木瓜蛋白酶活力测定方法
酶活力的测定-国标
木瓜蛋白酶活力的测定一、试剂与溶液1. 三氯乙酸称取三氯乙酸6.54g，用水溶解并定容至100mL。
2. L-酪氨酸标准储备溶液（100μg/mL）精确称取L-酪氨酸0.1000g，用1mol/L盐酸溶液60mL溶解后定容至100mL，即为1mg/mL酪氨酸溶液。
吸取1mg/mL酪氨酸溶液10.00mL，用0.1mol/L盐酸溶液定容至100mL，即得到100μg/mL的L-酪氨酸标准储备溶液。
3. 氢氧化钠溶液（20g/L）称取氢氧化钠2g，加水搅拌溶解。
待溶液到室温后，以水定容至100mL，搅拌均匀。
4. 盐酸溶液1mol/L:取22.5ml的浓盐酸溶液，加水定容至250ml。
0.1mol/L：取1.8ml的浓盐酸溶液，加水定容至200ml。
5. 酪蛋白溶液（10.0g/L）称取标准酪蛋白1g，用少量氢氧化钠溶液润湿，加入相应的缓冲溶液约80mL，在沸水浴中100℃加热回流30min。
冷却到室温后转入100mL容量瓶中，用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度。
此溶液在冰箱内贮存，有效期为3d。
使用前重新确认并调整pH至规定值。
二、分析步骤1. 标准曲线的绘制L-酪氨酸标准溶液：按表1配制。
L-酪氨酸稀释液应在稀释后立即进行测定。
表1 L-酪氨酸标准溶液分别取上述所配的溶液，以0管为空白，利用紫外分光光度计于波长275nm下测定吸光度。
以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线。
利用回归方程，计算出吸光度为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K值。
其K值应在130~135范围内，如不符合，需重新配制试剂，进行实验。
2. 样品的测定待测酶液的制备：称取酶样品1g。
然后用磷酸缓冲溶液充分溶解，定容至50ml。
测定：先将酪蛋白溶液置于（40±0.2）℃恒温水浴中，预热5min，然后按以下流程操作：试管A（空白）↓加酶液2.00mL↓（40±0.2）℃，2min加三氯乙酸4.00mL（摇匀）↓（40±0.2）℃，10min加酪蛋白溶液2.00mL（摇匀）↓取出静止10min，过滤（慢速定性滤纸）定容至100ml↓测滤液吸光度试管B（酶试样，需三个平行样）↓加酶液2.00mL↓（40±0.2）℃，2min加酪蛋白溶液2.00mL（摇匀）↓（40±0.2）℃，10min加三氯乙酸4.00mL（摇匀）↓取出静止10min，过滤（慢速定性滤纸）定容至100ml↓测滤液吸光度三、计算过程从标准曲线上读出样品最终稀释液的酶活力，单位为u/mL。
木瓜酶活力测定方法的研究
木瓜酶活力测定方法的研究：
木瓜酶活力测定方法是指用来测定木瓜酶酶动力学性质的方法。
木瓜酶是一种多聚苯乙烯酶，具有解除多聚苯乙烯的能力，在食品加工、医药、农业等领域具有重要的应用价值。
常用的木瓜酶活力测定方法有以下几种：
滴定法：使用滴定的方法测定木瓜酶的活力。
在该方法中，通常使用溴甲酚蓝作为指示剂，测定木瓜酶在解除多聚苯乙烯的过程中所消耗的溴甲酚蓝的量。
通过计算溴甲酚蓝的消耗量，可以确定木瓜酶的活力。
分光光度法：使用分光光度法测定木瓜酶的活力。
在该方法中，通常使用苯乙烯为底物，测定木瓜酶在解除苯乙烯的过程中所产生的二乙烯的吸收光谱。
通过计算二乙烯的吸收值，可以确定木瓜酶的活力。
荧光光谱法：使用荧光光谱法测定木瓜酶的活力。
在该方法中，通常使用苯乙烯为底物，测定木瓜酶在解除苯乙烯的过程中所产生的二乙烯的荧光光谱。
通过计算二乙烯的荧光值，可以确定木瓜酶的活力。
以上是常用的木瓜酶活力测定方法，希望这些信息能帮助您了解这一概念。
木瓜蛋白酶的检测
2、以BAEE为底物测木瓜蛋白酶的活性
BAEE( 苯甲酰一L－精氨酸乙酯）被木瓜蛋白酶 催化水解成苯甲酰一L精氨酸(BA) 和乙醇 ， 可以利用 BA和BAEE在253nm 处光吸收值的不同，用光学法测 定酶活性。 BAEE法底物纯度高，准确性高，重复性 好，操作简便， 最省工省时，连续测定时，一个样品 在10min之内即可完成，但仪器设备昂贵， 成本偏高： 该测定方法尤其适合精酶制品的活性检测及酶动力学 性质的研究， 也常用于商品木瓜蛋白酶制品的活性测 定。
紫外吸光光度法测定化妆品中木瓜蛋白酶的活力 冯健雯
工业生产中木瓜蛋 白酶 的活性检测方法比较 方 焕 生吉萍 吴显荣
十二烷基苯磺酸钠共振散射光谱法测定木瓜蛋白酶活力 黄国霞 蒋治 良 梁爱徐红娣
云南峨山番木瓜中木瓜蛋白酶的初步纯化及活性测定 黄兴奇等
4、实验室木瓜蛋白酶活力测定
(1)样品处理：精确称取0.05g的木瓜蛋白酶干粉于研钵中，加入少量石英砂 和几滴酶稀释液研磨15min,将酶液用蒸馏水少量多次洗入500ml容量瓶 (不 要将石英砂带入)，定溶，摇匀。取样液5ml,加入酶溶解液10ml，混匀盖严， 将酶激活15min以上(激活时半胱氨酸的浓度要高于0.03mol/L，而且要当天 配制，激活的酶最好在2h内测完)备用。
乙醇溶液对木瓜蛋白酶催化活性的影响 何 平 詹福建 丘泰球
初志战 黄卓烈 巫光宏
木瓜蛋白酶的生产工艺研 谭爱娟 王利民
一、木瓜蛋白酶的简介：
木瓜蛋白酶是从南方果王——番木瓜中提取的乳汁，经科 学加工而制成的食品添加剂。木瓜蛋白酶具有很高的蛋白分解 活性，已广泛用于啤酒酿造、肉类加工、动植物蛋白水解制品、 饼干果酱 、果汁加工和果酒的生产上。特别是在啤酒工业上， 木瓜蛋白酶可作为澄清剂 ，将啤酒中游离的蛋白质分解为易溶 于水的短肽 、氨基酸 ，既丰富了营养成分，又防止啤酒在贮 运过程中产生浑浊与沉淀，延长了啤酒的保存期；另外，在麦 芽糖化阶段加入木瓜蛋白酶，可弥补麦芽中蛋酶 活力不足的缺 陷，提高氨基氮的浓度，保证发酵的正常进行，确保产品具有 良好风味；在肉制品加工方面，木瓜蛋白酶可作为肉类的嫩化 剂(如嫩肉粉 )、分解剂(能够将固体肉完全水解为容易消化吸 收的肉汁，例如鸡精、兔精制造等)等 。
木瓜蛋白酶的纯化和鉴定方法研究
木瓜蛋白酶的纯化和鉴定方法研究木瓜蛋白酶（Papain）是一种广泛存在于木瓜中的天然酶，具有优异的蛋白水解能力和广泛的应用领域。
对于木瓜蛋白酶的纯化和鉴定方法的研究，可以为其在食品、药物和生物技术等领域的应用提供重要的理论和实践基础。
纯化木瓜蛋白酶的常用方法主要包括：硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析等。
