离纯化的原理、方法和工艺过程，包括盐析、酶活力保护、结晶与重结晶。
2、掌握木瓜蛋白酶活力的测定方法和原理。
木瓜蛋白酶提取实验记录
木瓜蛋白酶实验记录2016.11.3实验前准备：所需试剂的配制：饱和硫酸铵：取150ml蒸馏水，放入冰桶中，不断加入硫酸铵固体，直至沉淀不能溶解，过滤取滤液，保存在4℃冰箱中。
酶保护剂：准确称量1.21g的半胱氨酸于100ml蒸馏水中，调节PH 至9.0，溶解半胱氨酸，再加入0.1871g的EDTA，定容至250ml，转入棕色瓶中。
预实验：确定实验的可行性酶液提取：①用薄的不锈钢刀片沿未成熟的番木瓜的纵线将果皮割破，深度为2~3mm，根据果实大小的不同，每个果实可以5~10条刀口。
②将木瓜放于一个大烧杯中，使木瓜乳汁流入大烧杯中。
③收集5ml乳汁加入95ml蒸馏水水，匀速轻柔搅拌1h，得浆液。
④浆液用8层纱布进行过滤,将所得液分装到离心管中，用离心机在3500r/min的条件下，离心15min。
⑤收集上清液至一洁净的试管中，既得木瓜蛋白酶原液，-20℃存取10ml酶原液。
⑥分装木瓜蛋白酶原液，加入2ml酶保护剂（0.04mol/L的半胱氨酸和0.002mol/L的EDTA），混匀后如下表加入试剂。
对静置的酶液继续处理2016．11.4试剂配制考马斯亮蓝G-250染液（0.01%）：称取0.1g考马斯亮蓝G-250固体粉末，溶于50mL 95%乙醇中（95%乙醇取实验室无水乙醇47.5mL加2.5mL蒸馏水）再加入86% 磷酸100mL，倒入1000mL容量瓶加蒸馏水定容至1000mL。
静置1h后，取棕色试剂瓶用乙醇清洗干净用滤纸过滤溶液后封存。
重提木瓜蛋白酶实验设置对照一组开始即加入酶保护剂编号酶B*、一组加硫酸铵之前才加酶保编号酶*。
①用薄的不锈钢刀片沿未成熟的番木瓜的纵线将果皮割破，深度为2~3mm，根据果实大小的不同，每个果实可以5~10条刀口。
②将木瓜放于一个大烧杯中，使木瓜乳汁流入大烧杯中。
③收集10ml乳汁加入190ml蒸馏水水，匀速轻柔搅拌1h，得浆液。
④浆液用8层纱布进行过滤,将所得液分装到离心管中，用离心机在3500r/min的条件下，离心15min。
木瓜蛋白酶的提取
（3）木瓜蛋白酶是一种胶体物质，生产过程中容易产生气泡而造成损失。
（4）过程中制得得单宁沉淀物，可经60℃真空干燥、粉碎后制得粗酶，适用于食品及制革等对酶纯度要求不高的工业；洗脱后酶得度高，适用于科学事业、作为化妆品成分或是医疗卫生行业。
（5）如需要制备用于医药原料，则对于生产过程中的卫生条件有严格的要求；同时木瓜蛋白酶是一种水解酶，对人体的皮肤有刺激分解的作用，所以生产人员必须穿戴工作服、工作帽、口罩、手套和胶鞋等卫生防护用品
在番木瓜的茎、叶中含有木瓜蛋白酶,但在实际生产中,主要是从未成熟的生番木瓜果实中收集果皮创口流出的白色浆液,经过加工提纯后得到。木瓜蛋白酶的生产以番木瓜未成熟果实的新鲜乳汁为原料，但因番木瓜种植区主要分布在经济不发达地区，所以蛋白酶生产工艺相对落后，很多地区仍采用太阳暴晒的方式生产木瓜蛋白酶。另外，对于木瓜蛋白酶的商业化生产来说，不同用途的酶所要求的纯度存在相当大的差异……近年来，木瓜蛋白酶在工业上的应用日趋广泛，对其纯度要求也更高，因此，有必要对提取纯化工艺开展深入的研究。下面主要介绍一种简单的提取纯化途径。
提取与纯化途径：
木瓜蛋白酶的分离纯化_关于食品生物化学综合设计性实验的构思_李妍
