木瓜汁中提取木瓜蛋白酶--实验设计
木瓜蛋白酶的纯化和鉴定方法研究
木瓜蛋白酶的纯化和鉴定方法研究木瓜蛋白酶（Papain）是一种广泛存在于木瓜中的天然酶，具有优异的蛋白水解能力和广泛的应用领域。
对于木瓜蛋白酶的纯化和鉴定方法的研究，可以为其在食品、药物和生物技术等领域的应用提供重要的理论和实践基础。
纯化木瓜蛋白酶的常用方法主要包括：硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析等。
首先，通过将木瓜果肉或木瓜乳剂进行初步的提取和分离，得到粗木瓜酶液或浓缩液。
接下来，通过酸性、碱性或酶处理等方法，将杂质蛋白质去除，然后经过一系列的层析纯化步骤，最终获得纯度较高的木瓜蛋白酶。
其中，离子交换层析是最常用的纯化方法之一。
离子交换层析是根据蛋白质与固定在固定相上带电的离子交换基团之间的相互作用进行纯化的。
通常使用阳离子交换剂如DEAE-Sepharose CL-6B或阴离子交换剂如CM-Sepharose CL-6B作为固定相，可实现木瓜蛋白酶与其他蛋白质之间的分离。
通过控制缓冲液的pH和离子强度，可以调节木瓜蛋白酶在层析柱上的吸附和洗脱，从而实现对其的纯化。
凝胶过滤层析是另一种常见的纯化方法，其基本原理是根据蛋白质分子大小的差异进行纯化。
凝胶过滤层析对分子量较大且较纯的蛋白质具有较好的分离效果。
在纯化木瓜蛋白酶时，可以选择适当的凝胶过滤层析介质，如Sephadex G-75或Sephadex G-100等，将混合溶液在凝胶柱上进行层析，分离出目标蛋白质。
除了纯化方法的研究外，正确鉴定木瓜蛋白酶的纯度和活性也是非常重要的。
鉴定木瓜蛋白酶的常用方法主要包括：SDS-PAGE电泳、活性测定和质谱鉴定等。
其中，SDS-PAGE电泳是一种常用的蛋白质分子量分析方法，它可将蛋白质按照分子量大小进行分离和定量。
通过在分离凝胶上染色或通过Western blotting方法检测，可以确定木瓜蛋白酶的纯度和分子量。
活性测定是评价木瓜蛋白酶酶活性的重要手段。
常用的活性测定方法包括卟啉-酪蛋白分光光度法、酪蛋白分解能力法等。
木瓜酶活性实验报告
一、摘要本实验旨在通过测定木瓜酶活性，探究温度、pH值、底物浓度等因素对木瓜酶活性的影响。
实验结果表明，木瓜酶活性受温度和pH值的影响较大，且在不同温度和pH值条件下，木瓜酶活性存在显著差异。
此外，底物浓度对木瓜酶活性也有一定影响。
本实验为木瓜酶的工业化应用提供了理论依据。
二、实验目的1. 了解木瓜酶活性的影响因素；2. 探究温度、pH值、底物浓度等因素对木瓜酶活性的影响；3. 为木瓜酶的工业化应用提供理论依据。
三、实验原理木瓜酶是一种蛋白酶，主要来源于木瓜果实。
在一定的温度和pH值条件下，木瓜酶能够催化蛋白质的分解反应。
本实验采用双缩脲法测定木瓜酶活性，通过测定酶催化蛋白质分解反应产生的产物量来反映酶活性。
四、实验材料1. 实验试剂：木瓜酶、双缩脲试剂、pH缓冲液、蛋白质底物（如酪蛋白）；2. 实验仪器：恒温培养箱、pH计、酶标仪、电子天平、移液器、试管等。
五、实验方法1. 木瓜酶活性的测定（1）制备木瓜酶溶液：将木瓜酶用pH缓冲液稀释至适当浓度；（2）制备蛋白质底物溶液：称取适量酪蛋白，用pH缓冲液溶解；（3）设定实验组：将木瓜酶溶液、蛋白质底物溶液和pH缓冲液按一定比例混合，分别设定不同温度（如30℃、40℃、50℃、60℃、70℃）和pH值（如3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）的实验组；（4）酶活性测定：将各实验组溶液置于恒温培养箱中反应一定时间（如30分钟），然后加入双缩脲试剂，用酶标仪测定吸光度值；（5）计算酶活性：根据吸光度值和标准曲线，计算各实验组的酶活性。
2. 影响因素探究（1）温度对木瓜酶活性的影响：分别测定不同温度下木瓜酶的活性，分析温度对木瓜酶活性的影响；（2）pH值对木瓜酶活性的影响：分别测定不同pH值下木瓜酶的活性，分析pH值对木瓜酶活性的影响；（3）底物浓度对木瓜酶活性的影响：在相同温度和pH值条件下，分别测定不同底物浓度下木瓜酶的活性，分析底物浓度对木瓜酶活性的影响。
