基因重组蛋白纯化流程
基础生化实验-蛋白质纯化
蛋白质纯化一、目的:利用金属亲和性管柱(metal affinity column)来大量纯化带有affinity tag的基因重组蛋白。
二、原理:由于六个Histidine 所组成的His Tag (metal affinity tag)可与Ni2+ bind，所以利用基因重组技术在表现的蛋白质加上His Tag，再以金属亲和性管柱(Ni-NTA) (此His- tag序列可与带二价正电的阳离子相螯和)及liquid chromatography来大量纯化蛋白质。
三、试剂与器材:1.loading(binding) buffer (10mM imidazole,0.3M NaCl,50Mm Tris-HClPh7)✧细菌回溶成为蛋白质的载体以保持活性2.wash buffer (20mM imidazole,0.3M NaCl,50Mm Tris-HCl,Ph7)3.elution buffer (20mM EDTA,0.3M NaCl,50Mm Tris-HCl,Ph7)上课补充:✧蛋白质很脆弱，需要在特殊的buffer里。
四、仪器与设备:FPLC(速液相色谱仪)五、步骤:1.将管柱架在铁架上，把亲和性胶体悬浮装填于管柱内。
2.以2~3倍CV loading buffer清洗管柱后，注入蛋白质样本。
3.以wash buffer梳洗，2到3倍column体积。
4.用wash buffer和elution buffer进行线性梳洗，并收集流出液体，以FPLC UV monitor上的OD280数据读取样品流出与否，并观察冲离液之曲线图。
上课补充:✧胞内型分泌需要用超音波破菌，因为会放热所以要放在冰中使用。
✧线性梳洗为加入elution buffer会有颜色变化会把镍离子跟imidazole冲洗掉，剩下胶体溶液。
✧其中imidazole和Histidine类似也会和镍离子结合所以会竞争，可拿来洗涤蛋白质。
重组蛋白质的分离纯化 (1)
重组蛋白质的分离纯化摘要：90年代以来基因重组技术得到很大的发展，基因工程产品的分离纯化的成本约占其全部成本的60%～80%，因此重组蛋白的分离纯化技术越来越重要。
本文主要介绍了沉淀、液液萃取、层析等常用分离重组蛋白方法的原理及应用，旨在为开展蛋白质的制备及其应用研究提供理论依据。
关键词：重组蛋白质；分离；纯化；沉淀；液液萃取；层析；包涵体随着基因重组技术的发展，出现了很多基因工程产品，而作为基因工程技术的下游工程中的基因重组蛋白的分离纯化技术越来越显示其重要性。
据有人统计,基因工程产品的分离纯化成本约占到其全部成本的60%～80%[1]。
由此可见产品的分离纯化是获得目的产物的关键一步，也是比较困难的一步，它标志着生物产业的高低。
纯化重组蛋白质和普通蛋白质的不同就在于要选择合适的表达系统，因为表达系统决定了细胞培养过程中产物的性质以及可能产生的杂蛋白，而纯化重组蛋白质的主要目的是去除杂蛋白质，通常对一种重组蛋白质的纯化会采用多个系统[2]。
但是重组蛋白有几种不同的表达形式，如细胞外的分泌表达；细胞内可溶性表达以及包涵体形式的存在，因此对于重组蛋白的纯化要依据其表达形式的不同，采取不同的纯化工艺。
与传统方式相似，重组蛋白的分离纯化也是利用其物理和化学性质的差异，即以分子的大小、形状、溶解度、等电点、亲疏水性以及与其它分子的亲和性等性质建立起来的。
目前主要的纯化方法有浓缩沉淀法，层析和电泳技术。
重组蛋白质在分离纯化的过程中，必须维持一定的浓度和生物活性形式，以及防止被降解。
因此从生物体中有效分离纯化重组蛋白质一直是个难题。
90 年代以来,国内外许多科学工作者在蛋白质分离纯化技术和工艺上进行了大量的研制和开发,将原有的纯化技术水平提高到一个新的高度。
本文将简单介绍一些传统的分离纯化方法，并介绍近10 年来重组蛋白分离纯化中的新进展和一些新出现的技术。
1 沉淀分离技术1.1 盐析法其原理是蛋白质在高浓度盐溶液中，随着盐浓度的逐渐增加，由于蛋白质水化膜被破坏、溶解度下降而从溶液中沉淀出来。
重组蛋白转染实验步骤
重组蛋白转染实验步骤
重组蛋白转染实验的步骤包括以下几个部分：
1.重组蛋白的表达和纯化：首先，通过基因工程技术将目的基因克
隆到表达载体中，并在适当的宿主细胞中进行表达。
表达出的重组蛋白需要进行纯化，通常采用亲和层析、离子交换层析等方法进行分离纯化。
2.重组蛋白的转染：将纯化后的重组蛋白导入到细胞中，常用的转
染方法包括磷酸钙法、电穿孔法、脂质体法等。
转染时需要优化转染条件，如蛋白质浓度、转染时间、转染温度等，以提高转染效率和细胞存活率。
3.细胞培养和观察：将转染后的细胞放置在适当的培养条件下进行
培养，观察细胞的生长和形态变化。
可以通过荧光显微镜、免疫荧光等技术检测重组蛋白在细胞内的表达和定位。
4.数据分析：对实验数据进行统计分析，比较不同处理组之间的差
异，并评估重组蛋白对细胞生长、凋亡等生物学过程的影响。
需要注意的是，重组蛋白转染实验需要遵循相关的实验室安全规定，如穿戴防护服、手套等个人防护措施，以避免实验操作过程中可能产生的危险。
同时，实验前需要进行充分的文献调研和实验设计，确保实验的科学性和可行性。
重组蛋白 工艺流程
重组蛋白工艺流程
重组蛋白工艺流程：
目标基因的扩增。
首先，需要设计引物，这些引物应避开目标蛋白的跨膜区和二级结构，如选择N端或C端的序列。
这些引物的设计结合了目标蛋白的结构信息和基因信息，并通过第三方公司合成。
插入克隆载体。
利用PCR技术，根据目标蛋白的特异表达组织，使用设计的引物进行PCR扩增，然后进行酶切和连接，将目的片段与载体结合。
亚克隆到表达载体中。
将连接好的目的片段转化到感受态细胞中，如大肠杆菌，并进行挑菌验证，通过PCR和琼脂糖凝胶电泳来确认目的片段是否成功插入载体。
蛋白表达。
在特定的条件下，如诱导剂的存在，将重组载体转化到宿主细胞中，如大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞或杆状病毒-昆虫细胞系统，进行蛋白的表达。
