同源克隆结合RACE技术扩增基因全长共31页

RACE技术原理

快速扩增cDNA末端 ——RACE

RACE的基本概念不同厂家RACE试剂盒的介绍 RACE技术的关键环节
存在的问题及解决办法
RACE的基本概念

cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术是基于PCR技术由已知的部分
cDNA序列来获得完整cDNA序列的一种方法，
在PCR反应中有足够的全长产物能被探测。

TdT加尾反应及其替代反应
第三，若目的cDNA中含有与多聚尾互补的几个核苷酸同聚区，则在合成第二条cDNA链时引物的延伸会从内部序列而不是末端序列开始，产生非全长的第二条cDNA链。

我们所使用Invitron公司的RACE试剂盒，采用PCR介导的
连接反应，在一定程度上避免了以上的问题。

RACE试剂盒中末端转移的是多聚C尾，这样在反转录合成第一链时5’端多聚G的二级结构影响反转录的彻底进行，
会产生提前终止反应。我们改进了加尾的程序，用TdT酶加上多聚T尾，结果降低了反转录的难度，两个基因最终均获得了完整的5’末端。

RACE引物的设计
在实验过程中总结如下经验：
1.
2.
引物不能设计在保守区简并引物区。
2.
反转录提前终止
模板中有特殊的二级结构，反转录提前终止。通过提高反转录的温度，加大反转录的反应体系以及反转录过程中一直保持已变性的RNA模板处于50℃以上，避免以解
开二级结构的RNA再恢复原来的结构，以达到5’末端。
提供一种改进的反转录方法
1. 2.
3. 4.
5. 6.
7.
在RNase-free的0.2 mL Eppendorf 管中加入以下成分： Oligo(dT)(0.5μg) 1μL Total RNA(4~5μg) 3μL DEPC-H2O To 25 μL 混匀，70℃保温10min；50℃保温5min；稍微离心一下。在混合物中，依次加入以下成份： 10X SSⅡ（ SSⅢ ）Buffer 5.0μL 10mM dNTP mix 1.0μL 0.1M DTT 2.0μL RNase Inhibitor(40U/μL) 1.0μL DEPC-H2O To 24 μL 轻轻混合，在50℃保温5min后，在50℃下将3号管中的混合成分移入 2号管中。每个反应加入1μL SuperScriptTM Ⅱ（SSⅢ ），轻轻混匀，50℃反应 50min。 70℃放置15min以终止反应。 -20℃保存。

RACE技术及其在植物基因研究中的应用

这些方法在编辑基因方面具有高准确性和高效率，可以实现对基因组的精细操作。然而，基因编辑技术也存在一定的局限性，如潜在的脱靶效应、伦理问题和技术成本高等。
二、药用植物中的应用
基因编辑技术在药用植物领域的应用主要涉及中药材、西药和保健品等方面。
1、中药材
中药材是中医临床用药的主要来源，但其品质和产量的不稳定一直是制约中医临床疗效的瓶颈。基因编辑技术可以通过精准改良中药材的基因组，提高药材的疗效和产量。例如，利用CRISPR-Cas9技术对人参基因组进行编辑，成功实现了提高人参皂苷含量的目标。
RACE技术在植物基因研究中的应用
1、基因功能分析
RACE技术可以帮助研究人员克隆植物基因，并通过同源重组、转基因等方法研究基因的功能。例如，通过克隆植物抗病基因，利用RACE技术可以确定该基因的全序列，进而研究其作用机制和抗病机理。
2、基因表达研究
RACE技术可以用于研究植物在不同生长发育阶段或不同环境条件下的基因表达模式。研究人员可以通过比较不同样本中基因的表达水平，了解该基因在植物生长和发育过程中的作用。
RACE技术及其在植物基因研究中的应用0Fra bibliotek 引言目录
02 RACE技术概述
03 RACE技术在植物基因研究中的应用
04 RACE技术的实验案例
05 结论
06 参考内容
引言
随着生物技术的不断发展，研究人员越来越多的使用各种新技术来研究植物基因的特性和功能。其中，RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）技术是一种广泛使用的基因克隆和表达分析方法。本次演示将介绍RACE技术的原理、流程及其实验步骤，并探讨该技术在植物基因研究中的应用及优势和不足。

cDNA全场扩增

两家都有生产。ຫໍສະໝຸດ 5’RACE的扩增5’RACE
切胶回收
414bp
克隆转化
挑取单菌落
公司测序
菌落PCR检测
5’RACE序列的分析
将测序得到的结果去载体与接头
接下来，将5’RACE结果与中间片段以及3’RACE片段采用DNAMAN软件进行拼接
End to end实验

在采用DNAMAN软件将克隆得到的中间片段、 3’RACE片段以及5’RACE片段进行拼接后，我们还需要在序列结合处的两侧设计引物，进行end to end PCR，以确保所获得的序列是真实存在的，同时所设计引物的位置最好在开放阅读框的两侧。
Outer引物 Inner引物
确定读码框的方向
RACE引物设计的要点

23－28nt 50－70％GC Tm值≥65度，Tm值≥70度可以获得好的结果需要实验者根据已有的基因序列设计5‘和3‘RACE 反应的基因特异性引物（GSP1和 GSP2).由于两个引物的存在，PCR的产物是特异性的。
SMART法
该技术是基于以下两个观察发展起来的： a、不同反转录酶包括MMLV合成的cDNA 3’端保真度不高； b、不同的反转录酶具有不同的加尾特性，MMLV特意的在cDNA末端加上3-4个dCTP。

该方法的突出优点就是操作简便，成功率较高，全长分子的比例较高。cDNA第一链的合成和加尾一步即完成，避免了其他方法中对mRNA和cDNA链的反复操作，降低了mRNA 降解和合成产物丢失的风险，使本来就含量甚微的全长分子得到最大保存，所以这种方法得到了广泛认可，应用最多。如果加上RNA提取时间，这种技术可以在3个小时内得到加上接头的cDNA产物，最大限度地降低了mRNA的降解风险。