木瓜蛋白酶实验指导
实验一木瓜蛋白酶的提取及其活性测定一、实验目的通过本实验，要求学习和掌握木瓜蛋白酶酶源的选取、木瓜乳汁的采集及蛋白酶粗酶制剂提取等的基本原理和方法；学习并掌握木瓜蛋白酶活性的测定方法以及酶样中蛋白质含量的测定。
二、实验原理木瓜蛋白酶大量存在于木瓜汁液中，是一种巯基蛋白酶，其分子量为23900。
木瓜蛋白酶最适pH随底物而异，当以酪蛋白为底物时，酶的最适pH为7。
据此原理，本实验以未成熟的木瓜果实为材料，从果皮中采集新鲜乳汁，利用木瓜蛋白酶在pH7.2的磷酸缓冲液、35℃条件下水解底物酪蛋白产生酪氨酸，酪氨酸在275nm处有最大吸收峰，根据吸光值的大小反映酪氨酸的浓度，进而反映木瓜蛋白酶催化水解的反应速率，以此衡量该酶的活性。
考马斯亮蓝G-250在酸性条件下能够与蛋白质结合，形成的络合物在595nm 处具有最大吸光值，且吸光值的大小与蛋白质的含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。
三、实验材料和用具1、实验材料：新鲜、未成熟的木瓜。
2、试剂：0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.2）；1%的酪蛋白溶液：称1g的酪蛋白用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.2）配至100mL；激活剂：用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.2）配制含半胱氨酸20mmol/L，EDTA 1mmol/L的混合液；10%三氯乙酸（TCA）：称10g的TCA定容至100 mL；考马斯亮蓝G-250：称0.1g考马斯亮蓝G-250溶于50mL90%乙醇溶液中，加入85%磷酸溶液100mL，用蒸馏水定容到1000mL。
3、仪器、用具：恒温水浴锅、电子天平、紫外-可见分光光度计、研钵、烧杯、量筒、试管、移液管、吸耳球、漏斗、滤纸、标签纸、试管架、牙签等。
四、实验步骤1．木瓜乳的采集选取挂果30天以上的木瓜果实，用湿棉布小心擦净表面，用牙签等利器，在果实的表面划若干条深约3mm的划痕，此时有大量白色乳汁流出，于木瓜底部用干净的烧杯收集乳汁，片刻后收集的乳汁便会凝固。
木瓜蛋白酶活性实验报告
一、实验目的1. 了解木瓜蛋白酶的性质和作用机理。
2. 探究不同条件对木瓜蛋白酶活性的影响。
3. 通过实验验证木瓜蛋白酶在食品加工中的应用潜力。
二、实验原理木瓜蛋白酶是一种含疏基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力。
木瓜蛋白酶的活性受pH、温度、离子强度等因素的影响。
本实验通过测定木瓜蛋白酶在不同pH、温度和离子强度下的活性，探讨其活性影响因素。
三、实验材料1. 木瓜蛋白酶样品2. 酚酞指示剂3. 酶反应缓冲液4. 硫酸铜溶液5. 碘液6. pH计7. 恒温水浴锅8. 移液器9. 试管四、实验方法1. pH对木瓜蛋白酶活性的影响（1）取5支试管，分别加入0.5ml酶反应缓冲液，编号为1、2、3、4、5。
（2）分别向5支试管中加入0.1ml木瓜蛋白酶样品，编号为1、2、3、4、5。
（3）分别向5支试管中加入0.5ml不同pH的酶反应缓冲液（pH 2、4、6、8、10）。
（4）将5支试管置于37℃恒温水浴锅中保温10分钟。
（5）向5支试管中加入0.5ml酪蛋白溶液，摇匀。
（6）观察并记录各试管溶液的颜色变化。
2. 温度对木瓜蛋白酶活性的影响（1）取5支试管，分别加入0.5ml酶反应缓冲液，编号为1、2、3、4、5。
（2）分别向5支试管中加入0.1ml木瓜蛋白酶样品，编号为1、2、3、4、5。
（3）分别将5支试管置于0℃、20℃、37℃、50℃、70℃恒温水浴锅中保温10分钟。
（4）向5支试管中加入0.5ml酪蛋白溶液，摇匀。
（5）观察并记录各试管溶液的颜色变化。
3. 离子强度对木瓜蛋白酶活性的影响（1）取5支试管，分别加入0.5ml酶反应缓冲液，编号为1、2、3、4、5。
（2）分别向5支试管中加入0.1ml木瓜蛋白酶样品，编号为1、2、3、4、5。
