基因重组蛋白纯化流程

01.11 周总结

一、本周工作

01．05

20T—TB23 蛋白处理

1、分析昨天20T—TB23 蛋白跑小胶的情况，硫胺分析上清基本无目的蛋白，因此放弃处理上清；

2、沉淀中目的蛋白比较明显，观察小胶2M 尿素溶解上清中目的蛋白较少，

6M 、8M 溶解的沉淀中目的蛋白量较少，因此考虑用2M 尿素去杂蛋白，用6M 尿素洗目

的蛋白；3、用正常Buffer 将沉淀再洗两遍，用15ml/P Buffer 溶液将沉淀吹起，超声2mi n,12000rpm 离心15mi n,再重复一遍；4、用30ml 2M 尿素溶液(含20mmol/L Tris--Hcl) 将沉淀吹起，超声2min,12000rpm离心15min，弃上清；5、用15 ml 6M尿素溶液将蛋白吹起，超声2min,冰箱中放置2h，超声2min,12000转离心30min;6、将上清倒至一洗净的烧杯中，取上清测蛋白浓度，往上清中加7.5ml 的5*loadingbuffer, 取40 微升跑粗抗胶，其余放到冰箱等待上大胶；7、将大胶夹好后，用注射器往每板大胶中加3 微升样品，进行电泳；

20T—I 56II12 菌体回收

1、该蛋白共两瓶，平均装入3只大离心管中，7000rpm离心3min ；

2、去上清用20ml裂解

液吹起，超声破碎3*4min,观察蛋白溶液显白色，预计为沉淀表达;3、12000rpm离心

25min，去上清，沉淀放冰箱明天处理；01.06

20T—TB23 蛋白回收：

1.将跑20T—TB23 蛋白的凝胶从电泳槽上拆下，观察凝胶上的蛋白带；2、用手术刀轻在蛋

白带上画一条线，描出蛋白的前带；3、用手术刀以垂直于蛋白带的方向在凝胶中间切下一

条宽1cm 左右的条带，在条带的末尾用手术刀切成不同的形状，以便区分，将凝胶条放到氯化铜染色液中染色；4、染色完成后根据凝胶条上目的蛋白染色的宽度确定凝胶上目的蛋白的宽度与位置；5、根据染色后目的蛋白的分布，确定切胶的宽度和上让、下让的宽度，用手术刀将目的蛋白条从凝胶上切下，用蒸馏水冲洗几遍；6、将含目的蛋白的凝胶条放到

透析袋中扎紧袋口，在放1*SDS 缓冲液的电泳槽中电洗脱2H；7、电洗脱后收集目的蛋白

溶液，稀释12 倍后，紫外分光光度计测浓度，280nmOD 值为0.165,260nmOD 值为

0.098，C=(0.165*1.45—0.098*0.74) *12=2.0；

20T—I 56II12 蛋白处理：

1 用正常Buffer 将沉淀再洗两遍，用15ml/P Buffer 溶液将沉淀吹起，超声2min,12000rpm 离心15min,重复两遍；2、用30ml 2M尿素溶液(含20mmol/L Tris--Hcl)将沉淀吹起，超声

2min,12000rpm 离心15min，弃上清；3、查以前的实验记录，用10.4ml 8M尿素溶液将

蛋白溶解，超声2min,冰箱中4度放置2h，超声2min,13500转离心30min;4、将上清倒至一洗净的烧杯中，取上清稀释24 倍测蛋白浓度，280nmOD 值为1.041,260nmOD 值为

0.579，C=(1.041*1.45—0.579*0.74) *24=25.9；往上清中加2.6ml 的5*loadingbuffer, 取40 微升于1.5ml 离心管中跑粗抗胶，其余放到冰箱等待上大胶；7、将大胶夹好后，观察粗抗胶的染色情况，用注射器往每板大胶中加3 微升样品，共加4 板，进行电泳

