木瓜蛋白酶酶活力检测方法
木瓜蛋白酶活力测定方法
木瓜蛋白酶活力测定方法分别精密量取酪蛋白溶液5ml，置3支具塞试管中，置40℃水浴中保温10分钟，各精密加入供试品溶液2ml，摇匀，置40℃水浴中，开始记时，准确反应1小时，立即精密加入三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，置40℃水浴中放置30~40分钟，使沉淀的蛋白质完全凝固，滤过，滤液作为供试品溶液。
精密量取酪蛋白溶液5ml置另一具试管，于40℃水浴中保温1小时，精密加入三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，精密加入供试品溶液2ml，置40℃水浴中放置30~40分钟，滤过，滤液作为空白溶液。
照分光光度法（中国药典2000年版二部附录IV A），以0.1mol/L 盐酸溶液为空白，在275nm的波长处测定空白溶液、供试品溶液和对照品溶液的吸收度，按下式计算：效价（单位/mg）=A/As＊Cs＊12/2＊稀释倍数/W式中A为供试品溶液的吸收度减去空白溶液的吸收度：As为酪氨酸对照品溶液的吸收度：Cs为酪氨酸对照品溶液的浓度， ug/mlW为供试品重量，mg;在上述条件下，释放1ug的酪氨酸的酶量为一个活力单位。
试剂酪蛋白溶液：取酪蛋白1g，加0.05mol/L磷酸氢二钠溶液50ml,置沸水浴中煮30分钟，时时搅拌，冷至室温，加0.05mol/L枸椽酸溶液调节PH至6.0±0.1，并迅速搅拌，防止酪蛋白沉淀，用水稀释至100ml（临用新配）。
酶稀释液：取无水磷酸氢二钠3.55g，加水400ml溶解，加乙二胺四醋酸二钠1.1g和盐酸半胱氨酸2.74g，振摇溶解，用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠溶液调节PH6.5±0.1，用水稀释至500ml,混匀（临用新配）三氯醋酸溶液:取三氯醋酸17.99g，加醋酸钠29.94g和冰醋酸18.9ml，加适量水溶解后，加水使成1000ml，摇匀。
酶活力测定对照品溶液的制备:精密称取已105℃干燥至恒重的酪氨酸对照品适量，用0.1mol/L盐酸溶液制成每1ml中约含40ug的溶液。
木瓜蛋白酶的检测
2、以BAEE为底物测木瓜蛋白酶的活性
BAEE( 苯甲酰一L－精氨酸乙酯）被木瓜蛋白酶 催化水解成苯甲酰一L精氨酸(BA) 和乙醇 ， 可以利用 BA和BAEE在253nm 处光吸收值的不同，用光学法测 定酶活性。 BAEE法底物纯度高，准确性高，重复性 好，操作简便， 最省工省时，连续测定时，一个样品 在10min之内即可完成，但仪器设备昂贵， 成本偏高： 该测定方法尤其适合精酶制品的活性检测及酶动力学 性质的研究， 也常用于商品木瓜蛋白酶制品的活性测 定。
紫外吸光光度法测定化妆品中木瓜蛋白酶的活力 冯健雯
工业生产中木瓜蛋 白酶 的活性检测方法比较 方 焕 生吉萍 吴显荣
十二烷基苯磺酸钠共振散射光谱法测定木瓜蛋白酶活力 黄国霞 蒋治 良 梁爱徐红娣
云南峨山番木瓜中木瓜蛋白酶的初步纯化及活性测定 黄兴奇等
4、实验室木瓜蛋白酶活力测定
(1)样品处理：精确称取0.05g的木瓜蛋白酶干粉于研钵中，加入少量石英砂 和几滴酶稀释液研磨15min,将酶液用蒸馏水少量多次洗入500ml容量瓶 (不 要将石英砂带入)，定溶，摇匀。取样液5ml,加入酶溶解液10ml，混匀盖严， 将酶激活15min以上(激活时半胱氨酸的浓度要高于0.03mol/L，而且要当天 配制，激活的酶最好在2h内测完)备用。
乙醇溶液对木瓜蛋白酶催化活性的影响 何 平 詹福建 丘泰球
初志战 黄卓烈 巫光宏
木瓜蛋白酶的生产工艺研 谭爱娟 王利民
一、木瓜蛋白酶的简介：
木瓜蛋白酶是从南方果王——番木瓜中提取的乳汁，经科 学加工而制成的食品添加剂。木瓜蛋白酶具有很高的蛋白分解 活性，已广泛用于啤酒酿造、肉类加工、动植物蛋白水解制品、 饼干果酱 、果汁加工和果酒的生产上。特别是在啤酒工业上， 木瓜蛋白酶可作为澄清剂 ，将啤酒中游离的蛋白质分解为易溶 于水的短肽 、氨基酸 ，既丰富了营养成分，又防止啤酒在贮 运过程中产生浑浊与沉淀，延长了啤酒的保存期；另外，在麦 芽糖化阶段加入木瓜蛋白酶，可弥补麦芽中蛋酶 活力不足的缺 陷，提高氨基氮的浓度，保证发酵的正常进行，确保产品具有 良好风味；在肉制品加工方面，木瓜蛋白酶可作为肉类的嫩化 剂(如嫩肉粉 )、分解剂(能够将固体肉完全水解为容易消化吸 收的肉汁，例如鸡精、兔精制造等)等 。
酶活力的测定 国标
木瓜蛋白酶活力的测定一、试剂与溶液1. 三氯乙酸称取三氯乙酸6.54g，用水溶解并定容至100mL。
2. L-酪氨酸标准储备溶液（100μg/mL）精确称取L-酪氨酸0.1000g，用1mol/L盐酸溶液60mL溶解后定容至100mL，即为1mg/mL酪氨酸溶液。
吸取1mg/mL酪氨酸溶液10.00mL，用0.1mol/L盐酸溶液定容至100mL，即得到100μg/mL的L-酪氨酸标准储备溶液。
3. 氢氧化钠溶液（20g/L）称取氢氧化钠2g，加水搅拌溶解。
待溶液到室温后，以水定容至100mL，搅拌均匀。
4. 盐酸溶液1mol/L:取22.5ml的浓盐酸溶液，加水定容至250ml。
0.1mol/L：取1.8ml的浓盐酸溶液，加水定容至200ml。
5. 酪蛋白溶液（10.0g/L）称取标准酪蛋白1g，用少量氢氧化钠溶液润湿，加入相应的缓冲溶液约80mL，在沸水浴中100℃加热回流30min。
冷却到室温后转入100mL容量瓶中，用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度。
此溶液在冰箱内贮存，有效期为3d。
使用前重新确认并调整pH至规定值。
二、分析步骤1. 标准曲线的绘制L-酪氨酸标准溶液：按表1配制。
L-酪氨酸稀释液应在稀释后立即进行测定。
表1 L-酪氨酸标准溶液分别取上述所配的溶液，以0管为空白，利用紫外分光光度计于波长275nm下测定吸光度。