RACE_一种研究新基因的有效方法

由于ＲＬＭ－ＲＡＣＥ在起始阶段并不能区分有无帽子结构的ｍＲＮＡ，接头引物也许会加到非全长的ｍＲＮＡ的５′ 端。因此该方法在ＲＡＣＥ开始之前，ｍＲＮＡ要用牛小肠磷酸酶（ＣＩＰ）进行脱膦酸化反应。但是ＣＩＰ的这种处理并非１００％有效，有结果表明，跟带有接头引物的全长ｃＤＮＡ的量相比，只是带有接头引物被截短的ｃＤＮＡ的量少些而已［１７］。
１ＲＡＣＥ技术的原理
ＲＡＣＥ技术以ｍＲＮＡ为模板，反转录合成ｃＤＮＡ的第一条链。然后用ＰＣＲ技术扩增出从某个特定位点到３′端或５′端之间的未知核苷酸序列，因而又可以分为３′ＲＡＣＥ和５′ＲＡＣＥ两种。３′ＲＡＣＥ的原理是利用ｍＲＮＡ的３′端天然的ｐｏｌｙ（Ａ）尾巴作为一个引物结合位点进行ＰＣＲ，以Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）和一个接头组成的接头引物（ａｄａｐｔｏｒｐｒｉｍｅｒ，ＡＰ）反转录ｍＲＮＡ得到加接头的第一链ｃＤＮＡ。然后用一个正向的基因特异性引物（ｇｅｎｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｉｍｅｒ，ＧＳＰ）和一个含有部分接头序列的引物分别与已知序列区和ｐｏｌｙ（Ａ）尾区退火，经ＰＣＲ扩增位于已知序列区域和ｐｏｌｙ（Ａ）尾区之间的未知序列。若为了防止非特异性条带的产生，可采用巢式引物（ｎｅｓｔｅｄｐｒｉｍｅｒ）进行第二轮扩增，即巢式ＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄＰＣＲ）［３］。

RACE原理及实验步骤

3'-RACE 基本原理
3’ RACE流程图
先利用mRNA的3'末端的poly（A）尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo（dT）30MN作为锁定引物在反转录酶MMLV 作用下，反转录合成标准第一链cDNA.利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5'末端时自动加上3-5个（dC）残基，退火后（dC）残基与含有SMART寡核苷酸序列Oliogo（dG）通用接头引物配对后，转换为以SMART 序列为模板继续延伸而连上通用接头。然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM（universal primer，UPM）作为上游引物，用一个基因特异引物2（GSP 2 genespecific primer，GSP）作为下游引物，以SMART第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5'末端的cDNA片段扩增出来。最终，从2个有相互重叠序列的3'/ 5'-RACE产物中获得全长 cDNA，或者通过分析RACE产物的3'和5'端序列，合成相应引物扩增出全长cDNA。
Southern blotting：
Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链 DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。
• 明显增加BD SMART RACE扩增的特异性 • 降落PCR的退火温度符合首次PCR循环的Tm 高于通用引物的Tm 。 • 退火温度在随后降低到与通用引物相配合的程度，引起特异性基因模版的指数和高效率的扩增。 • 当引物的T m>70°C时建议使用降落循环程序。

RACE技术

RACE技术第一 RACE的简介目前,全长基因的获得是生物工程及分子生物学研究的一个重点。

尽管已经有多种方法可以获得基因的全长序列，但在很多生物研究中，由于所研究的目的基因丰度较低，从而使得由低丰度mRNA通过转录获得全长cDNA很困难。

近年来发展成熟的cDNA末端快速扩增(RACE)技术为从低丰度转录快速获得全长cDNA提供了一个便捷的途径。

cDNA 末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术是一种基于mRNA 反转录和PCR技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点,扩增基因转录本的未知区域,从而获得mRNA(cDNA)完整序列的方法。

简单的说就是一种从低丰度转录本中快速增长cDNA5’和cDNA3’末端，进而获得获得全长cDNA简单而有效的方法，该方法具有快捷、方便、高效等优点,可同时获得多个转录本。

因此近年来RACE技术已逐渐取代了经典的cDNA文库筛选技术,成为克隆全长cDNA序列的常用手段。

随着分子生物学技术的发展，科学家结合其他不同的分子生物学技术对最初的RACE 技术进行了改进，从而丰富了ＲＡＣＥ技术的类型。

目前使用的RACE技术包括：经典RACE、Adapter Ligated RACE、RLM-RACE、Cap-switching RACE、环形RACE、RAC-RACE和T-RACE等等，但没有一种RACE技术适合克隆所有类型的RNA。

因此，本文将通过介绍各种RACE技术的发展、原理及应用，比较认识各种RACE技术的优缺点，并对RACE的前景进行讨论。

第二RACE的原理1.经典RACERACE 是采用PCR 技术由已知的部分cDNA 顺序来扩增出完整cDNA5’和3’末端,是一种简便而有效的方法, 又被称为锚定PCR (anchoredPCR)和单边PCR(one2side PCR)。

①3’RACE的原理一)加入oligo(dT)17和反转录酶对mRNA进行反转录得到(-)cDNA；二)以oligo(dT)l7和一个35bp的接头(dT17-adaptor)为引物，其中在引物的接头中有一在基因组DNA中罕见的限制酶的酶切位点。