（3）分别向5支试管中加入不同离子强度的硫酸铜溶液（0.01mol/L、0.05mol/L、0.1mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L）。
木瓜蛋白酶提取
0.615
500
15.35 7675.0 27.50
211.1
硫酸铵一次纯 化上清
+
乙 4'
0.292 500
7.09 3545.0 10.00
35.5
硫酸铵二次纯 化沉淀
醇 9'
0.228 500
5.46 2730.0 10.00 27.3 乙醇沉淀
编号
稀释倍 待测管吸
数
光度
1
10000. 0
1.348
18.28 9140.0 12.50
4.06 2030.0 10.00
络氨酸标 准液
酶活(u)
蛋白质 （酶） 含量(mg)
68911.9 169.1
95.6 114.3 20.3
乙醇沉淀
硫酸铵一次 纯化上清
硫酸铵二次 纯化沉淀
酶比活 (u/mg)
乙醇+硫酸铵
410.0
粗提
5’ 5000 0.284 0.201
35.5
1090.0
硫酸铵二次 纯化沉淀
9’ 5560.0 0.479 0.308
62,850. 1 27.3 2300.0 乙醇沉淀
9’’ 5560.0 0.433 0.314
70,314.0 27.3 2570.0 透析
乙 编号 醇1
吸光度值
稀释倍数
标准曲线查 得值浓度 （ug/ml)
测得蛋白质 浓度(ug/ml)
在 275nm 处侧吸 光值
吸光 度 A
A0
取酪氨酸溶液，以蒸馏水为空白，测定吸光度
An
硫 编号 酸1 铵2
吸光度值
0.676
稀释倍数
标准曲线查 得值浓度 （ug/ml)
木瓜蛋白酶的提取与分离纯化的方法
木瓜蛋白酶的提取与分离纯化的方法木瓜蛋白酶（papain）是一种天然的蛋白酶，广泛应用于食品、制药等行业中。
其提取与分离纯化的方法可以分为以下几个步骤：1.选择合适的木瓜品种：不同品种的木瓜蛋白酶活性不同，因此选择具有较高酶活性的木瓜品种对提取纯化效果至关重要。
2.酶源准备：将选好的木瓜切成小块，去掉果肉，保留果实中的细胞浆和硬实质。
然后将木瓜块浸泡于缓冲液中，以提取木瓜蛋白酶。
3.离心分离：将浸泡木瓜块的混合液进行离心分离，以去除果肉等杂质，得到较为纯净的木瓜蛋白酶液。
4.澄清液处理：将离心分离得到的液体通过滤纸或滤膜进行澄清，去除悬浮的固体颗粒。
5.蛋白酶的分离：通过离心、超滤、透析等手段，将木瓜蛋白酶与其他蛋白质分离，得到较为纯净的蛋白酶液。
6.结晶纯化：可以采用醇沉淀、浓缩、结晶等方法对蛋白酶进行纯化。
其中，醇沉淀方法是常用的分离纯化方法之一，通过醇的添加，使蛋白酶蛋白质聚集并沉淀下来，然后进行洗涤、溶解等操作，最终得到纯净的木瓜蛋白酶。
7.洗脱：将获得的木瓜蛋白酶溶解于缓冲液中，使其达到所需的适宜酶活性和稳定性。
8.酶活性测定：用适当的方法测定提取分离纯化后的木瓜蛋白酶的活性，以确定其纯化程度和活性。
需要注意的是，木瓜蛋白酶的提取与分离纯化过程中，应注意保持温度、pH值等参数的控制，以防止酶的失活或蛋白质的降解。
同时，在纯化过程中需要使用无菌操作，以防止细菌、病毒等污染物的引入。
总结起来，木瓜蛋白酶的提取与分离纯化的方法包括酶源准备、离心分离、澄清液处理、蛋白酶的分离、结晶纯化、洗脱和酶活性测定等步骤。
通过合理的步骤设置和操作，可以得到较为纯净、高活性的木瓜蛋白酶，以满足工业和科研的需求。
高质量木瓜蛋白酶纯化工艺研制探讨_任国梅
结果证明, 在木瓜乳汁中, 加偏重亚硫酸钠 后, 放置- 20℃, 在一年内, 其提取出来的木 瓜蛋白酶活性仍达 130×104u/ g ±6×104u/ g, 而在木瓜乳汁中, 加硫代硫酸钠作抗氧化 剂, 在- 20℃放置半年后, 其提取 的木瓜蛋 白酶活性开始下降, 均达不到 130×104u/ g ±6×104u/ g , 若 木瓜乳汁不加任何抗 氧化 剂, 在- 20℃放置二个月后, 其提 取出来的 木 瓜蛋 白 酶活 性, 只 达 60 × 104u/ g ± 5 × 104u/ g , 随着保存时间的 增长, 活性逐 渐下 降。故此认为, 在提纯木瓜蛋白酶中, 偏重亚 硫酸钠是一种较理想的抗氧化剂, 对保存酶 活性十分有效。