蛋白的鉴定和纯化。
通过SDS-PAGE和western blot或荧光等方法进行蛋白的鉴定，由于载体中通常包含标签（如His标签），可以使用特定的纯化方法，如镍柱纯化，来分离和纯化重组蛋白。
质量检测和保存。
纯化后的蛋白会进行冻干处理，并进行常规的蛋白质实验验证其分子量和纯度，纯度通常需要超过95%。
通过测试后，蛋白会被储存。
基因工程重组蛋白的分离纯化放映
质的衍生物为载体，在某一 pH 条件下，这些 载体带有正电荷或负电荷，当待分离蛋白质分 子通过载体时，离子交换使蛋白质分子分离纯
机械强度大、柱效高、孔径和颗粒大小 易于控制，但应用范围窄
不能进行快速淋洗，且分离时间长，易造 成生物 分子的变性、失活
离子交换层析是发展最早的层析技术之一， 目前已成为蛋白质分离纯化最常用的手段
• 包括允许杂质种类和最大允许含量，特殊 杂质种类和最大允许量。
• 以及杂质对使用的影响、产品剂型、贮存 稳定性等。
2021/4/8
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三．蛋白质分离纯化应遵顺的原则
①具有良好的稳定性和重复性。尽量不变或少受发酵工艺、条件及原材料来源的影响， 使产品规格统一。必须明确严格控制的步骤和技术，以及允许的变化范围。 ②步骤之间尽量能衔接，减少工艺的步骤，同时工艺与设备也要相互适应，一般分离 原理相同的技术在工艺中不要重复使用，既可减少周期，又能提高纯度和得率。 ③技术条件要温和，温度低，PH值适中，能保持目的产物的生物活性。 ④工艺过程中要尽可能少用试剂，以免增加分离纯化步骤或干扰产品质盆。 ⑤周期尽量短，因稳定性差的产物随工艺时间增加，收率、质量会下降。 ⑥目的蛋白质选择性好，能从复杂的混合物中将目的产物有效地分离出来，达到较高 纯化倍数。 ⑦工艺和技术必须快速高效、收率高、易操作、对设备条件要求低、能耗低。 ⑧具有较高的安全性。在选择处理技术，工艺和操作条件时，要确保去除有危险的杂 质，保证产品质量和作用安全以及生产过程的安全，药品生产必须保证安全、无菌、 病毒、热原。
盐析法是粗分离蛋白质的重要方法之一，
常用硫酸钠、氯化钠、磷酸钠和硫酸铵 等中性盐。硫酸钠具有化学性质稳定、 溶解度大等优点，现在所指的盐析法实
该法受蛋白质浓度、离子强度、盐的性质、上述两种方法分离纯化蛋白质后，都要采
简答重组蛋白的生产流程
简答重组蛋白的生产流程
重组蛋白的生产流程是基因工程中一项令人振奋的技术，目前已被广泛用于药物发现，疾病诊断，抗体生产等领域。
重组蛋白的生产主要分为四个步骤：设计、合成、重组和表达。
第一步是设计。
在这一步，分子生物学家和药物研究员根据其工作的需求，设
计具有现代生物学方法，诸如结构预测、物种关系和其他遗传变体，生成重组蛋白的基因构建。
第二步是合成。
这步是用不同的生物材料来生产新的基因。
最常用的技术是多
聚体PCR，它使用法律的合成反应来从现有的原序列中切割出设计好的重组蛋白基因。
第三步是重组。
在这一步，研究员将合成好的基因携带载体质粒中，从而使它
在一个细胞里被插入。
第四步是表达。
得到重组的基因后，重组蛋白就被按预期的方式在体外表达了。
表达通常会涉及到控制基因及细胞环境条件，确保蛋白质表达质量优良，质量最终需要检测验证。
重组蛋白的生产流程就是上面所描述的。
每个步骤都需要精准的安排，特别是
设计和合成，它们的不断改进可以使重组蛋白的生产变得更加容易。
重组蛋白纯化概述
重组蛋白纯化概述蛋白的分离纯化是生物工程下游阶段一个比较重要的部分，尤其在基因工程重组蛋白的分离纯化中，上游过程的许多因素会直接影响到下游蛋白的分离，充分利用上游对下游的影响，对蛋白的纯化做一个全面的考虑和整体的设计。
是否带有亲和标签，His标签，GST标签等，不同的亲和标签选择不同的纯化方案；可能是可溶性表达，可能形成包涵体，可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤，而包涵体易于分离，纯度较高，但回收具有生物活性的蛋白却变的相当困难，需要对聚集的蛋白进行变复性，通常活性蛋白的得率比较低；是否对宿主细胞具有毒性，从而选择抗毒性的表达系统；怎样选择表达系统，是大肠杆菌表达系统，酵母表达系统还是CHO细胞表达系统，不同的表达系统和培养方法显著影响下游的处理过程，目标蛋白表达的定位（胞内、细胞内膜、周质空间和胞外），蛋白表达的量都依赖于所选择的表达系统；蛋白的化学性质，是否容易被蛋白酶降解，是否会和一些金属离子，化学成分发生反应；蛋白的物理性质，是否对温度敏感等。
从蛋白基因的获取，蛋白基因的克隆，蛋白的表达，做好一个整体的规划，将对纯化工作的方便快捷高效带来关键的影响。
基因工程构建的纯化标记有很多，通过改变 cDNA在被表达的蛋白的氨基端或羧基端加入少许几个额外氨基酸，这个加入的标记可用来作为一个有效的纯化依据。
GST融合载体，蛋白A融合载体，含组氨酸标记（Histidine-tagged）等，不同亲和标签的蛋白有不同的纯化方案。
一．含组氨酸标记（Histidine-tagged）重组蛋白的纯化（一）选择亲和标签时需要考虑的因素亲和标签与目标蛋白之间的作用是相互的，需要综合的考虑，既要考虑到对目标蛋白结构功能的影响，又要考虑到对标签与其配体亲和作用的影响，以及实际的用途。
（1）亲和标签是否会影响到目标蛋白的结构和功能，大多数情况首选短的多肽标签，这是因为短的肽标签对目标蛋白的结构影响最小，而大的亲和标签可能限制重组蛋白的折叠，影响蛋白质的生物学功能。
重组蛋白纯化SOP
大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化一可溶性蛋白的纯化（一）菌体的破碎1. 仪器与材料：-80℃冰箱；超声波细胞破碎仪；50mM PBS或50mM Tris-HCl pH7.5；50ml 离心管；冷冻高速离心机2.方法2.1反复冻融2.1.1收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。