PCR技术克隆目的基因全过程

实验：目的基因克隆PCR技术课前预习PCR polymerase chain reaction 反应的基本原理;目的要求1．学习和掌握PCR 反应的基本原理与实验技术方法;2．认真完成每一步实验操作,详细记录实验现象和结果并加以分析和总结;基本原理类似于DNA 的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物;PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA 经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR 扩增形成的双链DNA 解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备；②模板DNA 与引物的退火复性：模板DNA 经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA 模板--引物结合物在TaqDNA 聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板;每完成一个循环需2～4 分钟,2～3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍;到达平台期Plateau所需循环次数取决于样品中模板的拷贝;实验用品1．材料：重组质粒DNA作为模板2．器材和仪器：移液器及吸头,硅烷化的PCR 小管,DNA扩增仪PE 公司,琼脂糖凝胶电泳所需设备电泳槽及电泳仪,台式高速离心机3．试剂：①10×PCR 反应缓冲液：500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris·Cl, 在25℃下, , ％Triton X-100;②MgCl2 ：25mmol/L;③ 4 种dNTP 混合物:每种L;④Taq DNA聚合酶5U/μl;⑤T4 DNA连接酶及连接缓冲液：方法步骤一PCR反应1. 依次混匀下列试剂35μl H2 O 5μl 10×PCR反应缓冲液4μl 25mmol/L MgCl2 4μl 4种dNTP μl 上游引物引物１μl 下游引物引物２μl 模板DNA约1ng 混匀后离心5秒;2. 将混合物在94℃下加热5分钟后冰冷,迅速离心数秒, 使管壁上液滴沉至管底,加入Taq DNA聚合酶μl约,混匀后稍离心,加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上;3. 用94℃变性1分钟,45℃退火1分钟, 72℃延伸2分钟, 循环35轮,进行PCR;最后一轮循环结束后, 于72℃下保温10分钟,使反应产物扩增充分;4 电泳按前所述,取10μl扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析,检查反应产物及长度; 注意1. PCR非常灵敏, 操作应尽可能在无菌操作台中进行;2. 吸头、离心管应高压灭菌, 每次吸头用毕应更换, 不要互相污染试剂;3. 加试剂前, 应短促离心10秒钟, 然后再打开管盖, 以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面;4. 应设含除模板DNA所有其它成分的负对照;实验结果注意事项微量操作、PCR 反应体系的设计、引物设计、扩增条件的优化思考题1. 降低退火温度对反应有何影响2. 延长变性时间对反应有何影响3. 循环次数是否越多越好为何4. PCR有哪些用途举例说明;附：PCR知识供参考一PCR 反应体系与反应条件标准的PCR 反应体系：10×扩增缓冲液10ul4 种dNTP 混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA ～2ugTaq DNA聚合酶Mg2+ L加双或三蒸水至100ulPCR 反应五要素：参加PCR 反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+引物：引物是PCR 特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度;理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR 就可将模板DNA在体外大量扩增;设计引物应遵循以下原则：①引物长度：15-30bp,常用为20bp左右;②引物扩增跨度：以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb 的片段;③引物碱基：G+C 含量以40-60%为宜,G+C 太少扩增效果不佳,G+C 过多易出现非特异条带;ATGC最好随机分布,避免5 个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列;④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3’端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带;⑤引物3’端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR 失败;⑥引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处;⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性;引物量：每条引物的浓度～1umol 或10～100pmol,以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会;酶及其浓度：目前有两种Taq DNA聚合酶供应, 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠菌合成的基因工程酶;催化一典型的PCR 反应约需酶量指总反应体积为100ul 时,浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少;dNTP 的质量与浓度：dNTP 的质量与浓度和PCR 扩增效率有密切关系,dNTP 粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性;dNTP 溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1M NaOH 或1M Tris;HCl的缓冲液将其PH调节到～,小量分装,-20℃冰冻保存;多次冻融会使dNTP 降解;在PCR 反应中,dNTP 应为50～200umol/L, 尤其是注意 4 种dNTP 的浓度要相等等摩尔配制, 如其中任何一种浓度不同于其它几种时偏高或偏低,就会引起错配;浓度过低又会降低PCR 产物的产量;dNTP 能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低;模板靶基因核酸：模板核酸的量与纯化程度,是PCR 成败与否的关键环节之一,传统的DNA 纯化方法通常采用SDS 和蛋白酶K 来消化处理标本;SDS 的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白,SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K 能水解消化蛋白质,特别是与DNA 结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀核酸;提取的核酸即可作为模板用于PCR 反应;一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接用于PCR 扩增;RNA 模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K 法,要防止RNase降解RNA;Mg2+浓度：Mg2+对PCR 扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的PCR 反应中,各种dNTP 浓度为200umol/L时,Mg2+浓度为～L为宜;Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性,使反应产物减少;PCR 反应条件的选择PCR 反应条件为温度、时间和循环次数;温度与时间的设置：基于PCR 原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点;在标准反应中采用三温度点法,双链DNA 在90～95℃变性,再迅速冷却至40 ～60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70～75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸;对于较短靶基因长度为100～300bp 时可采用二温度点法, 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94℃变性,65℃左右退火与延伸此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性;①变性温度与时间：变性温度低,解链不完全是导致PCR 失败的最主要原因;一般情况下,93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性,若低于93℃则需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响;此步若不能使靶基因模板或PCR 产物完全变性,就会导致PCR 失败;②退火复性温度与时间：退火温度是影响PCR 特异性的较重要因素;变性后温度快速冷却至40℃～60℃,可使引物和模板发生结合;由于模板DNA 比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞;退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度;对于20 个核苷酸,G+C 含量约50%的引物,55℃为选择最适退火温度的起点较为理想;引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm值解链温度=4G+C＋2A+T复性温度=Tm值-5～10℃在Tm值允许范围内, 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合,提高PCR 反应的特异性;复性时间一般为30～60sec,足以使引物与模板之间完全结合;③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：70～80℃150核苷酸/S/酶分子70℃60 核苷酸/S/酶分子55℃24 核苷酸/S/酶分子高于90℃时, DNA合成几乎不能进行;PCR 反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间,常用温度为72℃,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合;PCR 延伸反应的时间,可根据待扩增片段的长度而定,一般1Kb以内的DNA片段,延伸时间1min是足够的;3～4kb 的靶序列需3～4min；扩增10Kb 需延伸至15min;延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现;对低浓度模板的扩增,延伸时间要稍长些;循环次数：循环次数决定PCR 扩增程度;PCR 循环次数主要取决于模板DNA的浓度;一般的循环次数选在30～40 次之间,循环次数越多,非特异性产物的量亦随之增多;PCR 反应特点特异性强PCR 反应的特异性决定因素为：①引物与模板DNA 特异正确的结合；②碱基配对原则；③Taq DNA 聚合酶合成反应的忠实性；④靶基因的特异性与保守性;其中引物与模板的正确结合是关键;引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的;聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA 聚合酶耐高温性,使反应中模板与引物的结合复性可以在较高的温度下进行,结合的特异性大大增加,被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度;再通过选择特异性和保守性高的靶基因区,其特异性程度就更高;灵敏度高PCR 产物的生成量是以指数方式增加的,能将皮克pg=10 -12 g量级的起始待测模板扩增到微克ug=10 -6 g水平;能从100 万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中,PCR 的灵敏度可达3 个RFU空斑形成单位；在细菌学中最小检出率为3 个细菌;简便、快速PCR 反应用耐高温的Taq DNA 聚合酶,一次性地将反应液加好后,即在DNA 扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应,一般在2～4 小时完成扩增反应;扩增产物一般用电泳分析,不一定要用同位素,无放射性污染、易推广;对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞,DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板;可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA 扩增检测;PCR 扩增产物分析PCR 