以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线。
利用回归方程，计算出吸光度为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K值。
其K值应在130~135范围内，如不符合，需重新配制试剂，进行实验。
2. 样品的测定待测酶液的制备：称取酶样品1g。
然后用磷酸缓冲溶液充分溶解，定容至50ml。
测定：先将酪蛋白溶液置于（40±0.2）℃恒温水浴中，预热5min，然后按以下流程操作：试管A（空白）↓加酶液2.00mL↓（40±0.2）℃，2min加三氯乙酸4.00mL（摇匀）↓（40±0.2）℃，10min加酪蛋白溶液2.00mL（摇匀）↓取出静止10min，过滤（慢速定性滤纸）定容至100ml↓测滤液吸光度试管B（酶试样，需三个平行样）↓加酶液2.00mL↓（40±0.2）℃，2min加酪蛋白溶液2.00mL（摇匀）↓（40±0.2）℃，10min加三氯乙酸4.00mL（摇匀）↓取出静止10min，过滤（慢速定性滤纸）定容至100ml↓测滤液吸光度三、计算过程从标准曲线上读出样品最终稀释液的酶活力，单位为u/mL。
木瓜蛋白酶实验指导
实验一木瓜蛋白酶的提取及其活性测定一、实验目的通过本实验，要求学习和掌握木瓜蛋白酶酶源的选取、木瓜乳汁的采集及蛋白酶粗酶制剂提取等的基本原理和方法；学习并掌握木瓜蛋白酶活性的测定方法以及酶样中蛋白质含量的测定。
二、实验原理木瓜蛋白酶大量存在于木瓜汁液中，是一种巯基蛋白酶，其分子量为23900。
木瓜蛋白酶最适pH随底物而异，当以酪蛋白为底物时，酶的最适pH为7。
据此原理，本实验以未成熟的木瓜果实为材料，从果皮中采集新鲜乳汁，利用木瓜蛋白酶在pH7.2的磷酸缓冲液、35℃条件下水解底物酪蛋白产生酪氨酸，酪氨酸在275nm处有最大吸收峰，根据吸光值的大小反映酪氨酸的浓度，进而反映木瓜蛋白酶催化水解的反应速率，以此衡量该酶的活性。
考马斯亮蓝G-250在酸性条件下能够与蛋白质结合，形成的络合物在595nm 处具有最大吸光值，且吸光值的大小与蛋白质的含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。
三、实验材料和用具1、实验材料：新鲜、未成熟的木瓜。
2、试剂：0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.2）；1%的酪蛋白溶液：称1g的酪蛋白用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.2）配至100mL；激活剂：用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.2）配制含半胱氨酸20mmol/L，EDTA 1mmol/L的混合液；10%三氯乙酸（TCA）：称10g的TCA定容至100 mL；考马斯亮蓝G-250：称0.1g考马斯亮蓝G-250溶于50mL90%乙醇溶液中，加入85%磷酸溶液100mL，用蒸馏水定容到1000mL。
3、仪器、用具：恒温水浴锅、电子天平、紫外-可见分光光度计、研钵、烧杯、量筒、试管、移液管、吸耳球、漏斗、滤纸、标签纸、试管架、牙签等。
四、实验步骤1．木瓜乳的采集选取挂果30天以上的木瓜果实，用湿棉布小心擦净表面，用牙签等利器，在果实的表面划若干条深约3mm的划痕，此时有大量白色乳汁流出，于木瓜底部用干净的烧杯收集乳汁，片刻后收集的乳汁便会凝固。
木瓜蛋白酶酶活力测定
木瓜蛋白酶酶活力测定1、原理蛋白酶在一定温度与pH条件下，水解酪蛋白底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪蛋白沉淀出去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定，根据吸收度计算酶活力。
2、酶活力定义在一定条件下，每分钟水解酪蛋白生成1ug酪氨酸所需的酶的量，为1个酶活力单位（U）。
3、仪器和设备恒温水浴（37±0.2）℃紫外分光光度计4、试剂和溶液4.1、酶稀释液称取L-半胱氨酸盐酸盐（C3H7NO2S·HC L·H2O）5.27g，氯化钠（NaCL）23.4g，加水500ml溶解，另取乙二胺四乙酸二钠2.23g加水200ml溶解，合并两液混匀，用0.1mol/l 氢氧化钠溶液或0.1mol/l盐酸溶液调至pH=5.5，加水稀释至1000ml。
4．2、0.05mol/l磷酸氢二钠溶液称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）17.89g，加水溶解，并定容至1000ml。
4.3、酪蛋白溶液称取经硅胶干燥器忠干燥至衡重的酪蛋白0.6g（精确到0.0002g），置烧杯中，假如0.05mol/l磷酸氢二钠溶液80ml。
在沸水浴忠边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，用0.1mol/l盐酸调至pH=7.0,转移到100ml容量瓶中，加水至刻度。
临用现配。
4.4、三氯乙酸溶液称取三氯乙酸8.995g，加无水乙酸钠14.97g，冰乙酸9.45ml加适量水溶解后，加水使成500ml，振摇均匀。
4.5、酪氨酸标准溶液称取于105℃干燥至衡重的酪氨酸50mg（精确0.0002g）用0.1mol/l盐酸溶解，移入100ml容量瓶中，并用0.1mol／l盐酸调至刻度，摇匀，即可得含酪氨酸50ug／ml的溶液。
4.6、试样溶液称取木瓜蛋白酶0.9g（精确0.0002g）置于研钵中，加入少量酶稀释液研磨20min，用酶稀释液移至250ml容量瓶中，加酶稀释液至刻度，充分摇匀；取出上述液体1ml以酶稀释液稀释，定容20ml，充分摇匀，供测试用（60min内使用）。
木瓜蛋白酶活性实验报告