2.1.2 菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mM PBS 或50mM Tris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH）重悬洗涤一次。
2.1.3 然后按原菌液体积的1/4加入缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂PMSF 和EDTA(带His标签不加)，PMSF终浓度为100μg/ml, EDTA的终浓度为0.2mM （约为58μg/ml）。
取20μl重悬菌液进行电泳，检测蛋白表达的情况（是否表达，是可溶性表达还是包涵体表达）。
2.1.4 将菌液（经检测有表达）在-80度冰冻，室温融解，反复冻融三次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
2.2超声波处理(对超声波及热敏感的蛋白慎用)2.2.1 将反复冻融的菌液（必要时可加入1mg/ml 溶菌酶，缓冲液pH＞8.0，加入后需静置20min），进行超声破碎，超声条件：400W，工作5秒，间隔5秒，重复一定次数，直至菌体溶液变清澈为止。
2.2.2 取少量经超声破碎后的菌液，10000rpm离心10分钟，分别对上清和沉淀进行检测，并用全菌作为阳性对照，检测菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。
注意事项：（1）超声破碎具体条件可根据实验情况而定，要掌握好功率和每次超声时间，降低蛋白被降解的可能。
（2）功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，应保持在4度左右，超声时保持冰浴。
（3）菌体破碎后总蛋白浓度的测定可用Bradford 法或者紫外吸收法。
（4）可通过SDS-PAGE 电泳观察菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。
大肠杆菌重组蛋白纯化步骤
大肠杆菌重组蛋白纯化步骤《大肠杆菌重组蛋白纯化步骤》
嘿，朋友们！今天咱们来聊聊大肠杆菌重组蛋白纯化的那些事儿。
这事儿听起来好像挺复杂，其实一步一步来，也没那么难理解。
然后呢，把收集到的大肠杆菌给弄破，让里面的蛋白能跑出来。
这就好比打开一个装满宝藏的盒子，得打破外面的壳儿才能拿到宝贝。
可以用超声破碎或者化学试剂啥的来帮忙，把细胞壁和细胞膜打破，让蛋白能自由活动。
沉淀下来的蛋白还不够纯呢，还得再进一步提纯。
这时候可以用层析的办法，就像过筛子一样，不同大小、性质的东西会在不同的地方被拦住或者通过。
比如说凝胶过滤层析，根据蛋白的大小来分开；离子交换层析呢，就根据蛋白带电的情况来筛选。
弄完这些，还得看看咱们提纯的蛋白纯不纯。
这就像是检查我们挑出来的珍珠是不是真的完美无瑕。
可以用 SDSPAGE 电泳这样的方法，看看蛋白的条带是不是单一的，要是单一的，那恭喜啦，咱们的蛋白纯化得不错！
整个过程里，每一步都得小心操作，就像呵护小宝宝一样。
温度、酸碱度这些条件都得控制好，不然蛋白可能就不开心，质量就不好啦。
其实大肠杆菌重组蛋白纯化说简单也简单，说复杂也复杂。
只要咱们有耐心，一步一步稳稳地来，总能得到咱们想要的纯纯的蛋白。
多做几次，熟练了，也就觉得没那么难啦！大家加油，相信都能搞定这个小挑战！。
以包含体形式表达的基因重组蛋白的纯化策略
以包含体形式表达的基因重组蛋白的纯化策略点击：112 添加时间： 2007-7-27 9:29:25 分离纯化以包含体形式表达的基因重组蛋白的步骤为：细胞破碎→包含体洗涤→包含体变性→蛋白复性→层析纯化。
一、包含体的洗涤：纯化以包含体形式表达的基因重组蛋白，包含体的洗涤至关重要，实验室最常用的破碎细胞的方法是超声破碎，超声处理时，DNA被切断无需再加DNA酶I，超声时产生大量的热，需在冰水浴中间断进行，一般选择超声强度和次数与包含体表达状况有关，表达量高，包含体致密的可以反复多次超声，和多次用超声缓冲液吹洗，8000－10000 rpm/min 10min弃上清，留取沉淀；对于表达量低，包含体不够致密的，在洗涤时就应注意，超声条件要温和，离心速度要提高12000－15000rpm/min 10－15min，必要时可以加入1－5％的TritonX－100和1－4M尿素浸泡过夜，或进行磁力搅拌以增加洗涤强度和净度。
二、包含体的变性常用的变性剂有8M尿素、6M盐酸胍、SDS。
尿素因价格低廉、呈电中性，变性条件温和，稀释复性后可以直接过离子交换剂进行纯化，常作为包含体变性剂的首选。
盐酸胍是强变性剂，复性时易出现沉淀，影响回收，且复性液中必须透析除净盐酸胍后，方可进行离子交换层析分离，不作首选；SDS与蛋白形成带负电的阴离子复合物，并与阴离子交换剂有强吸附，与阳离子交换剂不结合，更致命的弱点是常常会影响蛋白质的生物学活性，不常使用。
变性条件的选择，包含体变性完全与否直接影响进一步的复性，因此包含体的变性一定要完全。
对于易变性的包含体，室温放置或37℃1－3hr，甚至过夜变性，不易变性的包含体，可选择60℃3hr变性。
对于含有二硫键的蛋白质，为了变性完全，使二硫键完全打开，还应加入还原剂ß－ME和DTT。
三、蛋白质的复性蛋白质复性的最大问题，是在复性过程中形成中间体和多聚体，中间体阻碍作用大的使蛋白质正确折叠困难，复性就困难；阻碍小或无阻碍的容易复性。
带有His标签重组蛋白的纯化步骤