木瓜蛋白酶( papain) 是从亚热带植物番 木瓜( carica p ap aya) 果实的新鲜乳汁中提取 出来的一种蛋白水解酶, 它是由 212 个氨基 酸组成的蛋白质单链, 此酶作用温和, 特异 性强。在医药工业、食品、美容、制革等方面
得到广泛应用, 特别目前在医学研究上应用 越来越被人重视[ 1～3] 。
Enzyme activ ity ( u/ g )
A
130× 104±6×104
B
9 6×1 04 ±6 ×10 4
C
8 0×1 04 ±5 ×10 4
D
6 4×1 04 ±5 ×10 4
Salting -out methods
3 讨论
( 1) 在用盐析法提取木瓜蛋白酶试验 中, 木瓜蛋白 酶的活 性都是 在 40× 104u/ g 以下, 与药用要求相差较远。这种方法由于 用了大量盐, 使酶中灰份增加。并因大量盐 存在, 降低每克木瓜蛋白酶活性。曾试以用 水透析除去盐, 由于透析延长了提取木瓜蛋 白酶时间, 即使盐份除去, 但酶活性却下降, 并没有起到提高木瓜蛋白酶活性作用。所 以, 上述的盐析法, 并不是理想的木瓜酶提
木瓜蛋白酶提取实验方案
实验设计题目：木瓜蛋白酶的提取,纯化分离及其生物学研究一、实验原理：木瓜蛋白酶（papain）又称木瓜酶，广泛存在于番木瓜的根、茎、叶和果实，未成熟果实的乳汁中含量最丰富。
是一种含疏基（-SH）肽链的内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力；同时还具有合成的功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。
工业用的木瓜蛋白酶一般都是未经纯化的多酶体系。
现已知经木瓜乳汁干燥而得的木瓜蛋白酶至少含有四种主要酶类：木瓜蛋白酶（papain）、木瓜凝乳蛋白酶（chymopapain）、木瓜蛋白酶Ω（papaya proteinaseΩ）、木瓜凝乳蛋白酶M（chymopapain M），其中木瓜凝乳蛋白酶的含量最多，占可溶性蛋白的45%。
木瓜蛋白酶易溶于水和甘油，水溶液为无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于有机溶剂。
它的最适pH值为5.7（一般3～9.5皆可），在中性或偏酸性时亦有作用；最适温度为55～60℃（一般10～85℃皆可），耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。
本实验主要采取有机溶剂沉淀法结合硫酸铵分级沉淀法来提取番木瓜中的木瓜蛋白酶。
有机溶剂沉淀法：有机溶剂能降低溶液的电解常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导溶解度的降低，另外，有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法。
有机溶剂分段沉淀法它常用于蛋白质或酶的提纯。
使用的有机溶剂多为乙醇和丙酮。
高浓度有机溶剂易引起蛋白质变性失活，操作必须在低温下进行，并在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以避免局部浓度过大。
硫酸铵分级沉淀法：硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。
高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。
各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。
木瓜蛋白酶的提取
木瓜蛋白酶的提取和纯化前言：木瓜蛋白酶(Papain) , 又称木瓜酶，广泛存在于番木瓜茎叶和果实中,以未成熟果实的乳汁中为最高。
它既有很强的蛋白水解催化活性又含凝乳和溶菌活性,还具脂解能力及蛋白合成功能, 主要是催化蛋白质水解, 也能分解小肽。
它的切割分解点很多, 大致优先分解精氨酶, 苯丙氨酸的肽键。