一、实验目的1. 了解木瓜蛋白酶的性质和作用机理。
2. 探究不同条件对木瓜蛋白酶活性的影响。
3. 通过实验验证木瓜蛋白酶在食品加工中的应用潜力。
二、实验原理木瓜蛋白酶是一种含疏基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力。
木瓜蛋白酶的活性受pH、温度、离子强度等因素的影响。
本实验通过测定木瓜蛋白酶在不同pH、温度和离子强度下的活性，探讨其活性影响因素。
三、实验材料1. 木瓜蛋白酶样品2. 酚酞指示剂3. 酶反应缓冲液4. 硫酸铜溶液5. 碘液6. pH计7. 恒温水浴锅8. 移液器9. 试管四、实验方法1. pH对木瓜蛋白酶活性的影响（1）取5支试管，分别加入0.5ml酶反应缓冲液，编号为1、2、3、4、5。
（2）分别向5支试管中加入0.1ml木瓜蛋白酶样品，编号为1、2、3、4、5。
（3）分别向5支试管中加入0.5ml不同pH的酶反应缓冲液（pH 2、4、6、8、10）。
（4）将5支试管置于37℃恒温水浴锅中保温10分钟。
（5）向5支试管中加入0.5ml酪蛋白溶液，摇匀。
（6）观察并记录各试管溶液的颜色变化。
2. 温度对木瓜蛋白酶活性的影响（1）取5支试管，分别加入0.5ml酶反应缓冲液，编号为1、2、3、4、5。
（2）分别向5支试管中加入0.1ml木瓜蛋白酶样品，编号为1、2、3、4、5。
（3）分别将5支试管置于0℃、20℃、37℃、50℃、70℃恒温水浴锅中保温10分钟。
（4）向5支试管中加入0.5ml酪蛋白溶液，摇匀。
（5）观察并记录各试管溶液的颜色变化。
3. 离子强度对木瓜蛋白酶活性的影响（1）取5支试管，分别加入0.5ml酶反应缓冲液，编号为1、2、3、4、5。
（2）分别向5支试管中加入0.1ml木瓜蛋白酶样品，编号为1、2、3、4、5。
（3）分别向5支试管中加入不同离子强度的硫酸铜溶液（0.01mol/L、0.05mol/L、0.1mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L）。
紫外吸光光度法测定化妆品中木瓜蛋白酶的活力
紫外吸光光度法测定化妆品中木瓜蛋白酶的活力作者：冯健雯(梧州市产品质量监督检验所,梧州543002)样品用磷酸盐半胱氨酸ＥＤＴＡ缓冲溶液搅拌溶解后,选择一定的ｐＨ值和温度条件,样品中的木瓜蛋白酶能将加入的酪蛋白水解生成可溶解的氨基酸,末水解的酪蛋白用三氯乙酸沉淀后过滤,溶解的水解产物用紫外吸光光度法测定[1]。
1试验部分1.1试剂与仪器磷酸钠溶液:0.05ｍｏｌ·Ｌ-1,称取十二水磷酸氢二钠1.79ｇ溶解于100ｍｌ水中。
柠檬酸溶液:0.05ｍｏｌ·Ｌ-1,将柠檬酸一水合物1.05ｇ用100ｍｌ水溶解。
缓冲溶液:称取十二水磷酸氢二钠17.89ｇ溶于800ｍｌ水中,再将ＥＤＴＡ钠盐二水合物14.0ｇ和盐酸半胱氨酸一水合物6.1ｇ溶于其中。
用1ｍｏｌ·Ｌ-1盐酸或1ｍｏｌ·Ｌ-1氢氧化钠将ｐＨ值调到6.0±0.1,加水定容至1Ｌ。
三氯乙酸溶液:将三氯乙酸30ｇ溶于100ｍｌ水中酪蛋白作用物:将1ｇ干燥的酪蛋白分散在50ｍｌ磷酸钠溶液中,在沸水浴中加热30ｍｉｎ,经常搅拌之,冷至室温,在连续快速的搅拌下,用柠檬酸溶液调ｐＨ值至6.0±0.1,加水定容至100ｍｌ。
标准溶液:1ｍｇ·ｍｌ-1,称取ＵＳＰ木瓜蛋白酶对照标准物100ｍｇ(其活力为100ＰＵ·ｍｇ-1),用磷酸盐半胱氨酸ＥＤＴＡ缓冲溶液溶解,定容100ｍｌ。
标准使用液:移取0.25,0.50,1.00,1.50,2.00,2.50ｍｌ标准溶液于一组10ｍｌ容量瓶中,用缓冲溶液稀释至刻度,摇匀。
酸度计:分度值0.1ｐＨ,ｐＨ6.0±0.1。
超级恒温水浴:40±0.1℃紫外分光光度计:波长200～1000ｎｍ1.2测定方法1.2.1样品处理称取样品1.00～2.00ｇ,加磷酸盐半胱氨酸ＥＤＴＡ缓冲溶液搅拌溶解后转移至50ｍｌ容量瓶中,用缓冲溶液稀释至刻度,摇匀。
紫外分光光度法对嫩肉粉中木瓜蛋白酶活力的测定方法研究
中木瓜蛋白酶的酶活力大小, 为判断嫩肉粉质量优劣提 供参考依 据。把嫩肉粉 溶于盐酸半 胱氨酸 溶液, 取该
混合液与酪蛋白溶液反应 10m in, 用紫外分光 光度法测 得反应 所生成 酪氨酸 的含量。该 方法具 有较好 的准确
性和重现性, 添加标准回收率为 96 8% ~ 105 8% ; 且步骤简明, 所需测试仪器简单。在该方法条件下, 每分
酶活力是酶性质的重要参数, 显示酶分解底 物能力的强弱。木瓜蛋白酶酶活力的测定, 采用 不同底物衍生的测定方法也不同, 所取得的数值 也不能进行直接比较。传统的作法, 木瓜蛋白酶 是用明胶或血红蛋白作底物来测定的。由于要求 底物具有较高的专一性和便于标准化, 新的测定 方法往往采用合成的 N - 苯甲酰 - L - 精氨酸乙酯 ( BA EE ) [ 3] 。但以 BAEE 为底物的测定 方法所涉 及到的仪器设备昂贵, 成本偏高 [ 4] 。本文采用以 酪蛋白为底物的紫外光谱法来测定嫩肉粉中木瓜 蛋白酶的活力, 该法所需测试仪器简单, 步骤简 明, 容易掌握; 并且该法也常被国内用来测定各 种酶的活力, 所得的数据便于比较。对嫩肉粉中 木瓜蛋白酶活力的测定, 可为嫩肉粉质量优劣提 供一项重要的参考指标。
入三氯乙酸溶液 5m L, 振摇, 置 ( 37 0 2) ! 水
浴中, 反应 10m in后, 准确加入 ( 37 0 2) ! 预
热的底物溶液 5 0mL, 振摇, 于 ( 37 0 2) ! 水
浴中放置 40m in, 用干燥滤纸过滤, 滤液在 2h内
采用分光光度法以水为空白, 在 275nm 的波长处
1 实验部分
1 1 仪器 恒温水浴锅; 751- GW 分光光度计。
1 2 试剂 酪蛋白溶液: 取酪蛋 白 0 6g, 加 0 05m o l/L
木瓜蛋白酶活力测定方法