带有His标签重组蛋白的纯化步骤一、实验试剂Bind Buffer、Elution Buffer（500mM咪唑洗脱液）、20mM咪唑洗液、250mM咪唑洗脱液（目的蛋白洗脱液）、待纯化样品（含Vc蛋白）二、实验设备和材料填料（Ni SepharoseTM6Fast Flow）、纯化柱（带有滤膜）、可调节流速的塞子、500mL塑料瓶（正面经剪裁，配备20ml注射器管）、1L移液枪及相应枪头、100µL移液枪及相应枪头、10mL EP管或50mL离心管及相应板架、2mLEP管和1.5mL EP管及相应板架、冰盒；三、操作步骤（一）样品准备：（1）重组表达菌加IPTG后经低温（16˚C，摇速150rpm～180rpm）诱导表达8～16h，10000rpm离心5min，弃去上清（Amp＋LB）；（2）用PBS或Bind Buffer洗一次（重悬后在离心），加PBS或Bind Buffer （1/10的原上清体积量）重悬；（3）然后在冰水混合合物中超生破碎（工作时间5s，间隙时间5s，1个循环99次，一般6mL菌液1个～1.5个循环即可）（4）超声破碎后12000rpm（或10000g）4˚C离心10min，用5mL注射器小心吸取上清经0.45µm滤器过滤到干净的10mL EP管内（每管7mL）备用（如无需立即纯化，可暂存于-80˚C冰箱保存，使用时提前取出放冰上解冻）。
（二）装柱取填料2mL加入纯化柱中（可以先加2mL超纯水，用Marker笔标出位置），用超纯水洗5～7次（此步骤不需控制流速），除去储存液中的酒精，每次7mL。
（三）结合（1）用Bind Buffer洗3次（过柱时，用可调节流速的塞子将流速调至5s左右滴一滴的速度，下同），每次7mL，平衡柱子；（2）堵住下口，吸取7mL样品（使用用0.45µm滤器过滤；同时取100µL样品备用，SDS-PAGE鉴定时使用，下同）加入柱中，堵住上口，旋转柱子，使填料（镍柱）与样品充分混匀，4˚C垂直静置20～30min后（此时填料已沉到底部），打开上、下柱口，控制流速，回收滤液（滤液可取样100µL作对照），然后用4mL Bind buffer洗一次；（3）重复上一步骤2～3次；（4）打开上、下柱口，控制流速，收集滤液并取100µL样品取样备用；（5）用Bind buffer洗5次，每次4mL。
蛋白质重组表达过程
蛋白质重组表达过程
蛋白质重组表达是指将外源基因插入宿主细胞中进行蛋白质的高效表达，常用的表达宿主包括大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。
蛋白质重组表达的过程通常包括以下步骤：
1. 获取目标基因：通过DNA克隆技术，将目标蛋白质的基因序列从源生物中扩增得到。
2.构建表达载体：将目标基因插入到合适的表达载体中。
表达载体通常包括启动子、转录终止子和选择性标记基因等。
3.转化宿主细胞：将表达载体导入宿主细胞中，常用的方法有化学方法、电穿孔法和细胞感染法等。
4.筛选重组细胞：利用选择性培养基，筛选出含有目标基因的重组细胞。
5.优化表达条件：通过调控培养条件、温度、培养基组分等方法，优化蛋白质表达水平。
6.蛋白质纯化：利用亲和层析、柱层析和电泳等方法，从细胞裂解液中纯化目标蛋白质。
7.蛋白质鉴定和检测：利用酶联免疫吸附测定法、质谱和Western blot等方法，对蛋白质进行鉴定和检测。
通过以上步骤，可以实现外源蛋白质的高效表达和纯化。
基因重组蛋白质的生产与应用
基因重组蛋白质的生产与应用基因重组技术是目前生物制药领域中最为先进的一种技术，其涉及的基本概念是对 DNA 进行基因重组，以得到含有特定基因的DNA 片段，然后将其转移至细胞中进行表达，从而生产出各种蛋白质。
基因重组蛋白质是一种基于分子生物学技术生产的蛋白质，在现代生物技术中得到了广泛应用。
本文将从基因重组蛋白质的生产与应用两个方面进行探讨。
一、基因重组蛋白质的生产基因重组蛋白质的生产过程主要包括以下几个步骤：DNA 克隆、表达、纯化和鉴定。
其中，DNA 克隆是基因重组蛋白质生产的第一步，其目的是将特定基因从细胞或体内分离出来，并放进载体 DNA 中，构建成重组 DNA。
表达是指将重组 DNA 通过转染或转化等方式引入表达细胞中，在表达细胞中进行基因表达，并产生蛋白质。
纯化是针对蛋白质的特异性分离与提纯，鉴定则是对蛋白质进行结构和活性的鉴定。
二、基因重组蛋白质的应用基因重组蛋白质具有广泛的应用价值，不仅在医疗、生物制药和生物科学研究方面发挥作用，也在农业、环境保护等领域得到应用。
1. 医疗应用基因重组蛋白质在医疗领域中得到了广泛的应用，主要包括以下方面：(1) 抗体药物基因重组抗体药物是目前生物制品市场份额最大的药物之一。
由于人体自身产生的抗体通常难以在足够的量中获得，因此基因重组技术可以使可大规模生产抗体，以治疗疾病。
(2) 疫苗基因重组技术还可以制备疫苗，例如一些病毒蛋白质可以以基因重组的方式大量生产，然后用于生产疫苗。
(3) 诊断工具基因重组蛋白质可作为诊断工具，例如人重组 IL-6 可用于测定血液中癌细胞的生长状态，以监测癌症的病情。
2. 生物制药应用生物制药是指利用生物技术生产的药物，包括抗体药物、生长因子、细胞因子等。
基因重组蛋白质在生物制药领域中的应用也非常广泛：(1) 血液治疗基因重组技术可以制备成一些血液治疗所需的蛋白质，既有红细胞增生素、IL-2 等生长因子，也有治疗贫血和白血病的 EPO 和白细胞回收素等。
基因重组技术制备重组蛋白
基因重组技术制备重组蛋白在生物学领域中，基因重组技术是一项非常重要的技术，它可以帮助科学家们将不同的基因组合起来制造出人工合成的蛋白质，这种制造方法叫做基因重组蛋白制造法。
基因重组蛋白的制备方法可以应用在医学领域中，例如生产药品、生产诊断试剂、制造疫苗等。
一、基因重组技术的基本原理基因重组技术就是将不同的基因从不同的实体中提取出来，并将这些基因重新组合，生成一个新的DNA序列，将这个新的DNA序列植入到另一个细胞中。
其中的难点就在于如何将新的DNA序列精确插入到另一个细胞中。
基因重组制备重组蛋白的过程，分为三个主要的步骤。
第一步是提取目标基因。
科学家们可以通过转录RNA和反转录DNA的技术，从DNA中提取出目标基因，这是制备重组蛋白的第一步。
第二步是将目标基因植入到表达载体中。
表达载体是一个能够承载新的DNA序列并将其表达出来的细胞。
将目标基因植入到表达载体中，就是为了让这个基因被表达出来，并在表达的基础上生产出重组蛋白。
在最后一步，科学家们将表达载体与宿主细胞并列在一起，让载体表达新的基因，这样新的蛋白质就会被制造出来。
二、制备重组蛋白的应用制备基因重组蛋白的应用非常广泛。