又因其含量高、稳定性好、能有效地分解明胶、酪蛋白、谷蛋白、弹性蛋白、球蛋白和肌纤维蛋白等常用蛋白质，被广泛应用于肉类嫩化、啤酒澄清、明胶制造、蚕茧脱胶、皮革脱毛等工业，另外还在医学方面主要用于治疗消化不良、各种炎症和水肿，防止腹膜粘连，处理血检及创伤脱痂；此外，它还可以用于研究蛋白质结构等等。
在番木瓜的茎、叶中含有木瓜蛋白酶,但在实际生产中,主要是从未成熟的生番木瓜果实中收集果皮创口流出的白色浆液,经过加工提纯后得到。
木瓜蛋白酶的生产以番木瓜未成熟果实的新鲜乳汁为原料，但因番木瓜种植区主要分布在经济不发达地区，所以蛋白酶生产工艺相对落后，很多地区仍采用太阳暴晒的方式生产木瓜蛋白酶。
另外，对于木瓜蛋白酶的商业化生产来说，不同用途的酶所要求的纯度存在相当大的差异……近年来，木瓜蛋白酶在工业上的应用日趋广泛，对其纯度要求也更高，因此，有必要对提取纯化工艺开展深入的研究。
下面主要介绍一种简单的提取纯化途径。
提取与纯化途径：1.主要流程：番木瓜 (采集浆液)→浆液(过滤)→滤液(单宁法去杂质干燥)→粗酶制品(加半胱氨酸混合研磨)→研磨混合液(调PH后过滤)→滤液(硫酸铵和氯化钠两次盐析) →盐析物(低温半胱氨酸溶液中结晶)→结晶体(重结晶) →精酶2.具体操作：（1）番木瓜浆液的采集：番木瓜果实的浆液中富含木瓜蛋白酶,但是在果实完全成熟时,白色浆液就会逐渐减少。
因此,采集浆液时应选择绿色的未成熟果。
其采浆方法是：用薄不锈钢刀片沿番木瓜果实的纵线将果皮割破,深度为2-3mm，根据果实大小，每个果实可以割5-10条刀口。
木瓜蛋白酶的提取
木瓜蛋白酶的提取一、实验内容与目的从青木瓜中提取木瓜蛋白酶，用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度。
通过本实验，掌握天然活性化合物的提取和蛋白质浓度的测定技术。
二、实验原理（一）木瓜天然酶木瓜蛋白酶（papain），简称木瓜酶，又称为木瓜酵素。
他是一种含硫基（—SH）肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，它还具有合成功能，能把蛋白质水解物合称为蛋白质。
木瓜蛋白酶溶于水和甘油，水溶液无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇。
氯仿和乙醚等有机溶剂。
其最适pH为5.7（一般3~9.5皆可），在中性或偏酸性时亦有作用，等电点18.75；最适温度为55~60℃（一般10~85℃皆可），耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，受还原性物质激活。
木瓜蛋白酶广泛存在于番木瓜（Carica papaya）茎叶和果实中，以未成熟果实的乳汁中为最高。
提取未成熟的番木瓜果实中的乳汁，采用现代生物工程技术提炼可得纯天然生物酶制品。
（二）考马斯亮蓝结合法（Bradford法）测定蛋白质浓度的原理在一定范围内，考马斯亮蓝G250蛋白复合物呈色后，在595nm下，吸光度与蛋白质含量关系呈线性关系，故可以用蛋白质浓度的测定。
三、实验材料1.材料青木瓜2.试剂氢氧化钠、磷酸、考马斯亮蓝G250、牛血清蛋白、95%乙醇3.主要仪器设备离心机、磁力搅拌器、刀片、电子天平、紫外可见分光光度计、冰箱、pH计。
四、实验步骤（一）木瓜蛋白酶的提取（1）用薄不锈钢刀片沿未成熟的番木瓜过时的纵线将果皮割破，深度为2~3nm，根据果实大小的不同，每个果实可以切5~10条刀口。
（2）将木瓜放于一个大烧杯中，适度挤压木瓜，使木瓜乳汁流入大烧杯中。
（3）将手机的乳液按1:1量加入蒸馏水，搅拌1h，用NaOH将pH调至9.0。
（4）将乳液用离心机在3500r/min的条件下，离心15min。
木瓜蛋白酶提取实验方案课件资料
实验设计题目：木瓜蛋白酶的提取,纯化分离及其生物学研究一、实验原理：木瓜蛋白酶（papain）又称木瓜酶，广泛存在于番木瓜的根、茎、叶和果实，未成熟果实的乳汁中含量最丰富。
是一种含疏基（-SH）肽链的内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力；同时还具有合成的功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。