产物是否为特异性扩增,其结果是否准确可靠,必须对其进行严格的分析与鉴定,才能得出正确的结论;PCR产物的分析,可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法;凝胶电泳分析：PCR产物电泳,EB 溴乙锭染色紫外仪下观察,初步判断产物的特异性;PCR产物片段的大小应与预计的一致,特别是多重PCR,应用多对引物,其产物片断都应符合预讦的大小,这是起码条件;琼脂糖凝胶电泳：通常应用1～2%的琼脂糖凝胶,供检测用;聚丙烯酰胺凝胶电泳：6～10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好,条带比较集中,可用于科研及检测分析;酶切分析：根据PCR 产物中限制性内切酶的位点,用相应的酶切、电泳分离后,获得符合理论的片段,此法既能进行产物的鉴定,又能对靶基因分型,还能进行变异性研究;分子杂交：分子杂交是检测PCR 产物特异性的有力证据,也是检测PCR 产物碱基突变的有效方法;Southern 印迹杂交：在两引物之间另合成一条寡核苷酸链内部寡核苷酸标记后做探针,与PCR 产物杂交;此法既可作特异性鉴定,又可以提高检测PCR 产物的灵敏度,还可知其分子量及条带形状,主要用于科研;斑点杂交：将PCR 产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上,再用内部寡核苷酸探针杂交,观察有无着色斑点,主要用于PCR 产物特异性鉴定及变异分析;核酸序列分析：是检测PCR 产物特异性的最可靠方法;PCR 常见问题总结PCR 产物的电泳检测时间一般为48h 以内,有些最好于当日电泳检测,大于48h 后带型不规则甚致消失;假阴性,不出现扩增条带PCR 反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性,③酶的质量及活性④PCR循环条件;寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究;模板：①模板中含有杂蛋白质,②模板中含有Taq 酶抑制剂,③模板中蛋白质没有消化除净,特别是染色体中的组蛋白,④在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚;⑤模板核酸变性不彻底;在酶和引物质量好时,不出现扩增带,极有可能是标本的消化处理,模板核酸提取过程出了毛病,因而要配制有效而稳定的消化处理液,其程序亦应固定不宜随意更改;酶失活：需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性;需注意的是有时忘加Taq 酶或溴乙锭;引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是PCR 失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因;有些批号的引物合成质量有问题,两条引物一条浓度高,一条浓度低,造成低效率的不对称扩增,对策为：①选定一个好的引物合成单位;②引物的浓度不仅要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现,而且两引物带的亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做PCR 有可能失败,应和引物合成单位协商解决;如一条引物亮度高,一条亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度;③引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效;④引物设计不合理,如引物长度不够,引物之间形成二聚体等;Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR 扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增的特异性,浓度过低则影响PCR 扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带;反应体积的改变：通常进行PCR 扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul;或100ul,应用多大体积进行PCR 扩增,是根据科研和临床检测不同目的而设定,在做小体积如20ul 后,再做大体积时,一定要模索条件,否则容易失败;物理原因：变性对PCR 扩增来说相当重要,如变性温度低,变性时间短,极有可能出现假阴性;退火温度过低,可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率;有时还有必要用标准的温度计,检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度,这也是PCR失败的原因之一;靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列,其PCR 扩增是不会成功的;假阳性出现的PCR 扩增条带与目的靶序列条带一致,有时其条带更整齐,亮度更高;引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性, 因而在进行PCR 扩增时, 扩增出的PCR产物为非目的性的序列;靶序列太短或引物太短,容易出现假阳性;需重新设计引物;靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染,导致假阳性;这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外;②除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒;所用离心管及样进枪头等均应一次性使用;③必要时,在加标本前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸;二是空气中的小片段核酸污染,这些小片段比靶序列短,但有一定的同源性;可互相拼接,与引物互补后,可扩增出PCR产物,而导致假阳性的产生,可用巢式PCR 方法来减轻或消除;出现非特异性扩增带PCR 扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带;非特异性条带的出现,其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体;二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低,及PCR 循环次数过多有关;其次是酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增;其对策有：①必要时重新设计引物;②减低酶量或调换另一来源的酶;③降低引物量,适当增加模板量,减少循环次数;④适当提高退火温度或采用二温度点法93℃变性,65℃左右退火与延伸;出现片状拖带或涂抹带PCR 扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带;其原因往往由于酶量过多或酶的质量差,dNTP浓度过高,Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起;其对策有：①减少酶量,或调换另一来源的酶;②减少dNTP的浓度;③适当降低Mg2+浓度;④增加模板量,减少循环次数;PCR 污染与对策PCR 反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性,但令人头痛的问题是易污染,极其微量的污染即可造成假阳性的产生;污染原因一标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染,或标本放置时,由于密封不严溢于容器外,或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中,由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散,导致彼此间的污染;二PCR 试剂的污染:主要是由于在PCR 试剂配制过程中,由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.三PCR扩增产物污染:这是PCR反应中最主要最常见的污染问题, 因为PCR产物拷贝量大一般为1013拷贝/ml,远远高于PCR 检测数个拷贝的极限,所以极微量的PCR 产物污染,就可造成假阳就可形成假阳性;还有一种容易忽视,最可能造成PCR 产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶,在操作时比较剧烈地摇动反应管,开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染;据计算一个气溶胶颗粒可含48000 拷贝,因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题;四实验室中克隆质粒的污染:在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室,这个问题也比较常见;因为克隆质粒在单位容积内含量相当高,另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂,而且在活细胞内的质粒,由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力,其污染可能性也很大;污染的监测一个好的实验室,要时刻注意污染的监测,考虑有无污染是什么原因造成的污染,以便采取措施,防止和消除污染;对照试验1. 阳性对照:在建立PCR 反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR 阳性对照,它是PCR 反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志;阳性对照要选择扩增度中等、重复性好,经各种鉴定是该产物的标本,如以重组质粒为阳性对照,其含量宜低不宜高100 个拷贝以下,但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本,其对检测或扩增样品污染的可能性很大;因而当某一PCR 试剂经自己使用稳定,检验人员心中有数时,在以后的实验中可免设阳性对照;2. 阴性对照:每次PCR 实验务必做阴性对照;它包括①标本对照:被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照;②试剂对照:在PCR 试剂中不加模板DNA或RNA,进行PCR 扩增,以监测试剂是否污染;3. 重复性试验4. 选择不同区域的引物进行PCR 扩增防止污染的方法一合理分隔实验室:将样品的处理、配制PCR 反应液、PCR 循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行,特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开;最好能划分①标本处理区;②PCR 反应液制备区;③PCR 循环扩增区;④PCR 产物鉴定区;其实验用品及吸样枪应专用,实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA 或RNA;二吸样枪:吸样枪污染是一个值得注意的问题;由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源,因而加样或吸取模板核酸时要十分小心,吸样要慢,吸样时尽量一次性完成,忌多次抽吸,以免交叉污染或产生气溶胶污染;三预混和分装PCR试剂:所有的PCR 试剂都应小量分装,如有可能,PCR 反应液应预先配制好,然后小量分装,-20℃保存;以减少重复加样次数,避免污染机会;另外,PCR 试剂,PCR 反应液应与样品及PCR产物分开保存,不应放于同一冰盒或同一冰箱;四防止操作人员污染,使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用;五设立适当的阳性对照和阴性对照,阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准病原体核酸为宜,并注意交叉污染的可能性,每次反应都应有一管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照;六减少PCR 循环次数,只要PCR 产物达到检测水平就适可而止;七选择质量好的Eppendorf管,以避免样本外溢及外来核酸的进入,打开离心管前应先离心,将管壁及管盖上的液体甩至管底部;开管动作要轻,以防管内液体溅出;参考文献一、主要教学参考书：1.基因工程原理第二版.吴乃虎编著,科学出版社2.分子克隆实验指南第三版.黄培堂等译,科学出版社3.基因克隆和DNA分析.魏群等译,高等教育出版社4.最新分子生物学实验技术梁国栋主编,科学出版5分子生物学实验指导主编：魏群高等教育出版社施普林格出版社二、主要参考文献：, SN, ACY Chang and L Hsu, 1972, Sci. 69:2110., HC and J Doly. 1979.,Nucleic Acids Res. 7:1513., C and P Borst, 1972.,Biochim. Biophys. Acta 269:192.F, RL Rodriguez, PJ Greene, MC Betlach, HL Heyneker, HW Boyer, JH Crosa, and S Falkow, 1977b,,Gene 2:95.K, F Faloona, S Scharf, R Saiki, G Horn and H Erlich, 1986.,Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263.。