首先，通过将木瓜果肉或木瓜乳剂进行初步的提取和分离，得到粗木瓜酶液或浓缩液。
接下来，通过酸性、碱性或酶处理等方法，将杂质蛋白质去除，然后经过一系列的层析纯化步骤，最终获得纯度较高的木瓜蛋白酶。
其中，离子交换层析是最常用的纯化方法之一。
离子交换层析是根据蛋白质与固定在固定相上带电的离子交换基团之间的相互作用进行纯化的。
通常使用阳离子交换剂如DEAE-Sepharose CL-6B或阴离子交换剂如CM-Sepharose CL-6B作为固定相，可实现木瓜蛋白酶与其他蛋白质之间的分离。
通过控制缓冲液的pH和离子强度，可以调节木瓜蛋白酶在层析柱上的吸附和洗脱，从而实现对其的纯化。
凝胶过滤层析是另一种常见的纯化方法，其基本原理是根据蛋白质分子大小的差异进行纯化。
凝胶过滤层析对分子量较大且较纯的蛋白质具有较好的分离效果。
在纯化木瓜蛋白酶时，可以选择适当的凝胶过滤层析介质，如Sephadex G-75或Sephadex G-100等，将混合溶液在凝胶柱上进行层析，分离出目标蛋白质。
除了纯化方法的研究外，正确鉴定木瓜蛋白酶的纯度和活性也是非常重要的。
鉴定木瓜蛋白酶的常用方法主要包括：SDS-PAGE电泳、活性测定和质谱鉴定等。
其中，SDS-PAGE电泳是一种常用的蛋白质分子量分析方法，它可将蛋白质按照分子量大小进行分离和定量。
通过在分离凝胶上染色或通过Western blotting方法检测，可以确定木瓜蛋白酶的纯度和分子量。
活性测定是评价木瓜蛋白酶酶活性的重要手段。
常用的活性测定方法包括卟啉-酪蛋白分光光度法、酪蛋白分解能力法等。
酶活力的测定 国标
木瓜蛋白酶活力的测定一、试剂与溶液1. 三氯乙酸称取三氯乙酸6.54g，用水溶解并定容至100mL。
2. L-酪氨酸标准储备溶液（100μg/mL）精确称取L-酪氨酸0.1000g，用1mol/L盐酸溶液60mL溶解后定容至100mL，即为1mg/mL酪氨酸溶液。
吸取1mg/mL酪氨酸溶液10.00mL，用0.1mol/L盐酸溶液定容至100mL，即得到100μg/mL的L-酪氨酸标准储备溶液。
3. 氢氧化钠溶液（20g/L）称取氢氧化钠2g，加水搅拌溶解。
待溶液到室温后，以水定容至100mL，搅拌均匀。
4. 盐酸溶液1mol/L:取22.5ml的浓盐酸溶液，加水定容至250ml。
0.1mol/L：取1.8ml的浓盐酸溶液，加水定容至200ml。
5. 酪蛋白溶液（10.0g/L）称取标准酪蛋白1g，用少量氢氧化钠溶液润湿，加入相应的缓冲溶液约80mL，在沸水浴中100℃加热回流30min。
冷却到室温后转入100mL容量瓶中，用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度。
此溶液在冰箱内贮存，有效期为3d。
使用前重新确认并调整pH至规定值。
二、分析步骤1. 标准曲线的绘制L-酪氨酸标准溶液：按表1配制。
L-酪氨酸稀释液应在稀释后立即进行测定。
表1 L-酪氨酸标准溶液分别取上述所配的溶液，以0管为空白，利用紫外分光光度计于波长275nm下测定吸光度。
以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线。
利用回归方程，计算出吸光度为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K值。
其K值应在130~135范围内，如不符合，需重新配制试剂，进行实验。
2. 样品的测定待测酶液的制备：称取酶样品1g。
然后用磷酸缓冲溶液充分溶解，定容至50ml。
测定：先将酪蛋白溶液置于（40±0.2）℃恒温水浴中，预热5min，然后按以下流程操作：试管A（空白）↓加酶液2.00mL↓（40±0.2）℃，2min加三氯乙酸4.00mL（摇匀）↓（40±0.2）℃，10min加酪蛋白溶液2.00mL（摇匀）↓取出静止10min，过滤（慢速定性滤纸）定容至100ml↓测滤液吸光度试管B（酶试样，需三个平行样）↓加酶液2.00mL↓（40±0.2）℃，2min加酪蛋白溶液2.00mL（摇匀）↓（40±0.2）℃，10min加三氯乙酸4.00mL（摇匀）↓取出静止10min，过滤（慢速定性滤纸）定容至100ml↓测滤液吸光度三、计算过程从标准曲线上读出样品最终稀释液的酶活力，单位为u/mL。
木瓜酶活性实验报告
一、摘要本实验旨在通过测定木瓜酶活性，探究温度、pH值、底物浓度等因素对木瓜酶活性的影响。
实验结果表明，木瓜酶活性受温度和pH值的影响较大，且在不同温度和pH值条件下，木瓜酶活性存在显著差异。
此外，底物浓度对木瓜酶活性也有一定影响。
本实验为木瓜酶的工业化应用提供了理论依据。
二、实验目的1. 了解木瓜酶活性的影响因素；2. 探究温度、pH值、底物浓度等因素对木瓜酶活性的影响；3. 为木瓜酶的工业化应用提供理论依据。
三、实验原理木瓜酶是一种蛋白酶，主要来源于木瓜果实。
在一定的温度和pH值条件下，木瓜酶能够催化蛋白质的分解反应。
本实验采用双缩脲法测定木瓜酶活性，通过测定酶催化蛋白质分解反应产生的产物量来反映酶活性。
四、实验材料1. 实验试剂：木瓜酶、双缩脲试剂、pH缓冲液、蛋白质底物（如酪蛋白）；2. 实验仪器：恒温培养箱、pH计、酶标仪、电子天平、移液器、试管等。
五、实验方法1. 木瓜酶活性的测定（1）制备木瓜酶溶液：将木瓜酶用pH缓冲液稀释至适当浓度；（2）制备蛋白质底物溶液：称取适量酪蛋白，用pH缓冲液溶解；（3）设定实验组：将木瓜酶溶液、蛋白质底物溶液和pH缓冲液按一定比例混合，分别设定不同温度（如30℃、40℃、50℃、60℃、70℃）和pH值（如3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）的实验组；（4）酶活性测定：将各实验组溶液置于恒温培养箱中反应一定时间（如30分钟），然后加入双缩脲试剂，用酶标仪测定吸光度值；（5）计算酶活性：根据吸光度值和标准曲线，计算各实验组的酶活性。
2. 影响因素探究（1）温度对木瓜酶活性的影响：分别测定不同温度下木瓜酶的活性，分析温度对木瓜酶活性的影响；（2）pH值对木瓜酶活性的影响：分别测定不同pH值下木瓜酶的活性，分析pH值对木瓜酶活性的影响；（3）底物浓度对木瓜酶活性的影响：在相同温度和pH值条件下，分别测定不同底物浓度下木瓜酶的活性，分析底物浓度对木瓜酶活性的影响。
木瓜酶活力测定方法的研究
木瓜酶活力测定方法的研究木瓜酶是一种黄酮酶，广泛存在于许多植物当中，具有良好的催化活性。