01.07

协助回收20T—I56a、20T—I56、20T—I56bII12 蛋白

1准备好切胶所需的玻璃板，手术刀、镊子等器具，用纯水洗净后整齐摆放在切胶台上

(不能直接接触切胶台，要用干净纸巾垫好)；2、将凝胶板从电泳槽上拆下，观察凝胶上的蛋白前带，用手术刀沿前带轻轻描一条线；3、在垂直于蛋白带的方向在凝胶中间切下一

条1cm左右的凝胶条放在5%Cucl2溶液中染色，染色过程中注意轻轻摇晃染色盒；4、染

色后观察目的蛋白在凝胶上的位置、确定切胶的宽度；5、用手术刀将目的蛋白带切下，切

胶过程中注意不要产生碎渣，并用纯净水将切下的凝胶条冲洗干净；6、将切下的凝胶条放

在透析袋中，加适量缓冲液扎紧袋口，在电泳槽中电洗脱2h之后，反插导线洗脱

5min ； 7、洗脱后回收透析袋中的蛋白溶液，稀释12倍后测蛋白溶度，放冰箱4° C保存。

01. 09

破碎分析P4—HB85P25—6蛋白：

1、测菌浓度，取4只比色皿往第一个比色皿中用800微升移液枪打入2.4ml纯净水作为对

照管，其它几个比色皿中加入 1.6微升纯水后，再加入800微升的菌液混匀，注意每取一

个细菌培养液时要更换一次移液枪头，将比色皿放在紫外分光光度计中在600nm波长条件

下检测0D值为0.856 ；2、制作大表：取1.5ml菌液于离心管中一―►12000rpm离心

2min >

吸去上清______ 往离心管中加入40微升水，20微升3*loadingbufer，注意吹匀-

沸水煮10min,12000rpm离心6min -------- 去上清液5微升跑小胶观察蛋白表达情况；3、破碎，将2瓶P4—HB85P25-6培养基平均装在3只大离心管中，7000rpm离心3min后倒掉上清，倒扣在纸巾上吸干水分---------------- ►用20ml的裂解液将沉淀吹起，超声4min*3,每次间隔3min, ;4、离心，静置30min后，12000rpm离心25min,将上清倒置另一离心管中；5、将上清液进行5%--50%SAS浓度梯度分析，发现所有上清都有沉淀，于是再增加2%、3%、7%、8%的SAS 浓度梯度进行分析；5、加不同浓度的SAS后静置

30min,12000rpm离心6min,观察各SAS浓度下沉淀出现情况，发现2%SAS条件下就有沉淀

出现；6、由于该蛋白对SAS很敏感，选择用SAS为2%、3%、5%的样做上清和沉淀样，用SAS为7%、8%、10%、15%、20%、25%的样做上清样，做样时先取相应数量的 1.5ml离心管，往管中加入10微升的3*loadingbuffer，并在管上标明样品名称，再加入20微升的相

应样品并混匀；7、跑小胶，将预先制好的13%小胶夹到电泳槽上，按大表，总沉淀，总上清，2%、3%、5%沉淀样，2%、3%、5%、7%、8%、10%、15%、20%、25%上清样的顺序上样，其中总沉淀上7.5微升，上清样按不同浓度对应的量上样，其它上5微升，注意每

次上样时要将针清洗3遍；8、电泳，上样完毕后用导线盖将电泳槽连到电泳仪上，调节电压100V 左右，样跑平后调节电压200V,直到指示剂跑到板底，结束电泳，将小胶拆下染色分析。

01.10

P4—HB85P25—6蛋白处理

1、根据跑粗抗胶的情况确定蛋白的处理方式为5%SAS直沉；

2、用移液枪测得粗抗体积为20.8ml,加入饱和SAS的体积为V= (20.8*5%) (1—5%) =1.09ml,在

冰浴的条件下将SAS加入，注意加入时速度不能太快；

3、4° C环境放置30min;

4、12000rpm 离心25min,去上清；

5、参照以前的实验记录，用8ml 20mM PB将沉淀吹起；

6、配置600ml 20mMPB+200mMNacl平衡溶液(三个蛋白共用)；