第２７卷第５期肇庆学院学报Ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．５２００６年１０月ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＺＨＡＯＱＩＮＧＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＯｃｔ．２００６收稿日期：２００５－１２－２９作者简介：李妍（１９７８－），女，黑龙江肇东人，肇庆学院轻工化学系副教授，博士．木瓜蛋白酶的分离纯化———关于食品生物化学综合设计性实验的构思李妍，黄志明（肇庆学院轻工化学系，广东肇庆５２６０６１）食品生物化学是食品专业本科学生的一门专业基础课，为了将这门课的理论教学与实际应用结合起来，需要开设大量的实验课．目前已开设的实验多为基础验证性实验，为了强化学生分析和解决问题的能力，有必要在该课程实验中增加综合设计性实验．木瓜蛋白酶是一类巯基蛋白酶，广泛地存在于番木瓜（Ｃａｒｉｅａｐａｐａｙａ）的茎叶和果实中，未成熟的乳汁中含量最高．因其含量高、稳定性好、蛋白水解能力强，对多种蛋白质均具有很好的降解作用，目前已被广泛应用于各个行业［１］．在食品中，木瓜蛋白酶被用于肉类嫩化、啤酒澄清和鱼类加工等工艺中．由于此酶为纯天然产物，其开发前景广阔．在本科实验中引入这一综合设计性实验，可以使学生通过实验熟悉酶和蛋白质的提取与纯化方法，掌握相关的实验技能和实验手段，加深对理论知识的理解和学习．１综合设计性实验的内容１．１木瓜蛋白酶粗酶的分离制备实验以未成熟的木瓜为原料．木瓜蛋白酶是一种胞外酶，能分泌到乳汁中，可直接将木瓜乳汁进行低温真空干燥，再经粉碎就可以得到木瓜蛋白酶的粗品．为了避免干燥过程中木瓜蛋白酶失活，可在木瓜乳汁中加入适量的保护剂，保护木瓜蛋白酶中的活性巯基，常用的保护剂有ＥＤＴＡ、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠等．本实验的关键是选择适宜的保护剂．教师可指导学生通过查阅文献，对保护剂的种类和使用量进行筛选，以保证良好的分离效果．实验可以粗酶的提取率和酶的比活力作为评价指标．１．２粗酶的纯化粗酶中除了含有木瓜蛋白酶外，还含有其他的蛋白质和小分子物质，需要通过盐析等方法对其进一步纯化．对于木瓜蛋白酶纯化的研究报道也较多，乙引等［２］对木瓜乳汁进行真空干燥，用（ＮＨ４）２Ｓ０４沉淀方法分别得到了木瓜蛋白酶的粗品和精品．本实验选择饱和硫酸铵盐析法纯化木瓜蛋白酶，纯化期间仍要注意对酶活性的保护．盐析是目前常用的蛋白质分离技术，采用这种方法进行酶的纯化，不仅可将酶与蛋白质联系起来，而且可以使学生掌握蛋白质分离常用方法的原理和操作步骤．盐析是通过中和蛋白质表面的电荷和破坏蛋白质的水化层实现分离，实验的关键是饱和硫酸铵添加浓度的确定．学生不仅要通过查阅资料确定实验条件，还要了解分离原理，以便对实验进行充分的准备．在此基础上，学生还要学摘要：针对食品生物化学课的实际情况，提出了开设综合设计性实验的思路，初步给出了木瓜蛋白酶分离纯化实验的内容，旨在为今后的实验提供理论指导．关键词：食品生物化学；综合设计性实验；酶的分离纯化中图分类号：Ｇ６４２文献标志码：Ａ文章编号：１００９－８４４５（２００６）０５－００３６－０３第５期李妍等：木瓜蛋白酶的分离纯化３７会积极思考，注意实验操作过程中的问题和细节，以逐渐增强科研意识及解决问题的能力．１．３木瓜蛋白酶性质的测定得到纯化酶后，需要对其性质进行测定．首先，通过蛋白质的凝胶电泳测定蛋白质的分子量分布，电泳是基于蛋白质的两性解离和等电点的性质加以分离的方法．实验中应用ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳，对上述不同分离阶段的酶样均进行测定，比较纯化的效果．根据实验中应用的已知分子量的蛋白质和木瓜蛋白酶对照样，可以推算分离得到的木瓜蛋白酶的分子量情况．在实验过程中，需要学生配制电泳用分离胶和浓缩胶，要灌胶、操作电泳仪，并进行胶的染色和脱色．由此加深学生对电泳原理、电泳仪操作原理和方法的了解，掌握电泳法测定蛋白质分子量的一般操作步骤，发现并解决实验过程中出现的问题．