木瓜蛋白酶活力测定方法分别精密量取酪蛋白溶液5ml，置3支具塞试管中，置40℃水浴中保温10分钟，各精密加入供试品溶液2ml，摇匀，置40℃水浴中，开始记时，准确反应1小时，立即精密加入三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，置40℃水浴中放置30~40分钟，使沉淀的蛋白质完全凝固，滤过，滤液作为供试品溶液。
精密量取酪蛋白溶液5ml置另一具试管，于40℃水浴中保温1小时，精密加入三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，精密加入供试品溶液2ml，置40℃水浴中放置30~40分钟，滤过，滤液作为空白溶液。
照分光光度法（中国药典2000年版二部附录IV A），以L 盐酸溶液为空白，在275nm的波长处测定空白溶液、供试品溶液和对照品溶液的吸收度，按下式计算：效价（单位/mg）=A/As＊Cs＊12/2＊稀释倍数/W 式中A 为供试品溶液的吸收度减去空白溶液的吸收度： As为酪氨酸对照品溶液的吸收度： Cs为酪氨酸对照品溶液的浓度， ug/ml W为供试品重量，mg; 在上述条件下，释放1ug的酪氨酸的酶量为一个活力单位。
试剂酪蛋白溶液：取酪蛋白1g，加L磷酸氢二钠溶液50ml,置沸水浴中煮30分钟，时时搅拌，冷至室温，加L枸椽酸溶液调节PH至±，并迅速搅拌，防止酪蛋白沉淀，用水稀释至100ml（临用新配）。
酶稀释液：取无水磷酸氢二钠，加水400ml溶解，加乙二胺四醋酸二钠和盐酸半胱氨酸，振摇溶解，用1mol/L 盐酸或1mol/L氢氧化钠溶液调节±，用水稀释至500ml,混匀（临用新配）三氯醋酸溶液:取三氯醋酸，加醋酸钠和冰醋酸，加适量水溶解后，加水使成1000ml，摇匀。
酶活力测定对照品溶液的制备:精密称取已105℃干燥至恒重的酪氨酸对照品适量，用L盐酸溶液制成每1ml 中约含40ug的溶液。
供试品溶液的制备:取本品适量（约相当于木瓜酶活力120万单位），精密称定，加酶稀释液振摇，制成每1ml中含200~300单位的溶液，摇匀。
蛋白酶酶活力的测定
五、心得体会
一、在本实验中的对照组是为了证明在酸性条件下，胰蛋白酶无法催化酪蛋白水解；空白对照是要排除蒸馏水能与Folin试剂产生蓝色这种可能的存在。
二、稀释的酶溶液不能长期使用。因为酶的活性并不能长期保持，放置时间过长会导致酶活性丧失而引起较大实验误差，甚至无法完成实验。
六、参考文献
实验报告
课程名称：食品化学与分析实验指导老师：_冯凤琴_____成绩：__________________
实验名称：蛋白酶酶活力的测定实验类型：定量实验
一、实验目的二、实验原理三、材料、仪器与试剂
四、实验步骤五、结果及分析六、讨论七、参考文献
一、实验目的
1、了解蛋白酶的作用机理和作用条件。
2、掌握测定酶活力的方法及其原理。
三、材料、仪器与试剂
（一）材料：木瓜蛋白酶、酪蛋白、酪氨酸
（二）仪器：可见-紫外分光光度计、水浴锅、天平、具塞刻度试管(10、15ml)、试管架，容量瓶(100、500ml、1000mL)、移液管(1、10ml)、烧杯(25ml)、玻璃棒。
（三）试剂：
1、0.5mol/LNaOH溶液：取4gNaOH固体，溶解后，定容在100mL蒸馏水中
四、实验步骤
（一）酪氨酸标准曲线制作
1、取6只干燥、洁净的试管，编号为1~6。
2、按照下表所示配方，分别用移液管向各试管中加入相应物质，震荡混匀。
3、在40℃水浴中显色20分钟，于680nm波长处进行比色，以1号试管为空白组，测各组溶液的吸光值并进行记录。
试管编号
1
2
3
4
5
6
200μg /mL标准酪氨酸溶液(mL)
1、《食品化学》作者冯凤琴，陆柏益等出版社：浙江大学出版社
木瓜蛋白酶活力测定方法
木瓜蛋白酶活力测定方法分别精密量取酪蛋白溶液5ml，置3支具塞试管中，置40℃水浴中保温10分钟，各精密加入供试品溶液2ml，摇匀，置40℃水浴中，开始记时，准确反应1小时，立即精密加入三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，置40℃水浴中放置30~40分钟，使沉淀的蛋白质完全凝固，滤过，滤液作为供试品溶液。
精密量取酪蛋白溶液5ml置另一具试管，于40℃水浴中保温1小时，精密加入三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，精密加入供试品溶液2ml，置40℃水浴中放置30~40分钟，滤过，滤液作为空白溶液。
照分光光度法（中国药典2000年版二部附录IV A），以0.1mol/L盐酸溶液为空白，在275nm的波长处测定空白溶液、供试品溶液和对照品溶液的吸收度，按下式计算：效价（单位/mg）=A/As＊Cs＊12/2＊稀释倍数/W式中A为供试品溶液的吸收度减去空白溶液的吸收度：As为酪氨酸对照品溶液的吸收度：Cs为酪氨酸对照品溶液的浓度，ug/mlW为供试品重量，mg;在上述条件下，释放1ug的酪氨酸的酶量为一个活力单位。
试剂酪蛋白溶液：取酪蛋白1g，加0.05mol/L磷酸氢二钠溶液50ml,置沸水浴中煮30分钟，时时搅拌，冷至室温，加0.05mol/L枸椽酸溶液调节PH至6.0±0.1，并迅速搅拌，防止酪蛋白沉淀，用水稀释至100ml（临用新配）。
酶稀释液：取无水磷酸氢二钠3.55g，加水400ml溶解，加乙二胺四醋酸二钠1.1g和盐酸半胱氨酸2.74g，振摇溶解，用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠溶液调节PH6.5±0.1，用水稀释至500ml,混匀（临用新配）三氯醋酸溶液:取三氯醋酸17.99g，加醋酸钠29.94g和冰醋酸18.9ml，加适量水溶解后，加水使成1000ml，摇匀。
酶活力测定对照品溶液的制备:精密称取已105℃干燥至恒重的酪氨酸对照品适量，用0.1mol/L盐酸溶液制成每1ml中约含40ug的溶液。
木瓜蛋白酶酶活力测定