利用RACE技术获得甜菜M14品系特异表达基因M14-86的5′末端

利用 RACE 技术获得甜菜 M14 品系特异表达基因 M14-86 的 5′末端陈速黑龙江大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨（150080）E-mail：chensu208@摘要：本文利用 RACE 技术对从 M14 品系花期特异表达基因 cDNA 文库中筛选获得的 cDNA Me-c86（Me-c86 所在基因命名为 M14-86）进行 5′-RACE 扩增，并将所获得的 5′末端 cDNA 与其 3′端 cDNA 序列进行拼接，获得的基因 M14-86 的 cDNA 全长为 1 330bp。

将 M14-86 全长 cDNA 序列提交到 GenBank 数据库进行 BLASTn 分析，结果表明，该基因与大花马齿苋（Portulaca grandiflora）等植物的 26S rRNA 基因序列相似性高达 97%，该基因全长 cDNA 序列的获得，为进一步研究甜菜 M14 品系特异表达基因生物学特性提供了有用的信息。

关键词：甜菜 M14 品系； M14-86；5′-RACE；BLAST 中图分类号：Q 71. 引言自 1998 年开始，郭德栋教授等以二倍体栽培甜菜（B.vulgaris L.）与四倍体野生种白花甜菜（B.corolliflora Zoss.）进行种间杂交，获得了真实杂种 F1 VC88-1（VVCC，2n=36），然后通过与栽培甜菜回交，首次合成了异源三倍体甜菜（VVC，2n=27）；获得了带有白花甜菜染色体的完整栽培甜菜单体附加系，共 9 种类型（VV+1C1-9，2n=19），其中带有白花甜菜 9 号染色体的单体附加系 M14 品系（VV+1C9，2n=19）其传递率在 96.5％以上。

通过专家鉴定，认为带有白花甜菜第 9 号染色体的栽培甜菜单体附加系 M14 品系是克隆无融合生殖基因极其难得的材料[1-5]。

cDNA 末端快速扩增技术[6]（rapid amplification of cDNA ends, RACE），是一种从低丰度转录本中快速扩增 cDNA 5′ 和 3′ 末端简单而有效的方法，也被称为锚定 PCR （Anchored-PCR）或单边 PCR （one- sided PCR）。

RACE技术

引物(根据已知序列设计)和PolyT引物PCR即
可。大多实验者反映一次PCR可以搞定。
SMARTTM 3‘-RACE的原理
5'-RACE ：5'-RACE相对较难，目前流行几种5'RACE。其一为加接头(传统)，根据接头引物和自己设计特异引物PCR，可以设计巢式PCR二次扩增。另外，有利用反向PCR技术，连接成环在 PCR。还有，GENE公司一种 smartRACEPCR，利用反转酶末断加C特点,直接加上多G接头，转换模板而无需用连接酶加接头。利用mRNA的3‘末端的
验证基因特异性引物的对照
利用两个GSPS进行阳性对照：（只有两个 GSP可以产生重叠的时候才可以采用此步。）为了确定RNA样品中目的基因确实表达，利用两个GSP和接头连接的cDNA来产生阳性对照。可以产生两个引物之间的重叠大小的片段。如果没有这个片段，应该重复cDNA的合成，或者从一个不同的组织或细胞来源进行 cDNA的合成。
SMARTTM 3‘-RACE的原理图
SMARTTM 5'-RACE的原理
先利用mRNA的3‘末端的poly（A）尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo（dT）30MN作为锁定引物在反转录酶MMLV作用下，反转录合成标准第一链cDNA.利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5’末端时自动加上3-5个（dC）残基，退火后（dC）残基与含有SMART寡核苷酸序列 Oliogo（dG）通用接头引物配对后，转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头。
反应中涉及到的一些事项
降落PCR可以明显的增加RACE PCR产物的特异性。在最开始的循环中，退火温度高于 AP1引物的Tm值，可以增加对特异性条带的扩增。随后的退火和延伸的温度降回到AP1的温度，可以进行随后的PCR循环。

race

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大黄鱼CCTα基因的克隆及其表达量随稚鱼生长发育的变化

doi: 10.7541/2016.99大黄鱼CCTα基因的克隆及其表达量随稚鱼生长发育的变化冯硕恒蔡佐楠麦康森艾庆辉(中国海洋大学农业部水产动物营养与饲料重点实验室, 海水养殖教育部重点实验室, 青岛 266003)摘要: 研究旨在克隆大黄鱼磷脂酰胆碱合成关键基因磷脂酰胆碱胞苷转移酶α (CCTα)基因全长, 并检测其表达量随稚鱼生长发育的变化。