木瓜酶在食品工业、医药领域和生物技术等方面有着广泛的应用。
因此，准确测定木瓜酶的活力是非常重要的。
本文将针对木瓜酶活力测定方法展开研究。
首先，概述目前常用的木瓜酶活力测定方法，随后详细介绍各种方法的原理、操作步骤以及优缺点。
最后，对其中一种测定方法进行深入研究，以便更好地了解木瓜酶活力的测定过程。
目前常用的木瓜酶活力测定方法包括酚酞法、酪氨酸酶法、pH酶法和萤光素法等。
下面将对这些方法进行简要介绍。
酚酞法是根据酚酞与木瓜酶催化产生的酚酞显色反应来测定木瓜酶活力的一种方法。
该方法操作简单、灵敏度较高，但需要使用有毒的试剂和显色剂。
酪氨酸酶法是一种通过测定木瓜酶对酪氨酸水解的催化活性来测定其活力的方法。
该方法对样品处理要求较高，但操作相对简单，测定结果相对准确。
pH酶法是一种基于酶活性对反应物pH值的变化情况进行测定的方法。
该方法对pH的变化极其敏感，可以用来测定木瓜酶的活力，但依赖较强。
萤光素法是一种通过测定木瓜酶与辣根过氧化物酶的复合物产生的荧光强度来测定木瓜酶活力的方法。
该方法操作相对简单，结果准确，但需要专门设备。
在这些方法中，我们选择了酪氨酸酶法进行深入研究。
该方法原理简单，测定结果准确可靠。
具体的操作步骤如下：1.准备样品：收集所需测定的木瓜酶样品，如酒精或水提液。
2.取适量的酪氨酸溶液，使其浓度与之前的样品相同。
3.在试管中，混合适量的酪氨酸溶液和木瓜酶样品。
对照组中只加入酪氨酸溶液。
4.将试管放入恒温水浴中，温度为37°C，孵育一定时间，使酪氨酸水解反应完全进行。
5.向反应体系中加入适量的硫酸，停止反应。
6.使用分光光度计测定反应体系中产生的对映光的光密度。
7.根据光密度值计算出木瓜酶的活力。
这种方法虽然操作简单，但也有一些局限性。
首先，酪氨酸的浓度需与样品浓度进行匹配，这对样品的处理和准备有一定要求；其次，由于酪氨酸酶活性对各种因素如温度、pH值等有一定依赖性，因此在样品处理过程中需保持温度和pH的稳定。
木瓜蛋白酶实验指导
实验一木瓜蛋白酶的提取及其活性测定一、实验目的通过本实验，要求学习和掌握木瓜蛋白酶酶源的选取、木瓜乳汁的采集及蛋白酶粗酶制剂提取等的基本原理和方法；学习并掌握木瓜蛋白酶活性的测定方法以及酶样中蛋白质含量的测定。
二、实验原理木瓜蛋白酶大量存在于木瓜汁液中，是一种巯基蛋白酶，其分子量为23900。
木瓜蛋白酶最适pH随底物而异，当以酪蛋白为底物时，酶的最适pH为7。
据此原理，本实验以未成熟的木瓜果实为材料，从果皮中采集新鲜乳汁，利用木瓜蛋白酶在pH7.2的磷酸缓冲液、35℃条件下水解底物酪蛋白产生酪氨酸，酪氨酸在275nm处有最大吸收峰，根据吸光值的大小反映酪氨酸的浓度，进而反映木瓜蛋白酶催化水解的反应速率，以此衡量该酶的活性。
考马斯亮蓝G-250在酸性条件下能够与蛋白质结合，形成的络合物在595nm 处具有最大吸光值，且吸光值的大小与蛋白质的含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。
三、实验材料和用具1、实验材料：新鲜、未成熟的木瓜。
2、试剂：0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.2）；1%的酪蛋白溶液：称1g的酪蛋白用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.2）配至100mL；激活剂：用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.2）配制含半胱氨酸20mmol/L，EDTA 1mmol/L的混合液；10%三氯乙酸（TCA）：称10g的TCA定容至100 mL；考马斯亮蓝G-250：称0.1g考马斯亮蓝G-250溶于50mL90%乙醇溶液中，加入85%磷酸溶液100mL，用蒸馏水定容到1000mL。
3、仪器、用具：恒温水浴锅、电子天平、紫外-可见分光光度计、研钵、烧杯、量筒、试管、移液管、吸耳球、漏斗、滤纸、标签纸、试管架、牙签等。
四、实验步骤1．木瓜乳的采集选取挂果30天以上的木瓜果实，用湿棉布小心擦净表面，用牙签等利器，在果实的表面划若干条深约3mm的划痕，此时有大量白色乳汁流出，于木瓜底部用干净的烧杯收集乳汁，片刻后收集的乳汁便会凝固。
木瓜蛋白酶活性实验报告
一、实验目的1. 了解木瓜蛋白酶的性质和作用机理。
2. 探究不同条件对木瓜蛋白酶活性的影响。
3. 通过实验验证木瓜蛋白酶在食品加工中的应用潜力。
二、实验原理木瓜蛋白酶是一种含疏基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力。
木瓜蛋白酶的活性受pH、温度、离子强度等因素的影响。
本实验通过测定木瓜蛋白酶在不同pH、温度和离子强度下的活性，探讨其活性影响因素。
三、实验材料1. 木瓜蛋白酶样品2. 酚酞指示剂3. 酶反应缓冲液4. 硫酸铜溶液5. 碘液6. pH计7. 恒温水浴锅8. 移液器9. 试管四、实验方法1. pH对木瓜蛋白酶活性的影响（1）取5支试管，分别加入0.5ml酶反应缓冲液，编号为1、2、3、4、5。
（2）分别向5支试管中加入0.1ml木瓜蛋白酶样品，编号为1、2、3、4、5。
（3）分别向5支试管中加入0.5ml不同pH的酶反应缓冲液（pH 2、4、6、8、10）。
（4）将5支试管置于37℃恒温水浴锅中保温10分钟。
（5）向5支试管中加入0.5ml酪蛋白溶液，摇匀。
（6）观察并记录各试管溶液的颜色变化。
2. 温度对木瓜蛋白酶活性的影响（1）取5支试管，分别加入0.5ml酶反应缓冲液，编号为1、2、3、4、5。
（2）分别向5支试管中加入0.1ml木瓜蛋白酶样品，编号为1、2、3、4、5。
（3）分别将5支试管置于0℃、20℃、37℃、50℃、70℃恒温水浴锅中保温10分钟。
（4）向5支试管中加入0.5ml酪蛋白溶液，摇匀。
（5）观察并记录各试管溶液的颜色变化。
3. 离子强度对木瓜蛋白酶活性的影响（1）取5支试管，分别加入0.5ml酶反应缓冲液，编号为1、2、3、4、5。
（2）分别向5支试管中加入0.1ml木瓜蛋白酶样品，编号为1、2、3、4、5。
（3）分别向5支试管中加入不同离子强度的硫酸铜溶液（0.01mol/L、0.05mol/L、0.1mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L）。
紫外吸光光度法测定化妆品中木瓜蛋白酶的活力