工业用的木瓜蛋白酶一般都是未经纯化的多酶体系。
现已知经木瓜乳汁干燥而得的木瓜蛋白酶至少含有四种主要酶类：木瓜蛋白酶（papain）、木瓜凝乳蛋白酶（chymopapain）、木瓜蛋白酶Ω（papaya proteinaseΩ）、木瓜凝乳蛋白酶M（chymopapain M），其中木瓜凝乳蛋白酶的含量最多，占可溶性蛋白的45%。
木瓜蛋白酶易溶于水和甘油，水溶液为无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于有机溶剂。
它的最适pH值为5.7（一般3～9.5皆可），在中性或偏酸性时亦有作用；最适温度为55～60℃（一般10～85℃皆可），耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。
本实验主要采取有机溶剂沉淀法结合硫酸铵分级沉淀法来提取番木瓜中的木瓜蛋白酶。
有机溶剂沉淀法：有机溶剂能降低溶液的电解常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导溶解度的降低，另外，有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法。
有机溶剂分段沉淀法它常用于蛋白质或酶的提纯。
使用的有机溶剂多为乙醇和丙酮。
高浓度有机溶剂易引起蛋白质变性失活，操作必须在低温下进行，并在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以避免局部浓度过大。
硫酸铵分级沉淀法：硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。
高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。
各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。
木瓜蛋白酶的提取纯化实验报告
木瓜蛋白酶的提取纯化实验报告实验报告：木瓜蛋白酶的提取纯化摘要：本实验旨在提取和纯化木瓜蛋白酶。
首先将木瓜果肉和磷酸盐缓冲液混合，经过搅拌、离心和滤过将悬浮液收集。
然后使用硫酸铵沉淀法对混合液进行蛋白质沉淀，再经过柱层析纯化得到木瓜蛋白酶。
通过测定酶活，纯化程度和回收率，验证提取和纯化方法的有效性。
结果表明，经过提取纯化的木瓜蛋白酶具有较高的纯化程度和酶活，回收率较高。
1.引言木瓜蛋白酶是一种广泛存在于木瓜中的蛋白酶，具有广谱的活性，可以降解多种蛋白质。
因此，木瓜蛋白酶在食品、制药等工业中具有广泛的应用价值。
本实验旨在研究提取和纯化木瓜蛋白酶的方法，为其进一步应用奠定基础。
2.材料与方法2.1材料：-木瓜果肉-磷酸盐缓冲液-硫酸铵-超滤膜-柱层析填料2.2方法：1)将木瓜果肉剁碎后加入磷酸盐缓冲液中，搅拌均匀。
2)将混合液经过离心，收集上清液。
3)对上清液进行反复滤过，去除颗粒杂质。
4)将上清液与硫酸铵混合，使其浓度达到80%，沉淀蛋白质。
5)使用超滤膜对上清液进行浓缩，得到蛋白质浓缩液。
6)将蛋白质浓缩液加入柱层析柱，经过洗脱得到纯化酶溶液。
7)对纯化后的酶溶液进行酶活测定、纯化程度测定和回收率计算。
3.结果与讨论经过提取纯化，得到的木瓜蛋白酶具有较高的酶活。
酶活测定结果显示，提取纯化后的酶活达到了5000单位/毫升。
与未经提取纯化的酶溶液相比，酶活提高了约2倍，表明提取纯化方法可以有效提高木瓜蛋白酶的酶活。
纯化程度测定结果显示，经过柱层析纯化后，木瓜蛋白酶的纯化程度较高。
使用SDS-方法对柱层析纯化前后的样品进行分析发现，纯化后的酶样品中只存在单一的酶带，而纯化前的样品中存在多个酶带，进一步说明了提取纯化方法的有效性。
回收率计算结果显示，经过提取纯化后，木瓜蛋白酶的回收率较高。
计算结果表明，提取纯化后酶的回收率在80%以上，较未经处理的酶溶液回收率有明显提高。
综上所述，本实验通过提取和纯化方法成功得到了酶活高、纯化程度较高且回收率较高的木瓜蛋白酶样品。