利用同源克隆技术和RACE技术从大黄鱼肝脏中成功扩增出CCTα的全长。

同时应用real-time PCR法检测不同日龄大黄鱼稚鱼CCTα的表达变化。

序列分析表明,CCTα全长2419 bp (GenBank登录号: KF006239.1), 包括273 bp 的5'端非编码区, 1107 bp的开放阅读框, 1010 bp的3'端非编码区,共编码369个氨基酸。

系统进化树分析表明, 相比其他物种, 大黄鱼CCTα基因与红鳍东方鲀的亲缘关系较近。

定量结果表明, 孵化后, 大黄鱼仔稚鱼CCTα的表达量随日龄的变化先显著升高, 在15日龄时达到最大值,随后显著下降并趋于平稳, CCTα基因表达量的变化趋势与大黄鱼稚鱼消化系统的发育密切相关。

关键词: 大黄鱼; 磷脂; 合成代谢; 个体发育; 磷脂酰胆碱胞苷酰基转移酶中图分类号: Q344+.1 文献标识码: A 文章编号: 1000-3207(2016)04-0752-06磷脂又称“极性脂”, 是分子中含有磷酸的复合脂, 是生物膜的重要功能成分, 也是动植物细胞不可缺少的成分[1]。

磷脂在水产动物, 尤其是仔稚鱼上起着极为重要的作用。

首先, 磷脂是细胞膜的重要组成成分[2], 对维持细胞膜功能的完善起着重要作用; 其次, 鱼类利用极性脂的能力要高于中性脂,因此在胚胎和稚鱼早期阶段, 磷脂可以作为脂肪的一种可以提供能量[3—5]; 此外磷脂分解代谢还能产生类二十烷酸、二脂酰甘油和肌醇等生物活性物质, 对维持鱼类正常的生理活动具有重要的意义[6]。

RACE中文说明书

SMARTer™ RACE cDNA Amplification Kit User Manual l^ibk or Contents内容页码L概要简介II•成分m •另备物品IV. BD SMART RA€E AmpliRcaLn 基本康理 "引物设计VL Poly A* † RNA和总RNA的制备vn. cDNA的弟一密的舍成vm pat阳性对豐_____________________________QC3N碌端的快速扩ifl(RACE)lX. RACE产物鉴定XL疑难解答501 •参考文献xm •相关产吕附录加5 -RACE流程图示附录皿3-RACE 图示PH 录C; SupprffiHoa PCR and StetMJiH PCR 39I•简要概述II.成分列表Comral Hunun PLicenialTolal RNA 和BD SMART IIA 01ig3nuLlcoddott-70fi CT保存。

NudeoTrap Gel Extraction Kit 2ST保存.其条试笊-20临下保存.fig BD SMART RACE <DNA Amplified lion Kit 同时免费提供BD PowerScript Reveise Transcriptase和BD Advantage 2 PCR Kiu所有试刑可以淞足7次cONA含成反应和30次PCR反应.Fint->btr«ind cDNA 含成•7jil BD SMART IT™ A OUgonueleotide (12 pM)5-AAGCAGTGGTATCAACG CAGAGTACGCGG (T†7pl 3f-HACE CDS Primer A (3^05; 12 pM)5-AAGCAGTGGI7VTG.^AGG GAGAGTACfTJJOV N-3*arT V = A, G, or C)•7pl 5f-RACE CDS Primer (5'«CDS; 12 pM)茴小5TD25VN-3*(N = A,C,G 曲戸V = A, C,orC)•7pl BD PoiverScrlpl™ Reverse I^-anscriptaM•200 pl 5X FirabSLrdnd Buffer250mMTHs-HCI (pH 83)375 mM KC130 niM Mgpl2•200 pl DJthiothreitol (DTT; 20 mM),二硫苏權醉•1ml Deianitzecl H2O5••& 3 -RACE PCR•400 pl 10X Universal Primer A Mix (UPM)Long (0.4 pM):5,-CIAAIACGA€TGACTXrAGGGCAAG-CAGTCGIATGAACGCAGAGT-3, Short (2 pM):5,-^.4ATACGACTCACTATAGGCC^•50 pl Nested Unh ersal Primer A (NUP; 10 pM>5-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT7Control Reagents•5pl Coatrol Human Phcental (胎盘)Total RNA (1 pg/pl)■ 25 pl Control 5 -RACE T¥R Primer (10 pM)•25 pl Control 3'RACE IVR Primer (10M)PGeneral Reagents•70 pl dNTP Mix (dAl£ dCTP, dGTP, and dTTP, each at 10 mM)•2Xlml l¥kine-EDTA Buffer10 mM Tricine-KOH (pH 8.5)1.0 mM EDTANudeoIYap® Gei Extraction Kit (CaL No 636053 or K3070-y)•100 pl NudeoTrap Suspension•3 ml NT1 Buffer•10 ml NT2 Buffer•2ml N13 Buffer•User Manual (PT3l6d-l)Free Lrial-size BD Advantage™ 2 PCR Kh (Cat No. 639207or K19l0-y)Tho BD Advanuge 2 kit provider suf fie ieni roagenls for 30 PC R reactions.The following a)m|X>nenls are included:•30 pl SOX BD Advantage 2 Polymerase Mix•200 pl 1 OX BD Advance 2 PCR Buffer•30 pl SOX dNTP Mix (10 mM S)•30 pl Control DNA Template (100 n^/pl)•30 pl Control Primer Mix (10 pM each)• 1 ml PCR-Grade Wator•User Manual (PT3281-1)III.另备物品下列试刑襦另外准笛；•0.5-1 nl PCR 反应管.推荐使用PerkinElnier GeiwAmp O.S-ml fXMClion tubes (dl. No. N8ai-O737ufN0Ol-O18O).•Mineral oil («.g., Sigma CdL Na M-3516)俺小IV BD SMART RACE的要点使全面闻读•所有妙锻均经过优彳匕但可能因所使用的辭、根版、引物和然循环仪而不同•因此应使用Control Human Pldceeiul T OLI I RNA5R]Cantrol T- anil 31- RACE TF*R Prinwns进行烦实•RACE PCR的效率取决于试腌样品RNA中mRNA的丰盛•另外ig火温愷和延伸遍廈也依引韧不同而变化.诗参照第X节的侵议优彳匕PCR的条弁•丑进行5f-RACE and 3--RACE PCRK必别便用热启动。

cDNA末端快速扩增技术RACE

SMART RACE cDNA
碱基互补配对原则
AT之间之间形成两个氢键 GC之间之间形成三个氢键
poly(C)替代替代poly(A) 替代增加5′ 接头与cDNA 第一链的结合牢固性增加接头与
增加模板中有效双链丰度
提高目的基因获取几率
SMARTer RACE流程流程