紫外吸光光度法测定化妆品中木瓜蛋白酶的活力作者：冯健雯(梧州市产品质量监督检验所,梧州543002)样品用磷酸盐半胱氨酸ＥＤＴＡ缓冲溶液搅拌溶解后,选择一定的ｐＨ值和温度条件,样品中的木瓜蛋白酶能将加入的酪蛋白水解生成可溶解的氨基酸,末水解的酪蛋白用三氯乙酸沉淀后过滤,溶解的水解产物用紫外吸光光度法测定[1]。
1试验部分1.1试剂与仪器磷酸钠溶液:0.05ｍｏｌ·Ｌ-1,称取十二水磷酸氢二钠1.79ｇ溶解于100ｍｌ水中。
柠檬酸溶液:0.05ｍｏｌ·Ｌ-1,将柠檬酸一水合物1.05ｇ用100ｍｌ水溶解。
缓冲溶液:称取十二水磷酸氢二钠17.89ｇ溶于800ｍｌ水中,再将ＥＤＴＡ钠盐二水合物14.0ｇ和盐酸半胱氨酸一水合物6.1ｇ溶于其中。
用1ｍｏｌ·Ｌ-1盐酸或1ｍｏｌ·Ｌ-1氢氧化钠将ｐＨ值调到6.0±0.1,加水定容至1Ｌ。
三氯乙酸溶液:将三氯乙酸30ｇ溶于100ｍｌ水中酪蛋白作用物:将1ｇ干燥的酪蛋白分散在50ｍｌ磷酸钠溶液中,在沸水浴中加热30ｍｉｎ,经常搅拌之,冷至室温,在连续快速的搅拌下,用柠檬酸溶液调ｐＨ值至6.0±0.1,加水定容至100ｍｌ。
标准溶液:1ｍｇ·ｍｌ-1,称取ＵＳＰ木瓜蛋白酶对照标准物100ｍｇ(其活力为100ＰＵ·ｍｇ-1),用磷酸盐半胱氨酸ＥＤＴＡ缓冲溶液溶解,定容100ｍｌ。
标准使用液:移取0.25,0.50,1.00,1.50,2.00,2.50ｍｌ标准溶液于一组10ｍｌ容量瓶中,用缓冲溶液稀释至刻度,摇匀。
酸度计:分度值0.1ｐＨ,ｐＨ6.0±0.1。
超级恒温水浴:40±0.1℃紫外分光光度计:波长200～1000ｎｍ1.2测定方法1.2.1样品处理称取样品1.00～2.00ｇ,加磷酸盐半胱氨酸ＥＤＴＡ缓冲溶液搅拌溶解后转移至50ｍｌ容量瓶中,用缓冲溶液稀释至刻度,摇匀。
木瓜蛋白酶的检测
免疫印迹法
将木瓜蛋白酶与特异性抗体结合，通过显色 反应或荧光标记检测木瓜蛋白酶的存在。
03 木瓜蛋白酶的检测标准
检测标准概述
检测方法
木瓜蛋白酶的检测通常采用比色法、滴定法、分光光度法等方法 进行定量测定。
检测原理
基于木瓜蛋白酶能够水解底物产生可溶性肽或氨基酸，通过测定水 解产物的量来计算木瓜蛋白酶的活性。
稳定性
木瓜蛋白酶在一定的pH值和温度范围内具有较好的 稳定性，不易失活。
木瓜蛋白酶的来源
木瓜果实
木瓜蛋白酶主要来源于木瓜果实 ，特别是未成熟的青木瓜。
其他来源
木瓜蛋白酶也可从其他植物、动 物或微生物中提取获得。
木瓜蛋白酶的应用
01
02
03
食品工业
用于制作果汁、奶酪、冰 淇淋等食品的澄清和凝结。
医药工业
生物医药中木瓜蛋白酶的检测
检测目的
研究木瓜蛋白酶在生物医药领域的应用效果， 为药物研发提供科学依据。
检测方法
采用细胞生物学、分子生物学等技术手段进行 检测。
检测流程
准备细胞系、处理样品、酶活性测定、细胞功能分析、数据统计与结果报告。
05 木瓜蛋白酶检测的发展趋 势
高灵敏度检测技术
酶联免疫吸附法
生物检测法
底物分解法
利用木瓜蛋白酶对特定底物的水解作用，通过测定底物分解产物的变化来检测 木瓜蛋白酶的活性。
荧光标记法
将荧光物质标记在底物上，通过荧光光谱法检测木瓜蛋白酶水解底物后的荧光 变化。
免疫检测法
酶联免疫吸附法（ELISA）
利用特异性的抗体与木瓜蛋白酶结合，通过 酶催化底物显色反应来检测木瓜蛋白酶的含 量。
检测方法
采用分光光度法、色谱法、 质谱法等手段，结合免疫 学技术进行检测。
紫外分光光度法对嫩肉粉中木瓜蛋白酶活力的测定方法研究
中木瓜蛋白酶的酶活力大小, 为判断嫩肉粉质量优劣提 供参考依 据。把嫩肉粉 溶于盐酸半 胱氨酸 溶液, 取该
混合液与酪蛋白溶液反应 10m in, 用紫外分光 光度法测 得反应 所生成 酪氨酸 的含量。该 方法具 有较好 的准确
性和重现性, 添加标准回收率为 96 8% ~ 105 8% ; 且步骤简明, 所需测试仪器简单。在该方法条件下, 每分
酶活力是酶性质的重要参数, 显示酶分解底 物能力的强弱。木瓜蛋白酶酶活力的测定, 采用 不同底物衍生的测定方法也不同, 所取得的数值 也不能进行直接比较。传统的作法, 木瓜蛋白酶 是用明胶或血红蛋白作底物来测定的。由于要求 底物具有较高的专一性和便于标准化, 新的测定 方法往往采用合成的 N - 苯甲酰 - L - 精氨酸乙酯 ( BA EE ) [ 3] 。但以 BAEE 为底物的测定 方法所涉 及到的仪器设备昂贵, 成本偏高 [ 4] 。本文采用以 酪蛋白为底物的紫外光谱法来测定嫩肉粉中木瓜 蛋白酶的活力, 该法所需测试仪器简单, 步骤简 明, 容易掌握; 并且该法也常被国内用来测定各 种酶的活力, 所得的数据便于比较。对嫩肉粉中 木瓜蛋白酶活力的测定, 可为嫩肉粉质量优劣提 供一项重要的参考指标。
入三氯乙酸溶液 5m L, 振摇, 置 ( 37 0 2) ! 水
浴中, 反应 10m in后, 准确加入 ( 37 0 2) ! 预
热的底物溶液 5 0mL, 振摇, 于 ( 37 0 2) ! 水
浴中放置 40m in, 用干燥滤纸过滤, 滤液在 2h内
采用分光光度法以水为空白, 在 275nm 的波长处
1 实验部分
1 1 仪器 恒温水浴锅; 751- GW 分光光度计。
1 2 试剂 酪蛋白溶液: 取酪蛋 白 0 6g, 加 0 05m o l/L
木瓜蛋白酶提取实验方案
实验设计题目：木瓜蛋白酶的提取,纯化分离及其生物学研究一、实验原理：木瓜蛋白酶（papain）又称木瓜酶，广泛存在于番木瓜的根、茎、叶和果实，未成熟果实的乳汁中含量最丰富。
是一种含疏基（-SH）肽链的内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力；同时还具有合成的功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。
工业用的木瓜蛋白酶一般都是未经纯化的多酶体系。
现已知经木瓜乳汁干燥而得的木瓜蛋白酶至少含有四种主要酶类：木瓜蛋白酶（papain）、木瓜凝乳蛋白酶（chymopapain）、木瓜蛋白酶Ω（papaya proteinaseΩ）、木瓜凝乳蛋白酶M（chymopapain M），其中木瓜凝乳蛋白酶的含量最多，占可溶性蛋白的45%。
木瓜蛋白酶易溶于水和甘油，水溶液为无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于有机溶剂。