其中最常见的就是用基因重组技术来生产药品。
重组的蛋白质能够用于制造多种种类的药物，例如一些生长因子，以及用于治疗某些癌症的药物等。
除此之外，重组的蛋白质还能够用于生产诊断试剂。
目前，基于重组蛋白制备出的诊断试剂使用非常广泛，可以用于诊断多种疾病，并且能够改善疾病的治疗效果。
还有一种重要的应用就是基于重组蛋白制造出有效的疫苗。
这种制备方式被广泛应用于制造疫苗的过程中，已经成为疾病预防的重要工具。
例如，新冠病毒疫苗和流感疫苗是基于基因重组技术制备出来的一种疫苗。
这些疫苗制造方式不仅安全可靠，同时也能够快速发展，用于抗击突然出现的疫情。
三、基因重组蛋白的优缺点通过基因重组技术制备蛋白对人类的医学予以了不可估量的贡献。
由于这种方法限制较少，且制备的蛋白质有较高的生物活性，并且往往具有高效的药理学效应，因此能够更准确，也更安全的治疗人体内的疾病。
基因工程的下游技术重组蛋白的表达、纯化和分析
2. 亲和层析柱的安装 把层析柱固定在铁支架上，柱下端出 口封闭。加入少量的无离子水，排去下端 的空气泡。取出20%乙醇浸泡的螯合凝胶 4mL到烧杯中，加入少量的无离子水制成 糊状，沿着贴紧柱内壁的玻璃棒把糊状凝 胶倒进柱内，打开下端的排水口，让亲和 凝胶剂随水流自然沉下。亲和层析剂为 45mL。
3. 1#：接50μL空载工程菌（含pUC18）过夜培 养物，25-28℃培养10 h-12h； 2# ：接 50μL 重组菌（含 pGFPuv ）过夜培养 物，25-28℃培养10 h-12h； 3#：接50μL重组菌（含pGFPuv ）过夜培养 物， 37℃培养至 O.D600 约为 0.5 （约 3h-4h) ， 然后加入20%葡萄糖50μL至终浓度为0.2%， 及100mM IPTG 5μL至终浓度为0.1mM，2528℃培养8h-10h或过夜； 6#：接500μL重组菌（含pGFPuv）过夜培养 物， 37℃培养至 O.D600 约为 0.5 （约 3h-4h) ， 然后只加入 100mM IPTG 50μL 至终浓度为 0.1 mM，25-28℃培养8h-10h或过夜。
一．实验目的 了解和掌握IPTG诱导表达的原理。 了解降解物阻遏的现象及其机理。
二．实验原理
操纵子是基因表达的协调单位。通常由2 个以上功能相关的结构基因以及一些调节 序列（如启动子序列、操纵序列等）组成。
乳糖操纵子由三个结构基因 Z 、 Y 、 A 和 操纵序列、启动子、 CAP 结合位点等调 节序列组成。
四．实验仪器
超净工作台、 恒温摇床、离心机等。
五．操作步骤 1. 挑取含pUC18质粒工程菌及含pGFPuv质 粒工程菌单菌落，分别接种于含氨苄青霉 （终浓度为100μg/mL，以下同)的5mL的 LB培养基中，于37℃、250rpm过夜培养 12h-14h至对数生长期。 2. 取 3 支已灭菌的大试管，分别加入 5mL 含 有氨苄青霉素的 LB 培养液，编号为 1# ， 2#，3#，另取一个250mL的灭菌三角瓶， 编号为6#，加入50mL含氨苄青霉素的 LB 培养液。
重组蛋白分离纯化的流程
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纯化重组人血清白蛋白的融合蛋白的方法
纯化重组人血清白蛋白的融合蛋白的方法
纯化重组人血清白蛋白的融合蛋白的方法可以通过以下步骤进行：
1. 培养表达重组人血清白蛋白融合蛋白的宿主细胞，如大肠杆菌（E. coli）。
2. 收集宿主细胞培养物，离心去除细胞残渣。
可以使用低速离心去除大部分细胞，然后使用高速离心去除细胞碎片和聚集物。
3. 使用亲和层析技术来富集含有融合蛋白的物质。
可以利用融合蛋白自身或融合标签（如His标签）与亲和基质（如镍柱或GST柱）的亲和作用进行捕获。
4. 进行洗脱步骤，以去除非特异性结合物质和杂质。
可以使用不同的洗脱缓冲液来控制洗脱条件，如改变pH值、离子强度等。
5. 对洗脱的样品进行浓缩和纯化，可以使用浓缩装置或者离子交换层析柱等纯化方法。
6. 最后使用适当的缓冲液将纯化的融合蛋白调整至所需的浓度和条件。
这些步骤可以根据具体实验室条件和融合蛋白的特性进行相应的调整和优化。
重组蛋白的分离纯化
疫苗: 大肠杆菌, 酵母, 大多数沿用细胞培养产物进行灭毒
单抗生产: 杂交瘤细胞 工业酶生产: 各种微生物
重组蛋白分离纯化方法选择的基因原则
针对不同的产物表达形式采取不同的策略 针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型 多种分离纯化技术的联合运用 合适分离纯化介质的选择
1、重组载体的构建
特导引物设计，以pBV220-ALR质粒为模板扩增目的条带 构建酵母表达重组质粒，转化毕赤酵母GS115 重组蛋白的表达及鉴定 rhALR的纯化
菌液上清经低盐透析后，超过DEAESepharose FF柱的饱和吸附量上样，洗脱组 分脱盐后再上DEAE-Sepharose FF 柱，然后 再用Sephades G-75 柱进一步纯化。
这个末端突出通常由大约20个氨基酸组成， 并且在内质网中从成熟蛋白上剪切下来。
人们已经利用含有合适重组质粒的酵母细 胞分泌了大量的非酵母多肽，而且绝大多 数情况下都用到了a-因子信号序列。
外源基因的表达产物，通过运输或分泌的方式穿过细胞 的外膜进入培养基中，即为分泌型外源蛋白。
外源蛋白以分泌型蛋白表达时，须在N端加入15～30个 氨基酸组成的信号肽（signal peptides）序列。信号肽N端的 最初几个氨基酸为极性氨基酸，中间和后部为疏水氨基酸， 它们对蛋白质分泌到细胞膜外起决定性作用。当蛋白质分泌 到位于大肠杆菌细胞内膜与外膜之间的外周质时，信号肽被 信号肽酶所切割。
• Moreover , gel filtration is more generic, can be performed in any buffer condition, and can be used to resolve the oligomerization state of the target protein.