根据实验不同分离阶段所得样品的电泳带，学生可以直观地看到酶纯化的情况．木瓜蛋白酶是一种巯基蛋白酶，本实验中要对木瓜蛋白酶的自由巯基进行测定，我们采用ＤＴＮＢ（硝基苯甲酸二硫化合物），反应后测定产物在４１２ｎｍ的吸光度．这是测定半胱氨酸巯基的常用方法．１．４蛋白质浓度和木瓜蛋白酶酶活力的测定方法蛋白质浓度可以采用Ｆｏｌｉｎ－酚比色法、考马斯亮蓝比色法和双缩脲比色法进行测定，相比而言，双缩脲比色法的灵敏度要低于前２种方法．本实验选用考马斯亮蓝比色法进行蛋白质含量的测定，显色后测定波长为５９５ｎｍ．此方法不受酚类、游离氨基酸和小分子肽的影响，在０．０１～１．０ｇ6Ｌ蛋白质含量范围内均可使用．木瓜蛋白酶活力的测定采用酪蛋白为底物，加入酶的保护剂，用Ｆｏｌｉｎ－酚试剂显色，测定６８０ｎｍ波长下的吸光度后计算得到酶活力．酶的比活力是指酶总活力与蛋白质含量的比值．蛋白质和酶是食品生物化学课中２项重要的内容．通过这部分实验，不仅可以使学生熟悉测定蛋白质浓度和酶活力的方法，而且可以将实验现象与课本的理论知识结合起来，提高学生学习的积极性和效率．２开设综合设计性实验的意义综合设计性实验是将基础理论知识与多种实验技能和方法归纳、分析并相互渗透的一种有效的实验形式．它在一定程度上弥补了传统实验的缺陷，具体说来，它有以下特点：实验技能的综合性、实验操作的独立性和实验过程的可思考性［３］．开设综合性实验的意义有如下５点．１）增加理论教学与实践的联系，培养学生应用知识的能力．综合性实验的开设，既可使学生将理论知识通过实验与应用过程结合起来，还可使他们将本来分散的知识块联系起来，将各部分的学习通过实验有效地融合在一起，从而强化他们对这门课的整体认识和应用能力．木瓜蛋白酶的分离纯化实验就综合了多方面知识，包括蛋白质含量测定、分离纯化方法和酶活力测定等内容，而且涉及的理论均为本课程的重点知识，这有利于激发学生对理论知识学习的兴趣，从而达到更好的学习和应用效果．２）多种实验过程综合，增强了学生的综合实验操作技能．传统实验多针对某一部分的知识进行实验应用，而综合设计性实验是将多个部分的知识有机地串联起来，给予学生综合实验技能的训练．开设上述实验，既能有效利用实验室的现有资源，还能将多个实验结合起来训练学生的综合技能，有利于提高学生的综合素质．３）学生独立设计完成实验，增强了学生的科学研究意识．通过实验，学生开始能够灵活运用所学知识分析和解决实际问题，同时提高了他们通过查阅资料获取信息的能力，培养了学生独立、认真、严谨的科研和工作态度．在上述实验中，学生需要通过查阅资料选择实验参数，设计实验方案，还要独立开展物质的制备及性质分析．这使学生了解了科学研究的一般程序，提高了对科学研究的肇庆学院学报第２７卷３８认识和兴趣，为今后的研究和工作打下坚实的基础．４）培养了学生的创新性．木瓜蛋白酶分离纯化实验是目前食品科学领域研究的热门问题，它的开设有利于培养学生的开拓和创新精神．综合设计性化学实验的开设方式打破了多年来传统实验教学模式的禁锢，改变了过去各基础实验自成体系、相互脱节的状况，有利于增强学生的现代实验意识和创新意识，对贯彻素质教育和实现学生的全面发展具有重要意义．５）强化了学生的语言文字表达能力．综合实验的目标是将理论知识与实际操作进行有机结合，因此实验报告中应包括对实验结果和存在问题的讨论，还应指出改进实验方案的措施．学生在提出问题和论述观点的过程中，语言文字表达能力得到了训练和强化．３结语木瓜蛋白酶来源于木瓜，而木瓜目前主要作为食物来食用，对于其中存在的蛋白酶进行分离、纯化和检测，恰好属于食品生物化学研究的范畴．在木瓜蛋白酶分离纯化这个综合设计性实验中，涉及到多个生物化学的常用实验技术，这一实验对学生实验技能的训练是综合的、多方面的，而且实验以学生为主体，能以一种更为直观能动的方式使学生达到学习的目的．