它的最适pH值为5.7（一般3～9.5皆可），在中性或偏酸性时亦有作用；最适温度为55～60℃（一般10～85℃皆可），耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。
本实验主要采取有机溶剂沉淀法结合硫酸铵分级沉淀法来提取番木瓜中的木瓜蛋白酶。
有机溶剂沉淀法：有机溶剂能降低溶液的电解常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导溶解度的降低，另外，有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法。
有机溶剂分段沉淀法它常用于蛋白质或酶的提纯。
使用的有机溶剂多为乙醇和丙酮。
高浓度有机溶剂易引起蛋白质变性失活，操作必须在低温下进行，并在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以避免局部浓度过大。
硫酸铵分级沉淀法：硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。
高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。
各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。
木瓜蛋白酶酶活力测定
木瓜蛋白酶酶活力测定1、原理蛋白酶在一定温度与pH条件下，水解酪蛋白底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪蛋白沉淀出去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定，根据吸收度计算酶活力。
2、酶活力定义在一定条件下，每分钟水解酪蛋白生成1ug酪氨酸所需的酶的量，为1个酶活力单位（U）。
3、仪器和设备恒温水浴（37±0.2）℃紫外分光光度计4、试剂和溶液4.1、酶稀释液称取L-半胱氨酸盐酸盐（C3H7NO2S·HC L·H2O）5.27g，氯化钠（NaCL）23.4g，加水500ml溶解，另取乙二胺四乙酸二钠2.23g加水200ml溶解，合并两液混匀，用0.1mol/l 氢氧化钠溶液或0.1mol/l盐酸溶液调至pH=5.5，加水稀释至1000ml。
4．2、0.05mol/l磷酸氢二钠溶液称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）17.89g，加水溶解，并定容至1000ml。
4.3、酪蛋白溶液称取经硅胶干燥器忠干燥至衡重的酪蛋白0.6g（精确到0.0002g），置烧杯中，假如0.05mol/l磷酸氢二钠溶液80ml。
在沸水浴忠边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，用0.1mol/l盐酸调至pH=7.0,转移到100ml容量瓶中，加水至刻度。
临用现配。
4.4、三氯乙酸溶液称取三氯乙酸8.995g，加无水乙酸钠14.97g，冰乙酸9.45ml加适量水溶解后，加水使成500ml，振摇均匀。
4.5、酪氨酸标准溶液称取于105℃干燥至衡重的酪氨酸50mg（精确0.0002g）用0.1mol/l盐酸溶解，移入100ml容量瓶中，并用0.1mol／l盐酸调至刻度，摇匀，即可得含酪氨酸50ug／ml的溶液。
4.6、试样溶液称取木瓜蛋白酶0.9g（精确0.0002g）置于研钵中，加入少量酶稀释液研磨20min，用酶稀释液移至250ml容量瓶中，加酶稀释液至刻度，充分摇匀；取出上述液体1ml以酶稀释液稀释，定容20ml，充分摇匀，供测试用（60min内使用）。
木瓜蛋白酶活力测定方法
木瓜蛋白酶活力测定方法分别精密量取酪蛋白溶液5ml，置3支具塞试管中，置40℃水浴中保温10分钟，各精密加入供试品溶液2ml，摇匀，置40℃水浴中，开始记时，准确反应1小时，立即精密加入三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，置40℃水浴中放置30~40分钟，使沉淀的蛋白质完全凝固，滤过，滤液作为供试品溶液。
精密量取酪蛋白溶液5ml置另一具试管，于40℃水浴中保温1小时，精密加入三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，精密加入供试品溶液2ml，置40℃水浴中放置30~40分钟，滤过，滤液作为空白溶液。
照分光光度法（中国药典2000年版二部附录IV A），以0.1mol/L盐酸溶液为空白，在275nm的波长处测定空白溶液、供试品溶液和对照品溶液的吸收度，按下式计算：效价（单位/mg）=A/As＊Cs＊12/2＊稀释倍数/W式中A为供试品溶液的吸收度减去空白溶液的吸收度：As为酪氨酸对照品溶液的吸收度：Cs为酪氨酸对照品溶液的浓度，ug/mlW为供试品重量，mg;在上述条件下，释放1ug的酪氨酸的酶量为一个活力单位。
试剂酪蛋白溶液：取酪蛋白1g，加0.05mol/L磷酸氢二钠溶液50ml,置沸水浴中煮30分钟，时时搅拌，冷至室温，加0.05mol/L枸椽酸溶液调节PH至6.0±0.1，并迅速搅拌，防止酪蛋白沉淀，用水稀释至100ml（临用新配）。
酶稀释液：取无水磷酸氢二钠3.55g，加水400ml溶解，加乙二胺四醋酸二钠1.1g和盐酸半胱氨酸2.74g，振摇溶解，用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠溶液调节PH6.5±0.1，用水稀释至500ml,混匀（临用新配）三氯醋酸溶液:取三氯醋酸17.99g，加醋酸钠29.94g和冰醋酸18.9ml，加适量水溶解后，加水使成1000ml，摇匀。
酶活力测定对照品溶液的制备:精密称取已105℃干燥至恒重的酪氨酸对照品适量，用0.1mol/L盐酸溶液制成每1ml中约含40ug的溶液。
木瓜蛋白酶酶活力测定
木瓜蛋白酶酶活力测定1、原理蛋白酶在一定温度与pH条件下，水解酪蛋白底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪蛋白沉淀出去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定，根据吸收度计算酶活力。
2、酶活力定义在一定条件下，每分钟水解酪蛋白生成1ug酪氨酸所需的酶的量，为1个酶活力单位（U）。