SMARTTM 3'-RACE的原理的原理
• 利用mRNA的3'末端的poly（A）尾巴作利用mRNA的3'末端的poly（ mRNA 末端的poly 为一个引物结合位点，以连有SMART SMART寡为一个引物结合位点，以连有SMART寡核营酸序列通用接头引物的Oligo dT） Oligo（核营酸序列通用接头引物的Oligo（dT） 30MN作为锁定引物反转录合成标准第 30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA. cDNA.然后用一个基因特异引物一链cDNA.然后用一个基因特异引物 GSP1（ primer，GSP） GSP1（gene specific primer，GSP）作为上游引物，作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物UPM UPM（序列的通用引物UPM（universal primer，UPM）作为下游引物， primer，UPM）作为下游引物，以cDNA 第一链为模板，进行PCR循环， PCR循环第一链为模板，进行PCR循环，把目的基因3' 末端的DNA片段扩增出来。 DNA片段扩增出来基因3' 末端的DNA片段扩增出来。
5′-RACE法 5′-RACE法原理图
RACE 产物的鉴定和全长 cDNA 的获得
3′或5′双链或双链双链cDNA
限制性内切酶酶切

RACE原理及应用

RACE的简介目前,全长基因的获得是生物工程及分子生物学研究的一个重点。

尽管已经有多种方法可以获得基因的全长序列，但在很多生物研究中，由于所研究的目的基因丰度较低，从而使得由低丰度mRNA通过转录获得全长cDNA很困难。

近年来发展成熟的cDNA末端快速扩增(RACE)技术为从低丰度转录快速获得全长 cDNA 提供了一个便捷的途径。

cDNA 末端快速扩增 (rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术是一种基于mRNA反转录和 PCR技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点,扩增基因转录本的未知区域,从而获得mRNA(cDNA)完整序列的方法。

简单的说就是一种从低丰度转录本中快速增长cDNA5’和cDNA3’末端，进而获得获得全长cDNA简单而有效的方法，该方法具有快捷、方便、高效等优点,可同时获得多个转录本。

因此近年来RACE技术已逐渐取代了经典的cDNA文库筛选技术,成为克隆全长cDNA序列的常用手段。

第二 RACE的原理RACE 是采用PCR 技术由已知的部分cDNA 顺序来扩增出完整cDNA5’和3’末端,是一种简便而有效的方法, 又被称为锚定 PCR (anchoredPCR)和单边PCR(one2side PCR)。

3’RACE的原理一)加入oligo(dT)17和反转录酶对mRNA进行反转录得到(-)cDNA；二)以oligo(dT)l7和一个35bp的接头(dT17-adaptor)为引物，其中在引物的接头中有一在基因组DNA中罕见的限制酶的酶切位点。

这样就在未知cDNA末端接上了一段特殊的接头序列。

再用一个基因特异性引物(3 amp)与少量第一链(-)cDNA退火并延伸，产生互补的第二链(+)cDNA。

三)利用3amp和接头引物进行PCR循环即可扩增得到cDNA双链。

扩增的特异性取决于3amp的碱基只与目的cDNA分子互补．而用接头引物来取代dT17一adaptor则可阻止长(dT)碱基引起的错配。

西伯利亚鲟β-actin基因cDNA全长克隆、序列分析及其作为内参基因的应用研究

西伯利亚鲟β-actin基因cDNA全长克隆、序列分析及其作为内参基因的应用研究施志仪;程千千;宋佳坤【摘要】采用同源克隆和RACE技术获得西伯利亚鲟(Acipenser baerii)β-actin 基因cDNA全长,序列分析表明西伯利亚鲟β-actin基凶cDNA全长1322 bp,其包括的137 bp的5'端非翻译区,57 bp的3'端非翻译区和编码375个氨基酸残基的1128 bp开放阅读框.与其他物种比对,该基因具极高的保守性.同时也利用同源克隆技术获得了两伯利亚鲟Sox2基因的同源保守区,该序列长768 bp,编码256个氨基酸,也具较高的保守性,与其他物种的相似性在70%以上.以β-actin作为内参基因,对Sox2基因在西伯利哑鲟成鱼各组织及胚胎发育各时期进行实时荧光定量PCR检测,发现Sox2基因在不同组织中均有表达.其中,在肝、胰、肾、脑4个组织中表达量差距不大,均处于相对较低的水平,在肌肉组织中表达量最高,达到了肝脏的10.4倍.同时Sox2基因虽在西伯利亚鲟胚胎发育各时期均有表达,但表达也具明显的时间差异性.在受精卵期、囊胚期Sox2基因的相对表达量较低,在原肠期、神经胚期、视泡形成期和心脏形成期Sox2基因相对表达量较高,且在心脏形成期达到最高点.本研究为量化西伯利亚鲟发育分化过程中相关基因提供了坚实的参照工具,增加了后续试验的可信度,同时可为今后深入研究西伯利亚鲟Sox2在侧线神经节分化发育、细胞迁移过程中的作用提供基础参考依据.【期刊名称】《中国水产科学》【年(卷),期】2010(017)006【总页数】10页(P1173-1182)【关键词】西伯利亚鲟;β-actin;cDNA全长克隆;Sox2;内参基因【作者】施志仪;程千千;宋佳坤【作者单位】上海海洋大学,水产与生命科学学院,上海,201306;上海海洋大学,水产与生命科学学院,上海,201306;上海海洋大学,水产与生命科学学院,上海,201306【正文语种】中文【中图分类】Q786%S917西伯利亚鲟(Acipenser baerii)隶属鲟形目(Acipenseriformes)、鲟科(Acipenseridae)、鲟属(Acipense),为软骨硬鳞鱼,分布于西伯利亚河流和湖泊。