基因重组蛋白纯化流程
01.11周总结一、本周工作01．0520T—TB23蛋白处理1、分析昨天20T—TB23蛋白跑小胶的情况，硫胺分析上清基本无目的蛋白，因此放弃处理上清；2、沉淀中目的蛋白比较明显，观察小胶2M尿素溶解上清中目的蛋白较少，6M、8M溶解的沉淀中目的蛋白量较少，因此考虑用2M尿素去杂蛋白，用6M尿素洗目的蛋白；3、用正常Buffer将沉淀再洗两遍，用15ml/P Buffer溶液将沉淀吹起，超声2min,12000rpm 离心15min,再重复一遍；4、用30ml 2M尿素溶液（含20mmol/L Tris--Hcl）将沉淀吹起，超声2min,12000rpm离心15min，弃上清；5、用15 ml 6M尿素溶液将蛋白吹起，超声2min,冰箱中放置2h，超声2min,12000转离心30min;6、将上清倒至一洗净的烧杯中，取上清测蛋白浓度，往上清中加7.5ml的5*loadingbuffer,取40微升跑粗抗胶，其余放到冰箱等待上大胶；7、将大胶夹好后，用注射器往每板大胶中加3微升样品，进行电泳；20T—I56II12菌体回收1、该蛋白共两瓶，平均装入3只大离心管中，7000rpm离心3min；2、去上清用20ml裂解液吹起，超声破碎3*4min,观察蛋白溶液显白色，预计为沉淀表达;3、12000rpm离心25min，去上清，沉淀放冰箱明天处理；01.0620T—TB23蛋白回收：1.将跑20T—TB23蛋白的凝胶从电泳槽上拆下，观察凝胶上的蛋白带；2、用手术刀轻在蛋白带上画一条线，描出蛋白的前带；3、用手术刀以垂直于蛋白带的方向在凝胶中间切下一条宽1cm左右的条带，在条带的末尾用手术刀切成不同的形状，以便区分，将凝胶条放到氯化铜染色液中染色；4、染色完成后根据凝胶条上目的蛋白染色的宽度确定凝胶上目的蛋白的宽度与位置；5、根据染色后目的蛋白的分布，确定切胶的宽度和上让、下让的宽度，用手术刀将目的蛋白条从凝胶上切下，用蒸馏水冲洗几遍；6、将含目的蛋白的凝胶条放到透析袋中扎紧袋口，在放1*SDS缓冲液的电泳槽中电洗脱2H；7、电洗脱后收集目的蛋白溶液，稀释12倍后，紫外分光光度计测浓度，280nmOD值为0.165,260nmOD值为0.098，C=（0.165*1.45—0.098*0.74）*12=2.0；20T—I56II12蛋白处理：1用正常Buffer将沉淀再洗两遍，用15ml/P Buffer溶液将沉淀吹起，超声2min,12000rpm离心15min,重复两遍；2、用30ml 2M尿素溶液（含20mmol/L Tris--Hcl）将沉淀吹起，超声2min,12000rpm离心15min，弃上清；3、查以前的实验记录，用10.4ml 8M尿素溶液将蛋白溶解，超声2min,冰箱中4度放置2h，超声2min,13500转离心30min;4、将上清倒至一洗净的烧杯中，取上清稀释24倍测蛋白浓度，280nmOD值为1.041,260nmOD值为0.579，C=（1.041*1.45—0.579*0.74）*24=25.9；往上清中加2.6ml的5*loadingbuffer,取40微升于1.5ml 离心管中跑粗抗胶，其余放到冰箱等待上大胶；7、将大胶夹好后，观察粗抗胶的染色情况，用注射器往每板大胶中加3微升样品，共加4板，进行电泳01.07协助回收20T—I56a、20T—I56、20T—I56bII12蛋白1．准备好切胶所需的玻璃板，手术刀、镊子等器具，用纯水洗净后整齐摆放在切胶台上（不能直接接触切胶台，要用干净纸巾垫好）；2、将凝胶板从电泳槽上拆下，观察凝胶上的蛋白前带，用手术刀沿前带轻轻描一条线；3、在垂直于蛋白带的方向在凝胶中间切下一条1cm 左右的凝胶条放在5%Cucl2溶液中染色，染色过程中注意轻轻摇晃染色盒；4、染色后观察目的蛋白在凝胶上的位置、确定切胶的宽度；5、用手术刀将目的蛋白带切下，切胶过程中注意不要产生碎渣，并用纯净水将切下的凝胶条冲洗干净；6、将切下的凝胶条放在透析袋中，加适量缓冲液扎紧袋口，在电泳槽中电洗脱2h之后，反插导线洗脱5min；7、洗脱后回收透析袋中的蛋白溶液，稀释12倍后测蛋白溶度，放冰箱4°C保存。
重组三型人源化胶原蛋白操作流程
重组三型人源化胶原蛋白操作流程重组三型人源化胶原蛋白是一种重要的生物材料，具有广泛的应用价值。
下面将介绍重组三型人源化胶原蛋白的操作流程。
一、胶原蛋白的提取与纯化1. 采集胶原蛋白来源的组织，如皮肤、骨骼等，通过切割、研磨等方式将组织打碎。
2. 将打碎的组织用酸性溶液（如酸性乙醇）浸泡，以去除非胶原蛋白成分。
3. 将浸泡后的组织用蛋白酶等酶类进行消化，以分解胶原蛋白。
4. 将消化后的混合液进行离心，以分离出胶原蛋白。
5. 通过溶剂沉淀、离子交换层析等方法对胶原蛋白进行纯化，去除杂质。
二、基因重组与表达1. 从人体组织中提取胶原蛋白的编码基因序列。
2. 将胶原蛋白的编码基因序列克隆到表达载体中，如质粒。
3. 将质粒转化至宿主细胞中，如大肠杆菌。
4. 利用细菌宿主细胞的复制与表达系统，使质粒中的胶原蛋白基因得以表达。
5. 收集表达产物，如细菌液或细胞提取物。
6. 利用离心等方式分离出重组胶原蛋白。
三、重组胶原蛋白的修饰与组装1. 对重组胶原蛋白进行修饰，如糖基化、磷酸化等，以增加其稳定性和生物活性。
2. 将修饰后的重组胶原蛋白进行组装，形成三维结构。
3. 利用交联剂等方法，使重组胶原蛋白的纤维结构更加稳定。
四、重组胶原蛋白的应用1. 医学领域：作为组织工程支架材料，用于修复组织缺损，如皮肤、骨骼等。