3、仪器和设备恒温水浴（37±0.2）℃紫外分光光度计4、试剂和溶液4.1、酶稀释液称取L-半胱氨酸盐酸盐（C3H7NO2S·HC L·H2O）5.27g，氯化钠（NaCL）23.4g，加水500ml溶解，另取乙二胺四乙酸二钠2.23g加水200ml溶解，合并两液混匀，用0.1mol/l 氢氧化钠溶液或0.1mol/l盐酸溶液调至pH=5.5，加水稀释至1000ml。
4．2、0.05mol/l磷酸氢二钠溶液称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）17.89g，加水溶解，并定容至1000ml。
4.3、酪蛋白溶液称取经硅胶干燥器忠干燥至衡重的酪蛋白0.6g（精确到0.0002g），置烧杯中，假如0.05mol/l磷酸氢二钠溶液80ml。
在沸水浴忠边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，用0.1mol/l盐酸调至pH=7.0,转移到100ml容量瓶中，加水至刻度。
临用现配。
4.4、三氯乙酸溶液称取三氯乙酸8.995g，加无水乙酸钠14.97g，冰乙酸9.45ml加适量水溶解后，加水使成500ml，振摇均匀。
4.5、酪氨酸标准溶液称取于105℃干燥至衡重的酪氨酸50mg（精确0.0002g）用0.1mol/l盐酸溶解，移入100ml容量瓶中，并用0.1mol／l盐酸调至刻度，摇匀，即可得含酪氨酸50ug／ml的溶液。
4.6、试样溶液称取木瓜蛋白酶0.9g（精确0.0002g）置于研钵中，加入少量酶稀释液研磨20min，用酶稀释液移至250ml容量瓶中，加酶稀释液至刻度，充分摇匀；取出上述液体1ml以酶稀释液稀释，定容20ml，充分摇匀，供测试用（60min内使用）。
实验三十三 木瓜蛋白酶性质测定
实验三十三木瓜蛋白酶性质测定一、目的：1 、学习并掌握木瓜蛋白酶活性的测定基本原理。
•熟练掌握不同的因素如EDTA 、半胱氨酸、抑制剂、 pH 等对木瓜蛋白酶活力的影响原理和检测技术。
•学习和理解酶学动力学曲线的实验设计和实验方法。
二、原理木瓜蛋白酶（ Papain ）是一种巯基蛋白酶，它分解比胰脏蛋白水解酶更多、更广泛的蛋白底物。
它也具有脂酶活力。
其分子量约为 23000 左右。
在 25 ℃ , pH6.2 时， 1 分钟水解 1 μ mol 分子苯甲酰－ L －精氨酸乙脂的酶量为 1 单位。
木瓜蛋白酶是单条肽链，有 211 氨基酸残基折叠成两部分形成裂缝，酶分子只有 1 个巯基，对酶活力是必需的，激活剂有半胱氨酸，硫化物，亚硫酸盐和 EDTA ；抑制剂有巯基试剂，包括重金属和羧基试剂和过氧化氢。
酪蛋白是一种蛋白质，它被木瓜蛋白酶降解生成的酪氨酸在紫外光区 275nm 处有吸收峰，根据测定 275nm 处的吸收值，可以判定木瓜蛋白酶的酶活力。
吸收值的大小与酪氨酸含量的多少有关，吸收值大说明酪氨酸含量高，也就是说木瓜蛋白酶分解的酪蛋白多，酶活力高。
三.实验材料市售木瓜蛋白酶四.仪器设备（ 1 ）磁力搅拌器（机）（ 2 ）离心机 4000~1000rpm （冷冻式或非冷冻式）（ 3 ） 752 紫外分光光度计（ 4 ）磁力搅拌器（ 5 ）水浴箱（ 6 ）冰箱五.玻璃器皿（以组为单位）试管（ 6 ）， 100 mL 烧杯（ 2 ），吸管（ 1 ）、玻棒（ 1 ），试剂瓶（ 1000 mL 、 500 mL 、 250 mL 等），移液管或移液器 5mL(1) 、 1mL(2) 、 0.5mL （ 1 ），漏斗（ 3 ），滤纸（ 3~6 ）等六.实验试剂配制及实验步骤（一）酶活力测定1 试剂1 · 3mg/ml 木瓜蛋白酶液（用 0.1mol/L 的磷酸缓冲液， pH 7.2 配制）2 · 0.1mol/L 的磷酸缓冲液， pH 7.23 ·激活剂：3.1 用 0.1mol/L 磷酸缓冲液（ pH 7.2 ）配制含 80mmol/L 半胱氨酸，3.2 用 0.1mol/L 磷酸缓冲液（ pH 7.2 ）配制含 8mmol/L EDTA4 · 1% 酪蛋白溶液：用 0.1mol/L 磷酸缓冲液（ pH 7.2 ）配制5 · 15% 三氯乙酸（ TCA ）溶液2 方法（二） EDTA 对木瓜蛋白酶活力的影响1 试剂酸，分别含有 0 ， 0.2,0.4,0.6,0.8,1,2,4mmol/L EDTA 的 8 种混合液3 分析三）半胱氨酸对木瓜蛋白酶活力的影响1 试剂有 0 ， 1 ， 5 ， 10 ，20 ， 30 ， 40 ， 50mmol/L 半胱氨酸的 8 种混合液2 方法3 分析（四）抑制剂对木瓜蛋白酶活力的影响一、试剂1 ·配制浓度分别为 0,0.5,1,2,3,4,5mmol/L 的过氧化氢溶液2 ·用 0.1mol/L 磷酸缓冲液（ PH 7.2 ）配制浓度分别为0.1%,0.2%,0.4%,0.6%,0.8%,1% 的酪蛋白溶液二、方法（ 1 ）不同的抑制剂（过氧化氢）浓度的抑制效果（ 4 ）不同底物浓度，无抑制剂（五）不同 PH 值对木瓜蛋白酶活力的影响1 试剂1 · PH 5.0 缓冲液 0.1mol/L 乙酸－乙酸钠缓冲液PH 6.0 缓冲液 0.1mol/L 磷酸氢二钠－磷酸二氢钠缓冲液PH 7.0 缓冲液 0.1mol/L 磷酸氢二钠－磷酸二氢钠缓冲液PH 7.3 缓冲液 0.1mol/L 磷酸氢二钠－磷酸二氢钠缓冲液PH 7.7 缓冲液 0.1mol/L 磷酸氢二钠－磷酸二氢钠缓冲液PH 8.0 缓冲液 0.1mol/L 磷酸氢二钠－磷酸二氢钠缓冲液PH 9.3 缓冲液 0.1mol/L 硼砂－氢氧化钠缓冲液PH 10.0 缓冲液 0.1mol/L 硼砂－氢氧化钠缓冲液2 ·用以上缓冲液分别配制不同 PH 值的激活剂和酪蛋白溶液3 分析七 . 实验结果分析1. 各实验组分析讨论实验结果，再由老师进行归纳总结。
木瓜蛋白酶活力的测定
蛋白酶的活力用分解出来的酪氨酸来表示。
目前国内通用的蛋白酶的活力单位定义为: 1min水解出1 g酪氨酸的酶量称为1个单位。
因此，在测定酶活力之前，先用福林酚试剂与已知的不同浓度的酪氨酸反应，作出蓝色深浅程度(用0D值来表示)与酪氨酸浓度关系的标准曲线，然后将酶和底物反应的产物与福林酚试剂作用，在分光光度计上读出光密度，再在标准曲线上推算出相当于多少g的酪氨酸，计算出酶活力单位木瓜蛋白酶是天然复合蛋白酶，通常，测定其酶活力时间长，操作复杂，且需要玛瑙研钵等昂贵仪器。
由于木瓜蛋白酶中的各种酶与酪蛋白作用生成的产物是一致的，即酶催化蛋白质的肽键水解，生成游离的氨基酸或多肽。