当然，学生在实验过程中还需要教师的指导、协助，教师要负责编写实验指导书、审定实验方案和准备工作，使学生能够顺利开展实验．此外，教师还要对学生进行实验方向的指导并修改学生的实验报告，这样才可保质保量地开设综合设计性实验．实验教学是高等教育的一个重要环节，综合设计性实验的开设不仅是培养研究型和应用型人才的基本需要，而且是高等教育改革的重要内容，对高校教育水平的提高具有重要的现实意义．参考文献：［１］邓静，吴华昌，周健．木瓜蛋白酶研究进展［Ｊ］．广西轻工业，２００３（３）：５－７．［２］乙引，张显强，唐金刚，等．木瓜蛋白酶的纯化和性质［Ｊ］．贵州师范大学学报：自然科学版，２００２，２０（ｌ）：１１－１４．［３］黄丽群，彭悦．综合设计性化学实验探讨［Ｊ］．江西化工，２００４（４）：６９－７８．ＳｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＰａｐａｉｎ—ＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅＤｅｓｉｇｎｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＰｒｏｊｅｃｔｏｆＦｏｏｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ——ＬＩＹａｎ，ＨＵＡＮＧＺｈｉｍｉｎｇ（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＬｉｇｈｔＩｎｄｕｓｔｒｙａｎｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＺｈａｏｑｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＧｕａｎｇｄｏｎｇＺｈａｏｑｉｎｇ５２６０６１，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｄｅｓｉｇｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｐｒｏｊｅｃｔｈａｓｂｅｅｎｐｒｏｐｏｓｅｄａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏａｃｔｕａｌｓｉｔｕａｔｉｏｎｏｆｆｏｏｄｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｃｏｕｒｓｅ．Ｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆｓｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐａｐａｉｎｈａｖｅｂｅｅｎｓｉｍｐｌｙｌｉｓｔｅｄ．Ｉｔｗｉｌｌｐｒｏｖｉｄｅｔｈｅｏｒｙｇｕｉｄｅｆｏｒｆｕｔｕｒｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｆｏｏｄｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｄｅｓｉｇｎｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ；ｓｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｅｎｚｙｍｅ（责任编辑：陈静）。
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木瓜蛋白酶的分离纯化
一、目的