亲和双水相萃取番木瓜中木瓜蛋白酶的研究的开题报告
亲和双水相萃取番木瓜中木瓜蛋白酶的研究的开题报告开题报告课题名称：亲和双水相萃取番木瓜中木瓜蛋白酶的研究一、研究背景及意义木瓜蛋白酶（Papain）是一种由番木瓜果实中提取得到的酶，具有广泛的应用价值。
它可以用于制药、食品加工等领域，如消化剂、蛋白酶酪蛋白胶的制备、软化面团等。
传统的木瓜蛋白酶提取方法需要使用大量有机溶剂，不仅成本高但也对环境带来负面影响。
因此，研究一种简单、高效、环保的木瓜蛋白酶提取方法，对于促进工业化生产具有重要意义。
二、研究内容及方法本研究将采用亲和双水相萃取方法，通过选择合适的双水相体系，利用亲和剂与木瓜蛋白酶的亲和性，实现对木瓜蛋白酶的纯化与提取。
具体步骤为：1. 研究不同条件下合适的双水相体系的构筑。
2. 优化可用于亲和双水相萃取的亲和剂种类、浓度等参数。
3. 纯化提取番木瓜中的木瓜蛋白酶，通过SDS-PAGE等方法鉴定提取效果。
三、预期研究成果1. 确定一种简单、高效、环保的木瓜蛋白酶提取方法。
2. 确定亲和双水相萃取中适合的双水相体系和亲和剂体系。
3. 成功纯化提取木瓜蛋白酶，提高提取效率。
四、研究工作计划及进度安排1、前期准备（2个月）对亲和双水相萃取的相关文献进行了解和综合分析；收集番木瓜，制备番木瓜的提取液；建立木瓜蛋白酶含量的测定方法，为后续的木瓜蛋白酶提取过程提供数据支持。
2、体系构筑与优化（6个月）系统地研究亲和双水相萃取中不同体系构筑和亲和剂浓度、种类等因素对提取效果的影响，确立最优条件。
3、纯化提取和鉴定（6个月）在优化的条件下进行木瓜蛋白酶的纯化提取，采用SDS-PAGE鉴定提取效果，并对纯化的木瓜蛋白酶的理化性质进行分析。
4、论文撰写（4个月）对本论文的工作进行总结和总结，撰写论文，进行答辩。
五、参考文献1. 张乃霞, 周大庆,李哲宏,等. 酵素法提取木瓜蛋白酶效率比较. 食品科技, 2003, 28(7): 155-157.2. 周望芳, 于皓, 杨键锋,等. 亲和萃取法纯化木瓜蛋白酶. 中草药, 2018, 49(24): 5977-5982.3. 胡寅, 张慧玲, 王浩,等. 木瓜酶提取工艺的研究. 食品科技, 2010, 35(6): 201-205.。
木瓜蛋白酶的提取
木瓜蛋白酶的提取、分离纯化及其生物学研究综述及实验方法13生物技术第二大组第二小组组员：王玓玥（组长）、王子贺、王思瑶、王宇涛、王守鑫、谭国栋一、研究背景：在经济飞速发展的今天，人们的生活水平已远远不只在于吃饱穿暖，食品的安全和营养问题受到人们越来越多的关注，绿色健康的生活也成为大家共同的追求，木瓜蛋白酶以它自身耐热及特殊结构等特点被广泛的用于食品行业，如何分离纯化得到高纯度低成本的木瓜蛋白酶则是人们现在研究的重点，本小组便也以此为研究主题展开实验。
二、木瓜蛋白酶基本介绍：木瓜蛋白酶，又称木瓜酶，是一种蛋白水解酶。
木瓜蛋白酶是番木瓜中含有的一种低特异性蛋白水解酶，广泛地存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。
木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸，属于巯基蛋白酶，它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特点，这种蛋白水解酶，分子量为23406，由一种单肽链组成，含有212个氨基酸残基。
至少有三个氨基酸残基存在于酶的活性中心部位，他们分别是Cys25、His159和Asp158，当Cys25被氧化剂氧化或与金属离子结合时，酶的活力被抑制，而还原剂半胱氨酸（或亚硫酸盐）或EDTA能恢复酶的活力木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。
它的外观为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性；木瓜蛋白酶溶于水和甘油，水溶液为无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。
