生物指示物选择、应用与缩短培养时间的验证

环氧乙烷灭菌生物指示物选择、应用与

缩短培养时间（RIT）的验证

生物指示物是指一类特定的微生物和载体结合，经过特定方法制备的生物制品，这些特定微生物比普通微生物对相应的灭菌模式具有更强的耐受性，用于指示微生物的死亡情况，以反映灭菌效果。

由于生物指示物可以真实可靠的反映灭菌过程中有关时间、温度和湿度等多个因素的关系，因此广泛应用于环氧乙烷等灭菌工艺的验证与日常监控。验证时应确认所选择的生物指示物的抗力的适宜性，否则将影响灭菌验证的效果与可靠性。生物指示物的原理是通过检测其中的细菌芽孢是否存活来判断产品是否达到完全灭菌的效果。

产品上的微生物无法经过肉眼观察，而且无法通过灭菌后的抽样检测来确定该批次产品是否合格，是一个特殊过程。我们只能通过

生物指示物中的细菌芽孢模拟产品上带菌的最

坏的情况。生物指示物中的细菌芽孢也是微生物

的一种，而且所有对灭菌效果有影响的因素都对

其有作用。同时，由于采用环氧乙烷等最终灭菌

的产品，其生产过程中初始污染菌的数量是受控

的，其数量远远低于生物指示物所含的菌体数量。

BI中选择的菌株比生产过程中自然环境下所发现的菌株是更难杀灭的菌株，具有更高的抗力。如果生物指示物中的细菌芽孢全部被杀死，就等同于产品中的微生物全部被杀死。故此，在环氧乙烷灭菌工艺里面，要确认灭菌是否合格，必须使用生物指示物，没有可以替代的手段或方法。

但是应当注意，生物指示物并不是用来指示与证实灭菌后的物品确实无菌。也就是说即使生物指示物培养无菌生长，并不能证实或保证灭菌物品100%无菌。生物指示物只是用来测试某一个已确认的灭菌过程和采用的的灭菌设备的有效性，这种测试的实施原理是：按照无菌保证水平对微生物致死性进行评估，以确定灭菌物品中微生物存活的概率足够低。

1生物指示物（Biological Indicators,BI)

生物指示物是一类特定微生物经过确定制备方法制造的生物试剂。生物指示物对于某种灭菌工艺具有特定的耐受性（USPS1035《Biological indicators for Sterilization》）。所选用的菌株变异性小，各项生物学特征均一性好的菌种；具备相应灭菌过程的抗力，且比现有生产过程中自然环境下所发现的菌株更难杀灭的菌株来作为生物指示物。

*注：详细生物指示物信息参考:GB18281.1-2015/ISO11138-1:2017;GB 18281.2-2015/ISO11138-2:2017)

注意：两个术语的区别“指示物（indicator）”和“指示剂（indicator agent; indicator reagent)”。指示物是指示剂与其衬底以最终应用形式的组合，就是最终使用的含有指示剂的产品。指示剂是指活性物质或活性物质的组合。（GB18282.1-2015，定义3.5与定义3.6；详见附录E），目前一般把两者混用，多指生物指示物。

1--指示剂；2----衬底

2生物指示物种类

常用的生物指示物可分为菌片类、自含式生物指示物、菌悬液三大类：

自含式BI菌片菌悬液

菌片一般是枯草杆菌黑色变种芽孢附着在试纸上面的一种指示剂，把菌片放置于灭

菌柜内最难灭菌的部位（温度最低点），灭菌完成后，经过7天37℃培养基培养，观察有无细菌生长来确定灭菌是否合格。

自含式指示剂一般是一个小塑料瓶子，里面包含菌片和培养基。灭菌以后，只要把瓶子里面的含培养基的玻璃夹破，使之与菌片混合，在37温度下培养48小时（注：实际操作按BI说明书要求进行），观察培养基是否有菌生长就可以确定灭菌是否合格。

菌悬液（Suspension)包含活的试验微生物的液体。注：装在密封好的安瓿内的菌悬液可以做为一种生物指示物使用。菌悬液是染菌载体或者生物指示物的中间体。

3生物指示物原理

灭菌要求无菌保证水平SAL要求达到10-6，即微生物生存概率低于100万分之一。因此，要求生物指示物的细菌芽孢含量应≥106。同时，为了模拟产品中生物负载最严重（极限条件）的情况，生物指示物的细菌芽孢选用最耐环氧乙烷杀灭的细菌芽孢--枯草杆菌黑色变种芽孢。

只要生物指示物中的细菌芽孢被全部杀死，那么认为该批产品的灭菌效果就是合格的。

4如何选择生物指示物

4.1菌片类生物指示物与自含式生物指示物比较

菌片类生物指示物采购成本相对较低，但由于其使用后期检验成本较高，需要专业检验人员等，使得自含式生物指示物得到广泛应用，以下为两者的比较：

表-1菌片类生物指示物与自含式生物指示物比较

4.2选择生物指示物要求

生物指示物的性能会受到使用前的贮存环境、使用方法或暴露于灭菌工艺所采用技术的影响，因此，应遵守制造商的建议进行贮存和使用，而且应当在暴露于灭菌工艺之后，尽快地把生物指示物转至规定条件下培养。生物指示物超过了规定的有效期不应再使用。

生物指示物选用要求：

1）制造商应有产品注册证、生产许可证与卫生许可证；

2）产品应符合ISO11138-1:2017与ISO11138-2:2017标准；制造商应提供相应生物指示物的技术资料或说明书。

3）产品应有合格报告，说明其生物指示物符合商定的规格；

4）如有必要，可要求制造商提供每批生物指示物所进行的各阶段的检测资料，以验证性能特征是否符合商定的规格。

*注意：应使用同一生产厂家的同一批号产品，做灭菌验证。

应根据ISO11138-2:2017检验含菌量，并符合标准要求。通过活菌计数，进行该数目的追溯性测定。假若所获得的数目是在制造商规定的额定总数-50%和+300%范围之内，或处于制造商规定总数的最小值与最大值中间，应判为合格。

为保证生物指示物具有最低限值的抗力，在标准中对生物指示物和染菌载体上的微生物最低限值数量提出了要求（≥106CFU)，由于测试方法步骤的变动会影响获得的数据，故测试时微生物的数量应在标签上标明的数量的-50%~300%之间。

*注：一般而言，同一个制造商不同批次的BI进货时均应进行菌种回收确认（含菌量检验)，对于同一个批次，不同进货时间的BI可以只做一次。

4.3生物指示物的使用

采用生物指示物(BI)，应在灭菌过程结束后将BI从灭菌产品上取下，并尽快培养。同时可评估如果延迟复苏（培养）时，残留的EO对BI的影响。可能存在这样的问题，灭菌过程没有完全对BI或产品的进行灭菌，但由于延迟培养，导致残留EO继续起作用，从而隐藏了灭菌失败的问题。

生物指示物应放于产品中最难灭菌的位置。如果产品设计不能将生物指示物放于其最难灭菌的地方，应采用能提供已知数量的活芽孢给产品染菌。芽孢悬液应符合