（1）它是利用未成熟的番木瓜（Carica papaya）果实中的乳汁中提取粗酶液，并进一步纯化，获得高纯度的木瓜蛋白酶。
（2）通过此次试验，熟悉掌握木瓜蛋白酶分离纯化的基本步骤和原理，了解离心分离，萃取等实验技术。
二、原理
木瓜蛋白酶（ Papain ）是一种巯基蛋白酶，它分解比胰脏蛋白水解酶更多、更广泛的蛋白底物。
它也具有脂酶活力。
其分子量约为 23000 左右。
在 25 ℃ , pH6.2 时， 1 分钟生成1umol酪氨酸的酶量为 1 单位。
木瓜蛋白酶是单条肽链，有 211 氨基酸残基折叠成两部分形成裂缝，酶分子只有 1 个巯基，对酶活力是必需的，激活剂有半胱氨酸，硫化物，亚硫酸盐和 EDTA ；抑制剂有巯基试剂，包括重金属和羧基试剂和过氧化氢。
酪蛋白是一种蛋白质，它被木瓜蛋白酶降解生成的酪氨酸在紫外光区275nm 处有吸收峰，根据测定 275nm 处的吸收值，可以判定木瓜蛋白酶的酶活力。
吸收值的大小与酪氨酸含量的多少有关，吸收值大说明酪氨酸含量高，也就是说木瓜蛋白酶分解的酪蛋白多，酶活力高。
三、实验材料
番木瓜汁；PEG (聚乙二醇，分子量为6000)； (NH4)2SO4；三氯乙酸(TCA)；酪氨酸；考马斯亮蓝
四、仪器设备
（ 1 ）离心机 4000-1000rpm （冷冻式或非冷冻式）
（ 2 ） 752 紫外分光光度计
（ 3 ）水浴箱
（ 4 ）冰箱
（ 5 ）榨汁机
五、玻璃器皿（以组为单位）
试管（ 6 ）， 100 mL 烧杯（ 2 ），吸管（ 1 ）、玻棒（ 1 ），试剂瓶（ 1000 mL 、 500 mL 、 250 mL 等），移液管或移液器
5mL(1) 、 1mL(2) 、 0.5mL （ 1 ），漏斗（ 3 ），滤纸（ 3-6 ）等
六、实验试剂配制及实验步骤
（一）酪氨酸的标准曲线
将上述各管混匀，静置2min, 测定各管的A 275nm，做标准曲线，曲线如下：
（二）粗酶活测定
1 试剂
（ 1 ） 3mg/ml 木瓜蛋白酶液（用 0.1mol/L 的磷酸缓冲液， pH 7.2 配制）
（ 2 ）0.1mol/L 的磷酸缓冲液， pH 7.2
（ 3 ）用 0.1mol/L 磷酸缓冲液（ pH 7.2 ）配制含 80mmol/L 半胱氨酸
（ 4 ）1% 酪蛋白溶液：用 0.1mol/L 磷酸缓冲液（ pH 7.2 ）配制（ 5 ）15% 三氯乙酸（ TCA ）溶液
2 方法
量取酶液0.2 mL，加入激活剂0.25 mL于带塞试管中，在37℃水浴中保温8 min，吸取预热37℃酪蛋白液（质量分数为1%）1 mL加入此管，在37℃水浴中反应10 min，加入三氯乙酸（TCA）2 mL摇匀，静置5 min；另取样液（已激活）0.3 mL置另一带塞试管中，加入TCA 2 mL，37℃保温10 min后，加入预热至37℃的酪蛋白液1 mL，静置5 min，测2个管的A275 nm值，同时做2个平行试验。
（三）纯化
固定体系总质量为20.5 g，在PEG（分子量6 000）质量分数为22.0%，(NH4)2SO4质量分数为14.6%，pH值为5.0，粗酶添加量为7.5%所组成的双水相体系下，室温下静置分相后，读取上、下相体积，计算相体积比R，分别测定上、下相的酶活力
（四）计算与结果
R = 9/17 = 0.529
粗酶活 = （0.103– 0.0139）/10.496/181.2 * 100000 / 0.03 = 156.16
上相酶活 = （0.32 – 0.0139）/10.496/181.2 * 100000 / 0.02 = 804.7
下相酶活 = （0.02 – 0.0139）/10.496/181.2 * 100000 / 0.012 =
26.7
酶分配系数 = 上相酶活/下相酶活 = 804.7 / 26.7 = 30.14。