木瓜蛋白酶是一种含巯基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，但几乎不能分解蛋白胨。
木瓜蛋白酶的最适合PH值6～7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点（pI）为8.75；木瓜蛋白酶的最适合温度55～65℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。
另外六个半胱氨酸残基形成了三对二硫键,且都不在活性部位。
使木瓜蛋白酶的方法
使木瓜蛋白酶的方法
木瓜蛋白酶存在于木瓜的乳胶中，是一种天然的蛋白酶。
以下是一些常见的使木瓜蛋白酶的方法：
1. 传统提取法：将木瓜果实切开，收集乳胶，然后通过沉淀、过滤、离心等步骤提取木瓜蛋白酶。
这种方法简单易行，但提取效率较低。
2. 发酵法：将木瓜乳胶与微生物一起培养，利用微生物产生的酶来分解乳胶中的蛋白质，从而提取木瓜蛋白酶。
这种方法提取效率较高，但需要一定的发酵设备和技术。
3. 化学法：利用化学试剂处理木瓜乳胶，使其中的蛋白质变性，从而提取木瓜蛋白酶。
这种方法提取效率高，但可能会对酶的活性产生一定的影响。
4. 基因工程法：利用基因工程技术，将木瓜蛋白酶基因导入到其他生物体中，使其表达和分泌木瓜蛋白酶。
这种方法可以大规模生产木瓜蛋白酶，但需要一定的基因工程技术和设备。
需要注意的是，木瓜蛋白酶是一种蛋白酶，具有一定的生物活性和催化作用。
在使用木瓜蛋白酶时，需要根据具体的应用场景和需求选择合适的提取方法和使用条件，以确保其活性和效果。
同时，需要注意木瓜蛋白酶的安全性和稳定性，避免对人体和环境造成危害。
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木瓜汁中提取木瓜蛋白酶
一、粗酶制备（冻存、调整浓度）
1.蛋白质浓度（考xx蓝法）
二、纯化和固定化
1.双水相（PEG/磷酸盐）萃取，再过阳离子纯化；
2.粗酶直接亲和磁珠纯化和固定化（咪唑梯度洗，电泳看效果）；
3.先双水相，取PEG相（上清）用亲和磁珠纯化和固定化；
三、纯度
1.快速蛋白质液相色谱；
2.非变性碱性蛋白质电泳；
四、酶活性
1.水解酪蛋白活性（固定化率和活力回收率、固定化酶的温度、pH等、重复使用）；
2.水解IgG检测特异性；
五、载体/相表征
亲和磁珠：TEM、粒径、电势、磁滞回线、红外；
双水相：
一、xx木瓜制备粗酶[1,2]
1.新鲜的木瓜用去离子水洗干净，再用不锈钢刀在果实上做了4到6个纵向2-3mm深的切口，让分泌出的乳胶顺着果实向下滴入冰浴的烧杯中。
-20 ℃存放。
（或者10mL汁液加90mL pH 6.0的PBS，搅拌15min，4℃9000×g离心取上清（除去不溶物），最后测定并调整上清中的蛋白质的浓度。
）
2.将解冻后的乳胶与40mM半胱氨酸按3:1(w/v)的比例混合，用6MHCl将悬浮液调整为pH 5.6，在4 ℃搅拌15 min，过滤并用6 M NaOH将滤液pH调整为9.0，4 ℃ 9000×g离心取上清（除去不溶物），最后测定上清中的蛋白质含量，然后用水/PBS调节。
可省略。
3.
[1]NitsawangS,Hatti-
KaulR,KanasawudP.PurificationofpapainfromCaricapapayalatex:Aqueoustwo-phaseextractionversustwo-stepsaltprecipitation[J].Enzyme & Microbial Technology, 2006, 39(5):1103-1107.
[2] Rocha M V, Giacomo M D, Beltramino S, et al. A sustainable affinity partitioningprocess to recover papain from Carica papaya, latex using alginate as macro-ligand[J].Separation & Purification Technology, 2016, 168:168-176.。