2. 美容领域：作为填充物，用于填补皮肤纹理和皱纹，增加皮肤弹性。
3. 药物输送系统：将药物包裹在重组胶原蛋白纤维中，实现药物的缓释和靶向输送。
4. 生物材料领域：作为生物胶粘剂，用于组织粘合和修复。
总结：重组三型人源化胶原蛋白的操作流程包括胶原蛋白的提取与纯化、基因重组与表达、重组胶原蛋白的修饰与组装以及应用。
通过这些步骤，可以获得高纯度的重组胶原蛋白，并应用于组织工程、美容、药物输送等领域，具有广阔的应用前景。
希望本文能对重组三型人源化胶原蛋白的操作流程有一个清晰的了解。
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01.11 周总结一、本周工作01．0520T—TB23 蛋白处理1、分析昨天20T—TB23 蛋白跑小胶的情况，硫胺分析上清基本无目的蛋白，因此放弃处理上清；2、沉淀中目的蛋白比较明显，观察小胶2M 尿素溶解上清中目的蛋白较少，6M 、8M 溶解的沉淀中目的蛋白量较少，因此考虑用2M 尿素去杂蛋白，用6M 尿素洗目的蛋白；3、用正常Buffer 将沉淀再洗两遍，用15ml/P Buffer 溶液将沉淀吹起，超声2mi n,12000rpm 离心15mi n,再重复一遍；4、用30ml 2M 尿素溶液(含20mmol/L Tris--Hcl) 将沉淀吹起，超声2min,12000rpm离心15min，弃上清；5、用15 ml 6M尿素溶液将蛋白吹起，超声2min,冰箱中放置2h，超声2min,12000转离心30min;6、将上清倒至一洗净的烧杯中，取上清测蛋白浓度，往上清中加7.5ml 的5*loadingbuffer, 取40 微升跑粗抗胶，其余放到冰箱等待上大胶；7、将大胶夹好后，用注射器往每板大胶中加3 微升样品，进行电泳；20T—I 56II12 菌体回收1、该蛋白共两瓶，平均装入3只大离心管中，7000rpm离心3min ；2、去上清用20ml裂解液吹起，超声破碎3*4min,观察蛋白溶液显白色，预计为沉淀表达;3、12000rpm离心25min，去上清，沉淀放冰箱明天处理；01.0620T—TB23 蛋白回收：1.将跑20T—TB23 蛋白的凝胶从电泳槽上拆下，观察凝胶上的蛋白带；2、用手术刀轻在蛋白带上画一条线，描出蛋白的前带；3、用手术刀以垂直于蛋白带的方向在凝胶中间切下一条宽1cm 左右的条带，在条带的末尾用手术刀切成不同的形状，以便区分，将凝胶条放到氯化铜染色液中染色；4、染色完成后根据凝胶条上目的蛋白染色的宽度确定凝胶上目的蛋白的宽度与位置；5、根据染色后目的蛋白的分布，确定切胶的宽度和上让、下让的宽度，用手术刀将目的蛋白条从凝胶上切下，用蒸馏水冲洗几遍；6、将含目的蛋白的凝胶条放到透析袋中扎紧袋口，在放1*SDS 缓冲液的电泳槽中电洗脱2H；7、电洗脱后收集目的蛋白溶液，稀释12 倍后，紫外分光光度计测浓度，280nmOD 值为0.165,260nmOD 值为0.098，C=(0.165*1.45—0.098*0.74) *12=2.0；20T—I 56II12 蛋白处理：1 用正常Buffer 将沉淀再洗两遍，用15ml/P Buffer 溶液将沉淀吹起，超声2min,12000rpm 离心15min,重复两遍；2、用30ml 2M尿素溶液(含20mmol/L Tris--Hcl)将沉淀吹起，超声2min,12000rpm 离心15min，弃上清；3、查以前的实验记录，用10.4ml 8M尿素溶液将蛋白溶解，超声2min,冰箱中4度放置2h，超声2min,13500转离心30min;4、将上清倒至一洗净的烧杯中，取上清稀释24 倍测蛋白浓度，280nmOD 值为1.041,260nmOD 值为0.579，C=(1.041*1.45—0.579*0.74) *24=25.9；往上清中加2.6ml 的5*loadingbuffer, 取40 微升于1.5ml 离心管中跑粗抗胶，其余放到冰箱等待上大胶；7、将大胶夹好后，观察粗抗胶的染色情况，用注射器往每板大胶中加3 微升样品，共加4 板，进行电泳01.07协助回收20T—I56a、20T—I56、20T—I56bII12 蛋白1准备好切胶所需的玻璃板，手术刀、镊子等器具，用纯水洗净后整齐摆放在切胶台上(不能直接接触切胶台，要用干净纸巾垫好)；2、将凝胶板从电泳槽上拆下，观察凝胶上的蛋白前带，用手术刀沿前带轻轻描一条线；3、在垂直于蛋白带的方向在凝胶中间切下一条1cm左右的凝胶条放在5%Cucl2溶液中染色，染色过程中注意轻轻摇晃染色盒；4、染色后观察目的蛋白在凝胶上的位置、确定切胶的宽度；5、用手术刀将目的蛋白带切下，切胶过程中注意不要产生碎渣，并用纯净水将切下的凝胶条冲洗干净；6、将切下的凝胶条放在透析袋中，加适量缓冲液扎紧袋口，在电泳槽中电洗脱2h之后，反插导线洗脱5min ； 7、洗脱后回收透析袋中的蛋白溶液，稀释12倍后测蛋白溶度，放冰箱4° C保存。