木瓜蛋白酶酶活力测定1、原理蛋白酶在一定温度与pH条件下，水解酪蛋白底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪蛋白沉淀出去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定，根据吸收度计算酶活力。
2、酶活力定义在一定条件下，每分钟水解酪蛋白生成1ug酪氨酸所需的酶的量，为1个酶活力单位（U）。
3、仪器和设备恒温水浴（37±0.2）℃紫外分光光度计4、试剂和溶液4.1、酶稀释液称取L-半胱氨酸盐酸盐（C3H7NO2S·HC L·H2O）5.27g，氯化钠（NaCL）23.4g，加水500ml溶解，另取乙二胺四乙酸二钠2.23g加水200ml溶解，合并两液混匀，用0.1mol/l 氢氧化钠溶液或0.1mol/l盐酸溶液调至pH=5.5，加水稀释至1000ml。
4．2、0.05mol/l磷酸氢二钠溶液称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）17.89g，加水溶解，并定容至1000ml。
4.3、酪蛋白溶液称取经硅胶干燥器忠干燥至衡重的酪蛋白0.6g（精确到0.0002g），置烧杯中，假如0.05mol/l磷酸氢二钠溶液80ml。
在沸水浴忠边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，用0.1mol/l盐酸调至pH=7.0,转移到100ml容量瓶中，加水至刻度。
临用现配。
4.4、三氯乙酸溶液称取三氯乙酸8.995g，加无水乙酸钠14.97g，冰乙酸9.45ml加适量水溶解后，加水使成500ml，振摇均匀。
4.5、酪氨酸标准溶液称取于105℃干燥至衡重的酪氨酸50mg（精确0.0002g）用0.1mol/l盐酸溶解，移入100ml容量瓶中，并用0.1mol／l盐酸调至刻度，摇匀，即可得含酪氨酸50ug／ml的溶液。
4.6、试样溶液称取木瓜蛋白酶0.9g（精确0.0002g）置于研钵中，加入少量酶稀释液研磨20min，用酶稀释液移至250ml容量瓶中，加酶稀释液至刻度，充分摇匀；取出上述液体1ml以酶稀释液稀释，定容20ml，充分摇匀，供测试用（60min内使用）。
实验三十三 木瓜蛋白酶性质测定
实验三十三木瓜蛋白酶性质测定一、目的：1 、学习并掌握木瓜蛋白酶活性的测定基本原理。
•熟练掌握不同的因素如EDTA 、半胱氨酸、抑制剂、 pH 等对木瓜蛋白酶活力的影响原理和检测技术。
•学习和理解酶学动力学曲线的实验设计和实验方法。
二、原理木瓜蛋白酶（ Papain ）是一种巯基蛋白酶，它分解比胰脏蛋白水解酶更多、更广泛的蛋白底物。
它也具有脂酶活力。
其分子量约为 23000 左右。
在 25 ℃ , pH6.2 时， 1 分钟水解 1 μ mol 分子苯甲酰－ L －精氨酸乙脂的酶量为 1 单位。
木瓜蛋白酶是单条肽链，有 211 氨基酸残基折叠成两部分形成裂缝，酶分子只有 1 个巯基，对酶活力是必需的，激活剂有半胱氨酸，硫化物，亚硫酸盐和 EDTA ；抑制剂有巯基试剂，包括重金属和羧基试剂和过氧化氢。
酪蛋白是一种蛋白质，它被木瓜蛋白酶降解生成的酪氨酸在紫外光区 275nm 处有吸收峰，根据测定 275nm 处的吸收值，可以判定木瓜蛋白酶的酶活力。
吸收值的大小与酪氨酸含量的多少有关，吸收值大说明酪氨酸含量高，也就是说木瓜蛋白酶分解的酪蛋白多，酶活力高。
三.实验材料市售木瓜蛋白酶四.仪器设备（ 1 ）磁力搅拌器（机）（ 2 ）离心机 4000~1000rpm （冷冻式或非冷冻式）（ 3 ） 752 紫外分光光度计（ 4 ）磁力搅拌器（ 5 ）水浴箱（ 6 ）冰箱五.玻璃器皿（以组为单位）试管（ 6 ）， 100 mL 烧杯（ 2 ），吸管（ 1 ）、玻棒（ 1 ），试剂瓶（ 1000 mL 、 500 mL 、 250 mL 等），移液管或移液器 5mL(1) 、 1mL(2) 、 0.5mL （ 1 ），漏斗（ 3 ），滤纸（ 3~6 ）等六.实验试剂配制及实验步骤（一）酶活力测定1 试剂1 · 3mg/ml 木瓜蛋白酶液（用 0.1mol/L 的磷酸缓冲液， pH 7.2 配制）2 · 0.1mol/L 的磷酸缓冲液， pH 7.23 ·激活剂：3.1 用 0.1mol/L 磷酸缓冲液（ pH 7.2 ）配制含 80mmol/L 半胱氨酸，3.2 用 0.1mol/L 磷酸缓冲液（ pH 7.2 ）配制含 8mmol/L EDTA4 · 1% 酪蛋白溶液：用 0.1mol/L 磷酸缓冲液（ pH 7.2 ）配制5 · 15% 三氯乙酸（ TCA ）溶液2 方法（二） EDTA 对木瓜蛋白酶活力的影响1 试剂酸，分别含有 0 ， 0.2,0.4,0.6,0.8,1,2,4mmol/L EDTA 的 8 种混合液3 分析三）半胱氨酸对木瓜蛋白酶活力的影响1 试剂有 0 ， 1 ， 5 ， 10 ，20 ， 30 ， 40 ， 50mmol/L 半胱氨酸的 8 种混合液2 方法3 分析（四）抑制剂对木瓜蛋白酶活力的影响一、试剂1 ·配制浓度分别为 0,0.5,1,2,3,4,5mmol/L 的过氧化氢溶液2 ·用 0.1mol/L 磷酸缓冲液（ PH 7.2 ）配制浓度分别为0.1%,0.2%,0.4%,0.6%,0.8%,1% 的酪蛋白溶液二、方法（ 1 ）不同的抑制剂（过氧化氢）浓度的抑制效果（ 4 ）不同底物浓度，无抑制剂（五）不同 PH 值对木瓜蛋白酶活力的影响1 试剂1 · PH 5.0 缓冲液 0.1mol/L 乙酸－乙酸钠缓冲液PH 6.0 缓冲液 0.1mol/L 磷酸氢二钠－磷酸二氢钠缓冲液PH 7.0 缓冲液 0.1mol/L 磷酸氢二钠－磷酸二氢钠缓冲液PH 7.3 缓冲液 0.1mol/L 磷酸氢二钠－磷酸二氢钠缓冲液PH 7.7 缓冲液 0.1mol/L 磷酸氢二钠－磷酸二氢钠缓冲液PH 8.0 缓冲液 0.1mol/L 磷酸氢二钠－磷酸二氢钠缓冲液PH 9.3 缓冲液 0.1mol/L 硼砂－氢氧化钠缓冲液PH 10.0 缓冲液 0.1mol/L 硼砂－氢氧化钠缓冲液2 ·用以上缓冲液分别配制不同 PH 值的激活剂和酪蛋白溶液3 分析七 . 实验结果分析1. 各实验组分析讨论实验结果，再由老师进行归纳总结。