因此可以利用福林酚试剂与水解出来的酪氨酸作用，生成蓝色物质，通过分光光度比色法可以计算出酶活力的大小.(1)福林酚试剂:称取钨酸钠(Na2wo4·2H20)25g、钼酸钠Na2MnO4·2H20)25g放入2000m1圆底烧瓶中，加入175ml蒸馏水，再加入50ml 85％的磷酸及100ml浓盐酸。
装好回流冷凝管(接口处包有铝薄或玻璃纸的软木塞)，加热到沸腾，然后用／1、火保持缓和的沸腾状态，回流10h，回流结束后加入150g硫酸锂Li2SO4和50ml水，并在沸腾(不必装冷凝管)时立即加入几滴溴液(应趁热加溴，否则没有充分作用就挥发完了)，待作用数分钟后再煮沸15min，以除去过量的溴。
加溴的作用是除掉溶液中的绿色。
如果溶液仍呈绿色，可再加入几滴溴液，再煮沸除去多余的溴直至试剂呈黄色。
冷却后稀释至1000ml(原液)，过滤，贮于棕色瓶，f临用前将此原液加入2倍蒸馏水稀释而成。
(2)标准酪氨酸溶液称取100mg酪氨酸(预先在105℃烘箱内烘至·匣重)，以0．2N HC1溶解后定容到100ml，再用水稀释5倍，即得到2001,zg／L的酪氨酸溶液.(3)酪蛋白溶液称取酪蛋白2g，置于100ml三角瓶中，加入0．2mol／L NazHPO 61ml，置水浴上搅动使其溶解，然后倾出上清液(可能有少量蛋白质颗粒不能完全溶解)，加入39ml 0．2mol／L NaH2PO ，得到pH 7．0的酪蛋白溶液，其余几种pH 的酪蛋白液可照此法制备，pH 5．8酪蛋白液用H3PO 调节，pH 8．5酪蛋白液可全部用Na2HPO 配制，再用NaOH 调节至8．5。
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木瓜蛋白酶活力测定方法分别精密量取酪蛋白溶液5ml，置3支具塞试管中，置40℃水浴中保温10分钟，各精密加入供试品溶液2ml，摇匀，置40℃水浴中，开始记时，准确反应1小时，立即精密加入三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，置40℃水浴中放置30~40分钟，使沉淀的蛋白质完全凝固，滤过，滤液作为供试品溶液。
精密量取酪蛋白溶液5ml置另一具试管，于40℃水浴中保温1小时，精密加入三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，精密加入供试品溶液2ml，置40℃水浴中放置30~40分钟，滤过，滤液作为空白溶液。
照分光光度法（中国药典2000年版二部附录IV A），以L 盐酸溶液为空白，在275nm的波长处测定空白溶液、供试品溶液和对照品溶液的吸收度，按下式计算：效价（单位/mg）=A/As＊Cs＊12/2＊稀释倍数/W 式中A 为供试品溶液的吸收度减去空白溶液的吸收度： As为酪氨酸对照品溶液的吸收度： Cs为酪氨酸对照品溶液的浓度， ug/ml W为供试品重量，mg; 在上述条件下，释放1ug的酪氨酸的酶量为一个活力单位。
试剂酪蛋白溶液：取酪蛋白1g，加L磷酸氢二钠溶液50ml,置沸水浴中煮30分钟，时时搅拌，冷至室温，加L枸椽酸溶液调节PH至±，并迅速搅拌，防止酪蛋白沉淀，用水稀释至100ml（临用新配）。
酶稀释液：取无水磷酸氢二钠，加水400ml溶解，加乙二胺四醋酸二钠和盐酸半胱氨酸，振摇溶解，用1mol/L 盐酸或1mol/L氢氧化钠溶液调节±，用水稀释至500ml,混匀（临用新配）三氯醋酸溶液:取三氯醋酸，加醋酸钠和冰醋酸，加适量水溶解后，加水使成1000ml，摇匀。
酶活力测定对照品溶液的制备:精密称取已105℃干燥至恒重的酪氨酸对照品适量，用L盐酸溶液制成每1ml 中约含40ug的溶液。
供试品溶液的制备:取本品适量（约相当于木瓜酶活力120万单位），精密称定，加酶稀释液振摇，制成每1ml中含200~300单位的溶液，摇匀。
淀粉酶活力测定实验技术 2008-05-27 18:01:29 阅读213 评论0字号：大中小一、目的淀粉是葡萄糖以α-1,4糖苷键及α-1，6糖苷键连结的高分子多糖，是人类和动物的重要食物，也是食品、发酵、酿造、医药、纺织工业的基本原料。
淀粉酶是加水分解淀粉的酶的总称，淀粉酶对淀粉的分解作用是工业上利用淀粉的依据，也是生物体利用淀粉进行代谢的初级反应。
小麦成熟期如遇阴雨天气，有的品种会发生严重的穗发芽，造成巨大损失，这是小麦种子中淀粉酶活动的结果。
因此，淀粉酶的活性测定，具有理论和应用研究的意义。
通过本实验，学习酶活测定的一般方法，巩固并熟练分光光度计的使用。
二、原理淀粉酶主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和R-酶，它们广泛存在于动物、植物和微生物界。
不同来源的淀粉酶，性质有所不同。
植物中最重要的淀粉酶是α-淀粉酶和β-淀粉酶。
α-淀粉酶随机作用于直链淀粉和支链淀粉的直链部分α-1,4糖苷键，单独使用时最终生成寡聚葡萄糖、α-极限糊精和少量葡萄糖。
Ca2+能使α-淀粉酶活化和稳定，它比较耐热但不耐酸，以下可使其钝化。
β-淀粉酶从非还原端作用于α-1,4糖苷键，遇到支链淀粉的α-1,6键时停止。
单独作用时产物为麦芽糖和β-极限糊精。
β-淀粉酶是一种巯基酶，不需要Ca2+及Cl—等辅助因子，最适pH偏酸，与α-淀粉酶相反，它不耐热但觉耐酸，70℃保温15min 可使其钝化。
通常提取液中α-淀粉酶和β-淀粉酶同时存在。
可以先测定（α+β）淀粉酶总活力，然后在70℃加热15min，钝化β-淀粉酶，测出α-淀粉酶活力，用总活力减去α-淀粉酶活力，就可求出β-淀粉酶活力。
淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的还原糖与3,5-二硝基水杨酸的显色反应来测定。
还原糖作用于黄色的3,5-二硝基水杨酸生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，生成物颜色的深浅与还原糖的量成正比。
以每克样品在一定时间内生成的还原糖（麦芽糖）量表示酶活大小。
三、仪器、试剂和材料1.仪器（1）电子顶载天平（2）研钵（3）容量瓶100mL2个（4）具塞刻度试管25Ml15支（5）试管8支（6）吸管1mL3支，2mL12支，5mL1支（7）离心机（8）离心管（9）恒温水浴锅（10）分光光度计2.试剂（1）1%淀粉溶液（2）L氢氧化钠（3）柠檬酸缓冲液称取柠檬酸，溶解后定容至1000mL，为A液。
称取柠檬酸钠，溶解后定容至1000mL，为B液。
取A液与B液混匀，即为之缓冲液。