01. 09破碎分析P4—HB85P25—6蛋白：1、测菌浓度，取4只比色皿往第一个比色皿中用800微升移液枪打入2.4ml纯净水作为对照管，其它几个比色皿中加入 1.6微升纯水后，再加入800微升的菌液混匀，注意每取一个细菌培养液时要更换一次移液枪头，将比色皿放在紫外分光光度计中在600nm波长条件下检测0D值为0.856 ；2、制作大表：取1.5ml菌液于离心管中一―►12000rpm离心2min >吸去上清______ 往离心管中加入40微升水，20微升3*loadingbufer，注意吹匀-沸水煮10min,12000rpm离心6min -------- 去上清液5微升跑小胶观察蛋白表达情况；3、破碎，将2瓶P4—HB85P25-6培养基平均装在3只大离心管中，7000rpm离心3min后倒掉上清，倒扣在纸巾上吸干水分---------------- ►用20ml的裂解液将沉淀吹起，超声4min*3,每次间隔3min, ;4、离心，静置30min后，12000rpm离心25min,将上清倒置另一离心管中；5、将上清液进行5%--50%SAS浓度梯度分析，发现所有上清都有沉淀，于是再增加2%、3%、7%、8%的SAS 浓度梯度进行分析；5、加不同浓度的SAS后静置30min,12000rpm离心6min,观察各SAS浓度下沉淀出现情况，发现2%SAS条件下就有沉淀出现；6、由于该蛋白对SAS很敏感，选择用SAS为2%、3%、5%的样做上清和沉淀样，用SAS为7%、8%、10%、15%、20%、25%的样做上清样，做样时先取相应数量的 1.5ml离心管，往管中加入10微升的3*loadingbuffer，并在管上标明样品名称，再加入20微升的相应样品并混匀；7、跑小胶，将预先制好的13%小胶夹到电泳槽上，按大表，总沉淀，总上清，2%、3%、5%沉淀样，2%、3%、5%、7%、8%、10%、15%、20%、25%上清样的顺序上样，其中总沉淀上7.5微升，上清样按不同浓度对应的量上样，其它上5微升，注意每次上样时要将针清洗3遍；8、电泳，上样完毕后用导线盖将电泳槽连到电泳仪上，调节电压100V 左右，样跑平后调节电压200V,直到指示剂跑到板底，结束电泳，将小胶拆下染色分析。
01.10P4—HB85P25—6蛋白处理1、根据跑粗抗胶的情况确定蛋白的处理方式为5%SAS直沉；2、用移液枪测得粗抗体积为20.8ml,加入饱和SAS的体积为V= (20.8*5%) (1—5%) =1.09ml,在冰浴的条件下将SAS加入，注意加入时速度不能太快；3、4° C环境放置30min;4、12000rpm 离心25min,去上清；5、参照以前的实验记录，用8ml 20mM PB将沉淀吹起；6、配置600ml 20mMPB+200mMNacl平衡溶液(三个蛋白共用)；7、准备一个10ml 柱子，加3ml 介质，加介质后让保护介质的酒精滴下，用6ml 平衡液洗5 次，每次在柱子中静置2min ，注意每次洗柱子的过程中不要让介质太干，以刚刚好液体滴完为止;8、将吹起的蛋白溶液12000rpm 离心15min;9、离心完后将上清加到柱子上亲和吸附1h（4°C 条件下）,注意此时柱子要盖上盖子，以防污染；10.用平衡液做稀释液配置100ml 200mM 咪唑+20mMPB+200mMNacl 洗脱液，准确量取咪唑200*100*68.8/1000*1000=1.376g, 用200ml 平衡液溶解，再量取8ml 洗脱液，用平衡液定容到80ml 配成20mM 咪唑+20mMPB+200mMNacl 洗杂液；11.将亲和柱从冰箱中取出，在室温下静置5min 左右后，收集从柱子中流出的穿透液；12.往柱子中加入6ml 平衡液，静置2min, 放掉平衡液并收集1ml 左右液体做样，用同样方法平衡9 次收集第1 次，第5 次，第9 次的平衡液做样（注意每次加平衡液后需要轻轻搅动一下柱子，但不要太猛烈以防吸附的蛋白脱落）；13.洗杂：往柱子中每次加入6ml 的平衡液，洗杂5 次，每次停留2min, 用5ml 离心管收集洗杂液；14、洗脱：往柱子中加入2ml、2ml 、1.5ml 、1.5ml 、2ml 、2ml 的洗脱液，每次停留10min, 收集每次洗脱液；15、将粗抗、总上清、穿透液、加样后收集的平衡液、洗杂液、洗脱液做样跑13%的小胶分析蛋白分布情况；01.11LXLMA29蛋白破碎分析：1.将菌溶液稀释3倍，600nm测吸光度值，P4—SD--SH 7 0.553、32E—TO100.675 、LXLMA290.871 ；2、制作大表，取1ml菌溶液，12000rpm离心2min,吸去上清，将沉淀用40微升纯水吹起, 加入20 微升loadingbufer,煮10min,12000rpm 离心10min;3、将菌溶液平均装在大离心管中7000rpm离心3min,去上清，沉淀用10ml/p裂解液吹起；4、将沉淀进行超声裂解,进口超声仪用70%功率，2 瓶培养基超声4min*3, 中间停留2min;5.超声完后，将裂解液倒入离心管12000rpm ，离心25min;6.观察沉淀颜色，如为褐色可能是上清表达，将上清用另一只离心管收集，并做一个总上清样，沉淀用正常buffer 吹起，做一个总沉淀样；7•上清SAS梯度分析，做从10%---50%的硫胺梯度，取上清90、85、80、75、70、65、60、55、50 微升加入10、15、20、25、30、35、40、45、50 微升的饱和SAS静置30min , 12000rpm离心6min ；8•观察沉淀出现的情况，用25%作为中间梯度，SAS浓度小于25%的将上清吸掉，沉淀用20 微升纯水吹起加10 微升3*loadingbuffer 做样，大于25%的取20 微升上清做样，25%的即做沉淀又作上清样；9、按一定的顺序将样品上小胶电泳后，将小胶用考马斯亮蓝染色液染色，再微波加热脱色分析蛋白分布情况；本周学习情况:1. 学习了包涵体的尿素处理过程，以及包涵体性质包涵体是病毒在增殖的过程中，常使寄主细胞内形成一种蛋白质性质的病变结构，在光学显微镜下可见。
多为圆形、卵圆形或不定形。