碱性、木瓜蛋白酶活力测定
碱性蛋白酶活力测定【实验目的】1. 掌握测定碱性蛋白酶活力的原理和酶活力的计算方法。
2. 学习测定酶促反应速度的方法和基本操作。
【实验原理】酶活力是指酶催化某些化学反应的能力。
酶活力的大小可以用在一定条件下它所催化的某一化学反应的速度来表示。
测定酶活力实际就是测定被酶所催化的化学反应的速度。
酶促反应的速度可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示，为了灵敏起见，通常是测定单位时间内产物的生成量。
由于酶促反应速度可随时间的推移而逐渐降低其增加值，所以，为了正确测得酶活力，就必须测定酶促反应的初速度。
碱性蛋白酶在碱性条件下，可以催化酪蛋白水解生成酪氨酸。
酪氨酸为含有酚羟基的氨基酸，可与福林试剂（磷钨酸与磷钼酸的混合物）发生福林酚反应。
（福林酚反应：福林试剂在碱性条件下极其不稳定，容易定量地被酚类化合物还原，生成钨蓝和钼蓝的混合物，而呈现出不同深浅的蓝色。
）利用比色法即可测定酪氨酸的生成量，用碱性蛋白酶在单位时间内水解酪蛋白产生的酪氨酸的量来表示酶活力。
【实验材料】1.实验器材电热恒温水浴槽；分析天平；容量瓶；移液管；721分光光度计2.实验试剂(1)福林试剂：在1L容积的磨口回流瓶中加入50g钨酸钠(Na2WO4·2H2O)、125g钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)、350ml蒸馏水、25ml 85％磷酸及50ml浓盐酸，充分混匀后回流10h。
回流完毕，再加25g硫酸锂、25ml蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴，冷却后定容到500ml。
过滤，置于棕色瓶中暗处保存。
使用前加4倍蒸馏水稀释。
(2)1%酪蛋白溶液：称取酪蛋白1克于研钵中，先用少量蒸馏水湿润后，慢慢加入0.2mol/L NaOH 4ml，充分研磨，用蒸馏水洗入100ml容量瓶中，放入水浴中煮沸15分钟，溶解后冷却，定容至100ml，保存于冰箱内。
(3)pH10缓冲溶液：甲液（0.05mol/L硼砂溶液）：取硼砂(Na2B4O7·10H2O) 19克，用蒸馏水溶解并定容至1000ml 。
工业生产中木瓜蛋白酶的活性检测方法比较
A0
=
A T YT 100
测定上述滤液在 280 nm 处的消光
值比 ,并计算同一处理的平均值 A 。
酶活力单位的定义 : 在测定条件下
每分钟水解酪蛋白释出的三氯乙酸可溶
物在 280 nm 处的消光值相当于浓度为 1μg/ ml 酪氨酸消光时所需的酶量为一 个酶活力单位 (U) 。
酶制剂的活性 (
U/
测得酶反应液的消光值为 A ,酪氨酸标
准液的消光值为 ATyr ,求出 1 μg/ ml 酪
氨酸标准液的消光值
A0
(A0
=
A Tyr ) 10
。
酶活力单位定义 :在测定条件下 ,每
分钟水解酪蛋白的三氯乙酸可溶物与茚
三酮反应后在 570 nm 处的消光值等于 1 μg/ ml 酪 氨 酸 显 色 后 测 得 的 消 光 值 时 ,所需的酶量为一个酶活力单位 (U) 。
2 7
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●基料与配料
食品与机械
2000 年第 6 期
至室温 ,放置 10 min ,在 570 nm 处比色 ,
木瓜蛋白酶 ( Papain , EC 31412212) 是一种具有广泛底物专一性的巯基类蛋 白酶 。有很强的分解蛋白质的能力[1 ] , 此外 也 具 有 水 解 酰 胺 键 和 酯 键 的 特 性[2 ] 。由于它具有适用 p H 范围广 , 热 稳定性好等优点 ,广泛应用于医药 ,食
农业部重点资助课题 广州酶制品厂 ,510315 广东
具体操作如下 : 在具塞试管中分别 加入 5 ml 1 %酪蛋白溶液 。配制方法 : 10 g 酪蛋白于 500 ml 50 mM Na2 HPO4 溶液中 ,沸水浴 30 min ,不断搅拌 ,冷却 至室 温 后 , 用 50 mM 柠 檬 酸 调 p H 至 610 ,最后用蒸馏水定容至 1 000 ml 。测 定温度下预热 10 min ,加入 1 ml 酶液 , 摇匀 ,立即准确计时 。用 4 ml 20 %三氯 乙酸溶液终止反应 ,摇匀后继续在水浴 中放置 30 min ,然后过滤 ,滤液作紫外法
木瓜蛋白酶活力的测定
蛋白酶的活力用分解出来的酪氨酸来表示。
目前国内通用的蛋白酶的活力单位定义为: 1min水解出1 g酪氨酸的酶量称为1个单位。
因此，在测定酶活力之前，先用福林酚试剂与已知的不同浓度的酪氨酸反应，作出蓝色深浅程度(用0D值来表示)与酪氨酸浓度关系的标准曲线，然后将酶和底物反应的产物与福林酚试剂作用，在分光光度计上读出光密度，再在标准曲线上推算出相当于多少g的酪氨酸，计算出酶活力单位木瓜蛋白酶是天然复合蛋白酶，通常，测定其酶活力时间长，操作复杂，且需要玛瑙研钵等昂贵仪器。
由于木瓜蛋白酶中的各种酶与酪蛋白作用生成的产物是一致的，即酶催化蛋白质的肽键水解，生成游离的氨基酸或多肽。
因此可以利用福林酚试剂与水解出来的酪氨酸作用，生成蓝色物质，通过分光光度比色法可以计算出酶活力的大小.(1)福林酚试剂:称取钨酸钠(Na2wo4·2H20)25g、钼酸钠Na2MnO4·2H20)25g放入2000m1圆底烧瓶中，加入175ml蒸馏水，再加入50ml 85％的磷酸及100ml浓盐酸。