半滑舌鳎 TRAF6 基因和 TAK1 基因的克隆及表达分析

中国水产科学 2015年9月, 22(5): 867-876 Journal of Fishery Sciences of China研究论文收稿日期: 2015-03-02; 修订日期: 2015-04-17. 基金项目: 国家863计划项目(2012AA10A402).作者简介: 陈燕(1988–), 女, 硕士, 研究方向为海洋生物遗传学. E-mail: gtpeng@ 通信作者: 张全启, 教授. E-mail: qzhang@DOI: 10.3724/SP.J.1118.2015.15082半滑舌鳎TRAF6基因和TAK1基因的克隆及表达分析陈燕, 樊琳, 刘田田, 刘跃中, 李赞, 张全启中国海洋大学海洋生命学院, 山东青岛 266003摘要: 本研究通过同源克隆和RACE 技术获得了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis )肿瘤坏死因子受体相关因子 6 (tumor necrosis factor receptor-associated factor 6, TRAF6)和转化生长因子β激活激酶1 (transforming growth fac-tor-β-activated kinase 1, TAK1)的cDNA 全长, 并分析了其在不同组织和早期胚胎发育时期的表达情况。

结果表明, TRAF6 cDNA 全长1956 bp, 开放阅读框(ORF)为1731 bp, 编码576个氨基酸。

二级结构预测显示TRAF6具有保守的蛋白结构域: N 端的RING 结构, 两个锌指结构以及C 端的环–环(coiled-coil) α螺旋结构和高度保守的MATH 同源结构。

TAK1 cDNA 全长2519 bp, ORF 为1731 bp, 编码576个氨基酸。

TAK1的蛋白结构域包括丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶激活结构域和C 端的环–环(coiled-coil) α螺旋结构域。

植物分子生物学植物基因的同源克隆PowerPoint 演示文稿

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植物总RNA提取的难点 1.内外源RNase的污染。 2.多酚类物质的干扰 3.蛋白质的干扰 4.多糖的干扰
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创造一个无RNase的环境
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1.器械的消毒：用0.1%DEPC—二乙基焦碳酸盐（Diethyl Pyrocarbonate )浸泡处理2hr以上，然后高压灭菌去除DEPC；或高温（250℃）干热消毒4hr以上或200℃干热消毒过夜。
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植物DNA提取的难点
1.多酚类物质的干扰:多酚类物质被氧化后，与DNA 分子发生不可逆的结合，使提取的DNA样品呈棕褐色。
2.多糖类物质的干扰：多糖与DNA形成粘稠的胶状复合物，DNA被包埋在这种复合物中难于溶解。
3.其它次生物质的干扰：乳胶、树脂等，与DNA共沉淀。这种褐色、粘稠的DNA不易被限制性内切酶和Taq DNA聚合酶所识别，从而导致PCR扩增和酶切的失败。
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植物RNA提取过程中蛋白质污染的排除
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1.在冷冻条件下研磨植物材料，以抑制 RNase的活性。 2.在提取缓冲液中加入蛋白质变性剂（苯酚、胍、SDS、CTAB等）。 3.利用蛋白酶K降解蛋白质。 4.利用苯酚、氯仿抽提。 5.用70%高氯酸钠溶液沉淀蛋白质。
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植物DNA和RNA的检测
5.研磨时加入大分子聚合物或吸附剂除多酚： PVP、PVPP：2-6.0%（W/V）；活性炭： 0.1-0.3%（W/V）。
13
6.高盐去多糖法：在氯仿/异戊醇的抽提后的水相中加入0.5V的5MNaCl混匀，然后加入2V的无水乙醇沉淀DNA，大部分多糖留在上清液中；在DNA的水溶液中，加入5MNaCl使其终浓度为0.5-3.0M，以2.0M除糖效果最好。
植物基因的同源克隆

RACE技术的原理和操作

RACE技术的原理和操作近年来随着生物技术的不断发展，出现了许多克隆新基因的方法和手段，如图谱克隆技术、转座子标签技术、mRNA差异显示技术二基因组减法技术以及cDNA文库筛选技术等。

但上述方法人多具有实验周期长、技术步骤烦琐且工作量大等特点。

cDNA末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends，RACE）是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3'末端的有效方法，以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视。

经典的RACE技术是由Frohman等（1988）发明的一项技术，主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的c DNA5'和3'端，包括单边PCR和锚定PCR。

该技术提出以来经过不断发展和完善，克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点（Frohman等，1995：Schaefer，l995： Chen，1998： Bespalova等，1998： Matz等11999）。

对传统RACE技术的改进主要是引物设计及RT-PCR技术的改进：改进之一是利用锁定引物（（lock docking primer）合成第一链cDNA，即在oligo（dT）引物的3' 端引入两个简并的核苷酸【5'-Oligo（dT）16-30MN-3'，M=A/G/C；N=A/G/C/T】，使引物定位在poly（A）尾的起始点，从而消除了在合成第一条cDNA链时oligo（dT）与poly（A）尾的任何部位的结合所带来的影响；改进之二是在5' 端加尾时，采用poly（C），而不是poly（A）；改进之三是采用RNase H-莫洛尼氏鼠白血。

病毒（MMLV）反转录酶或选择嗜热DNA聚合酶可能在高温（60℃ -70℃）有效地逆转录mRNA，从而消除了5 '端由于高CC含量导致的mRNA 二级结构对逆转录的影响；改进之四是采用热启动PCR （hot start PCR）技术和降落P CR（touch down PCR）提高PCR反应的特异性。

RACE原理及实验步骤

的结合所带来的影响；
2
在5' 端加尾时，采用poly（C），而不是poly（A）
采用RNase H-莫洛尼氏鼠白血病毒（MMLV）反转录酶
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或选择嗜热DNA聚合酶可能在高温（60℃ -70℃）有效
地逆转录mRNA，从而消除了5'端由于高CC含量导致的
mRNA 二级结构对逆转录的影响；
采用热启动PCR （hot start PCR）技术和降落
SMARTTM 5'-RACE 的原理
5’ RACE流程图
五、cDNA 末端的快速扩增(RACE)
主要步骤：
1、PCR 反应混合液的准备：确保混合液体积足够所有的 PCR反应和一次额外的反应。该混合液用于5'- 和 3'RACE 反应。对于50-µl PCR 反应，所混合的成份如下：
2、漩涡混合（不要产生气泡），短暂离心。
Southern blotting：
Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链 DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。
一、成分及另备物品
保存条件： 1. Control Human PlacentalTotal RNA
和 BD SMART II A Oligonucleotide在– 70°C下保存。 2. NucleoTrap Gel Extraction Kit 室温下保存。 3. 其余试剂–20°C下保存。
(Cat.Nos.639206/639207) Advantage 2 Polymerase Mix