（4）3,5-二硝基水杨酸精确称取1g3,5-二硝基水杨酸溶于20mL1mol/L氢氧化钠中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水稀释至100Ml ，盖紧瓶塞，防止CO2进入。
（5）麦芽糖标准液（1mg/ml）称取麦芽糖，溶于少量蒸馏水，定容至100mL。
3.材料萌发3天的小麦芽。
四、操作步骤1.酶液提取称取2g萌发3天的小麦种子（芽长1cm左右），置研钵中加少量石英砂和2m1左右蒸馏水，研成匀浆，无损地转入100m1容量瓶中，用蒸馏水定容至100m1，每隔数分钟振荡1次，提取20min。
3000r／min离心l0min，转出上清液备用。
淀粉酶活力测定（1）取试管4支，标明2支为对照管，2支为测定管。
（2）于每管中各加酶液lml，在70℃士℃恒温水浴中准确加热15min，钝化β-淀粉酶。
取出后迅速用流水冷却。
（3）在对照管中加入L氢氧化钠。
（4）在4支试管中各加入的柠檬酸缓冲液。
（5）将4支试管置另一个40℃士℃恒温水浴中保温15min，再向各管分别加入40℃下预热的1％淀粉溶液2m1，摇匀，立即放入40℃恒温水浴准确计时保温5min。
取出后向测定管迅速加入L氢氧化钠，终止酶活动，准备测糖。
3.淀粉酶总活力测定取酶液5ml，用蒸馏水稀释至100m1，为稀释酶液。
另取4支试管编号，2支为对照，2支为测定管。
然后加入稀释之酶液lml。
在对照管中加入氢氧化钠。
4支试管中各加1之柠檬酸缓冲液。
以下步骤重复α-淀粉酶测定第（5）步的操作，同样准备测糖。
4.麦芽糖的测定（1）标准曲线的制作取25ml刻度试管7支，编号。
分别加入麦芽糖标准液（lmg/ml）0,,,,,,，然后用吸管向各管加蒸馏水使溶液达，再各加3，5一二硝基水杨酸试剂，置沸水浴中加热5min。
取出冷却，用蒸馏水稀释至25m1。
混匀后用分光光度计在520nm波长下进行比色，记录吸光度。
以吸光度为纵坐标，以麦芽糖含量（mg）为横坐标，绘制标准曲线。
（2）样品的测定取步骤2,3中酶作用后的各管溶液2m1,分别放入相应的8支25ml具塞刻度试管中，各加入2m13,5-二硝基水杨酸试剂。
以下操作同标准曲线制作。
根据样品比色吸光度，从标准曲线查出麦芽糖含量，最后进行结果计算。
（A—A0）xVT五、结果处理式中A为a-淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖（mg）；Ao为a-淀粉酶的对照管中麦芽糖量（mg）；B为（a十β）淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖（mg）；Bo为（a十β）淀粉酶的对照管中麦芽糖（mg）；VT为样品稀释总体积（ml）；VU为比色时所用样品液体积（ml）；W为样品重（g）。
六、注意事项（1）酶反应时间应准确计算。
（2）试剂加入按规定顺序进行。
七、思考题1.淀粉酶活性测定原理是什么2.酶反应中为什么加的柠檬酸缓冲液为什么在40℃进行保温3.测定酶活力，应注意什么问题？一、目的淀粉是葡萄糖以α-1,4糖苷键及α-1，6糖苷键连结的高分子多糖，是人类和动物的重要食物，也是食品、发酵、酿造、医药、纺织工业的基本原料。
淀粉酶是加水分解淀粉的酶的总称，淀粉酶对淀粉的分解作用是工业上利用淀粉的依据，也是生物体利用淀粉进行代谢的初级反应。
小麦成熟期如遇阴雨天气，有的品种会发生严重的穗发芽，造成巨大损失，这是小麦种子中淀粉酶活动的结果。
因此，淀粉酶的活性测定，具有理论和应用研究的意义。
通过本实验，学习酶活测定的一般方法，巩固并熟练分光光度计的使用。
二、原理淀粉酶主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和R-酶，它们广泛存在于动物、植物和微生物界。
不同来源的淀粉酶，性质有所不同。
植物中最重要的淀粉酶是α-淀粉酶和β-淀粉酶。
α-淀粉酶随机作用于直链淀粉和支链淀粉的直链部分α-1,4糖苷键，单独使用时最终生成寡聚葡萄糖、α-极限糊精和少量葡萄糖。
Ca2+能使α-淀粉酶活化和稳定，它比较耐热但不耐酸，以下可使其钝化。
β-淀粉酶从非还原端作用于α-1,4糖苷键，遇到支链淀粉的α-1,6键时停止。
单独作用时产物为麦芽糖和β-极限糊精。
β-淀粉酶是一种巯基酶，不需要Ca2+及Cl—等辅助因子，最适pH偏酸，与α-淀粉酶相反，它不耐热但觉耐酸，70℃保温15min 可使其钝化。
通常提取液中α-淀粉酶和β-淀粉酶同时存在。
可以先测定（α+β）淀粉酶总活力，然后在70℃加热15min，钝化β-淀粉酶，测出α-淀粉酶活力，用总活力减去α-淀粉酶活力，就可求出β-淀粉酶活力。
淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的还原糖与3,5-二硝基水杨酸的显色反应来测定。
还原糖作用于黄色的3,5-二硝基水杨酸生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，生成物颜色的深浅与还原糖的量成正比。
以每克样品在一定时间内生成的还原糖（麦芽糖）量表示酶活大小。
三、仪器、试剂和材料1.仪器（1）电子顶载天平（2）研钵（3）容量瓶100mL2个（4）具塞刻度试管25Ml15支（5）试管8支（6）吸管1mL3支，2mL12支，5mL1支（7）离心机（8）离心管（9）恒温水浴锅（10）分光光度计2.试剂（1）1%淀粉溶液（2）L氢氧化钠（3）柠檬酸缓冲液称取柠檬酸，溶解后定容至1000mL，为A液。
称取柠檬酸钠，溶解后定容至1000mL，为B液。
取A液与B液混匀，即为之缓冲液。
（4）3,5-二硝基水杨酸精确称取1g3,5-二硝基水杨酸溶于20mL1mol/L氢氧化钠中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水稀释至100Ml ，盖紧瓶塞，防止CO2进入。
（5）麦芽糖标准液（1mg/ml）称取麦芽糖，溶于少量蒸馏水，定容至100mL。
3.材料萌发3天的小麦芽。
四、操作步骤1.酶液提取称取2g萌发3天的小麦种子（芽长1cm左右），置研钵中加少量石英砂和2m1左右蒸馏水，研成匀浆，无损地转入100m1容量瓶中，用蒸馏水定容至100m1，每隔数分钟振荡1次，提取20min。
3000r／min离心l0min，转出上清液备用。
淀粉酶活力测定（1）取试管4支，标明2支为对照管，2支为测定管。
（2）于每管中各加酶液lml，在70℃士℃恒温水浴中准确加热15min，钝化β-淀粉酶。
取出后迅速用流水冷却。