装好回流冷凝管(接口处包有铝薄或玻璃纸的软木塞)，加热到沸腾，然后用／1、火保持缓和的沸腾状态，回流10h，回流结束后加入150g硫酸锂Li2SO4和50ml水，并在沸腾(不必装冷凝管)时立即加入几滴溴液(应趁热加溴，否则没有充分作用就挥发完了)，待作用数分钟后再煮沸15min，以除去过量的溴。
加溴的作用是除掉溶液中的绿色。
如果溶液仍呈绿色，可再加入几滴溴液，再煮沸除去多余的溴直至试剂呈黄色。
冷却后稀释至1000ml(原液)，过滤，贮于棕色瓶，f临用前将此原液加入2倍蒸馏水稀释而成。
(2)标准酪氨酸溶液称取100mg酪氨酸(预先在105℃烘箱内烘至·匣重)，以0．2N HC1溶解后定容到100ml，再用水稀释5倍，即得到2001,zg／L的酪氨酸溶液.(3)酪蛋白溶液称取酪蛋白2g，置于100ml三角瓶中，加入0．2mol／L NazHPO 61ml，置水浴上搅动使其溶解，然后倾出上清液(可能有少量蛋白质颗粒不能完全溶解)，加入39ml 0．2mol／L NaH2PO ，得到pH 7．0的酪蛋白溶液，其余几种pH 的酪蛋白液可照此法制备，pH 5．8酪蛋白液用H3PO 调节，pH 8．5酪蛋白液可全部用Na2HPO 配制，再用NaOH 调节至8．5。
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木瓜蛋白酶酶活力检测方法南宁庞博生物工程有限公司企业标准Q/NPB 01-2019食品添加剂木瓜蛋白酶制剂1、范围本标准规定了食品添加剂木瓜蛋白酶制剂的原辅料要求、技术要求、试验方法、检验规则、标志、包装、运输、贮存。
本标准适用于以木瓜果乳汁为原料，添加葡萄糖，经浸泡提取、过滤、浓缩、干燥、调配粉碎、包装等工艺制成的食品添加剂木瓜蛋白酶制剂。
2、规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准引用而成为本标准的条款。
凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/T 191-2019 包装储运图示标志GB/T 601-2002 化学试剂标准滴定溶液的制备 GB/T 602-2002 化学试剂杂质测定用标准溶液的制备 GB/T 603-2002 化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备 GB 2760 食品添加剂使用卫生标准GB/T 4789.2-2019 食品卫生微生物检验菌落总数的测定 GB/T 4789.3-2019 食品卫生微生物检验大肠菌群计数 GB/T 4789.4-2019 食品卫生微生物检验沙门氏菌检测GB/T 4789.6-2019 食品卫生微生物检验致泻大肠埃希氏菌检测 GB/T 4789.10-2019 食品卫生微生物检验金黄色葡萄球菌检验 GB/T 5009.3-2019 食品中水分的测定GB/T 5009.74-2019 食品添加剂中重金属限量试验 GB/T 5009.75-2019 食品添加剂中铅的测定 GB/T 5009.76-2019 食品添加剂中砷的测定 GB 5749-2019 生活饮用水卫生标准GB/T 6682-2019 分析实验室用水规格和试验方法 GB 7718 预包装食品标签通则GB/T 8170-2019 数值修约规则与极限数值的表示和判定 GB/T 20880-2019 食用葡萄糖JJF 1070 定量包装商品净含量检验规则 NY/T 691-2019 番木瓜定量包装商品计量监督管理办法国家质量监督检验检疫总局令（2019）第75号 3、原辅料要求 3.1 水应符合 GB 5749-2019规定 3.2 木瓜果应符合NY/T 691-2019的规定 3.3 葡萄糖应符合GB/T 20880-2019中无水葡萄糖的规定 3.4 食品添加剂食品添加剂使用的品种和使用量应符合GB2760 的规定，质量应符合相应产品标准的规定。
4、技术要求 4.1 感官应符合表1的规定表14.2 理化指标应符合表2的规定。
4.3 微生物指标应符合表3规定。
5、试验方法 5.1 一般规定本标准所用试剂和水，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和GB/T 6682-2019中规定的三级水；所述溶液如未指明溶剂，均系水溶液；所有滴定分析用标准溶液按GB/T 601-2002配制和标定；所有杂质测定用标准溶液按GB/T 601-2002配制；所有试验方法中所用制剂和制品按GB/T 603-2002配制。
5.2 感官用目测、鼻嗅、口尝方法检查。
5.3 理化指标 5.3.1 酶活力的测定 5.3.1.1 原理蛋白酶在一定温度与PH条件下，水解酪蛋白底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪蛋白沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定，根据吸收度计算酶活力。
5.3.1.2 酶活力定义在一定的条件下，每分钟水解酪蛋白生成1ug酪氨酸所需的酶的量，为1个酶活力单位（U）。
5.3.1.3 仪器和设备恒温水浴（37±0.2℃）.紫外分光光度计。
5.3.1.4 试剂和溶液 5.3.1.4.1 酶稀释液称取L-半胱氨酸盐酸盐（C3N7NO2S·HCl·H2O=157.63）5.27g，氯化钠（NaCl）23.4g，加水500mL溶解，另取乙二胺四乙酸二钠（C10H14N2O8Na2·2H2O）（该物质在水中的溶解度不高，如果没有溶解会使溶液出现浑浊现象）2.23g，加水200mL溶解，合并两液均匀，用0.1mol/L氢氧化钠溶液或0.1mol/L盐酸溶液调至PH=5.5（初次配该溶液PH原始值为1.75，需要加0.5mol/L的氢氧化钠25ml左右调节至PH=5.5），加水稀释至1000mL。
5.3.1.4.2 0.05mol/L磷酸氢二钠溶液称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）17.89g，加水溶解，并定容至1000mL。
（该溶液使用量为80ml，配制时可考虑配100ml） 5.3.1.4.3 酪蛋白溶液（该溶液配制过程较快，可以不用提前很久配制。
）称取经硅胶干燥器中干燥至恒重的酪蛋白（干酪素，不经干燥至恒重仍可做检测）0.6g（精确至0.0002g），置烧杯中，加入0.05mol/L磷酸氢二钠溶液80mL。
在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，用0.1mol/L盐酸调至PH=7.0（初次配该溶液，配制好后PH值在7.5左右，需要加盐酸调节，0.1mol/L的盐酸用量为5ml左右），转移到100mL容量瓶中，加水至刻度。
临用现配。
5.3.1.4.4 三氯乙酸溶液称取三氯乙酸（C2HCl3O2）17.99g，加无水乙酸钠（CH3COONa）29.94g和冰乙酸（CH3COOH）18.9mL，加适量水溶解后，加水定容至1000mL，振摇均匀。
5.3.1.4.5 酪氨酸标准溶液称取于105℃干燥至恒重的酪氨酸50mg（精确至0.0002g），用0.1mol/L盐酸溶解，移入100mL容量瓶中，并用0.1mol/L盐酸定容至刻度，摇匀。
吸收1.00mL置10mL容量瓶中，加0.1mol/L盐酸至刻度，摇匀，即得含酪氨酸50ug/mL的溶液。
5.3.1.4.6 试样溶液（稀释倍数为25000）称取适量试样（精确至0.0002g）（稀释倍数参考表4）置研体中，加少量酶稀释液研磨20min，用酶稀释液移至250mL容量瓶中，加酶稀释液至刻度，充分摇匀；根据不同品种酶活力高低，吸取适量试样溶液置于容量瓶中，加酶稀释液稀释至适当浓度（稀释至试样溶液吸光度在0.2～0.6范围内），充分摇匀，供测试用（60min内使用）。
表45.3.1.5 测定步骤吸取试样溶液1.00mL置于10mL具塞比色管中，于37℃±0.2℃水浴中保温10min，加入在37℃±0.2℃水浴中预热的酪蛋白溶液5.00mL，摇匀，置37℃±0.2℃水浴中，反应10min，加入在37℃±0.2℃水浴中预热的三氯乙酸溶液5.00mL，摇匀，于37℃±0.2℃水浴中放置40min，用干燥滤纸过滤，取续滤液，在2h内，在波长为275nm处用蒸馏水作参比测出滤液的吸光度A1。
（可做两个平行，第一次测定两个平行值分别为0.389、0.399）空白试验：吸取试样溶液1.00mL置于10mL具塞比色管中，于37℃±0.2℃水浴中保温10min，加入在37℃±0.2℃水浴中预热的三氯乙酸溶液5.00mL，摇匀，反应10min，加入在37℃±0.2℃水浴中预热的酪蛋白溶液5.00mL，摇匀，于37℃±0.2℃水浴中放置40min，用干燥滤纸过滤，取续滤液，在2h内，在波长为275nm处用蒸馏水作参比测出滤液的吸光度A2。
（初次测定该值为0.292）酪氨酸标准溶液吸光度：用蒸馏水作参比，在波长275nm处测定50ug/mL酪氨酸标准溶液的吸光度A3。
（初次测定该值为0.346） 5.3.1.6 结果计算试样中酶活力X1（U/g）按式（1）计算：X1=式中：A1——试样溶液的吸光度 A2——空白试样的吸光度 A3——酪氨酸标准溶液的吸光度m1——对照品溶液每毫升中含酪氨酸的量，单位为微克（ug）， (1)即为50m2——试样的质量，单位为克（g） n——试样溶液的稀释倍数，即为25000 5.3.1.7 允许差二次平行测定结果的相对误差应不大于10%，取其算术平均值为测定结果。
5.3.2 水分的测定按GB/T 5009.3-2019的规定执行。
5.3.3 重金属按GB/T 5009.74-2019的规定执行。
5.3.4 铅按GB/T 5009.75-2019的规定执行。
5.3.5 总砷按GB/T 5009.76-2019的规定执行。
5.4 微生物指标 5.4.1 菌落总数按GB/T 4789.2-2019的规定执行。
5.4.2 大肠菌群按GB/T 4789.3-2019的规定执行。
5.4.3 沙门氏菌按GB/T 4789.4-2019的规定执行。
5.4.4 金黄色葡萄球菌按GB/T 4789.10-2019的规定执行。
5.4.5 致泻大肠埃希氏菌按GB/T 4789.6-2019的规定执行。
5.5 净含量按JJF 1070的规定执行。
6、 6.1 组批以相同的原材料，同一班次生产的产品为一批。
6.2 抽样6.2.1 感官、理化及微生物指标随机从每批5%以上的包装箱中抽取样品，每箱中抽取样品约10g左右，试样总量应不小于50g。
迅速混匀后分别装入两个清洁干燥的磨口玻璃瓶中，并在标签上注明生产厂名，产品名称，批号，数量及取样日期。
一瓶作检验用，一瓶留存备查。
微生物检验按无菌操作取样。
6.2.2 净含量按JJF 1070及国家质量监督检验检疫总局令（2019）第75号的规定进行。
6.3 出厂检验6.3.1 每批产品均应进行出厂检验。
6.3.2 出厂检验项目为：4.1，4.2中酶活力、水分，4.3中菌落总数、大肠菌群，净含量。
6.4 型式检验检验规则6.4.1 型式检验每半年进行一次，有下列情况之一时亦应进行型式检验：——产品试制、正式投产时——更换设备或长期停产再恢复生产时——出厂检验结果与上次型式检验结果有较大差异时——原料、工艺较大变化，可能影响产品质量时——卫生或质量监督机构提出要求时 6.4.2 型式检验项目为第4章全部要求。
6.5 判定规则6.5.1 质量指标合格的判断，采用GB/T 8170-2019中的“修约值比较法”。
6.5.2 微生物指标及净含量有一项不符合本标准规定，即判定产品为不合格，不复检。
其他指标若有一项以上（含一项）不符合本标准规定，应重新从该批产品中抽取两倍样品进行复检。
复检结果全部符合本标准要求时，产品判为合格。
如果复检结果仍有一项不符合本标准规定，则判定为产品不合格。
7 标志、包装、运输、贮存 7.1 标志小时包装的标签应符合GB 7718的规定。