病毒接种、收获尿囊液操作步骤
禽流感病毒中和实验
禽流感病毒中和实验及其他方法（一）实验材料1、中和反应实验材料(1)病毒：）的滴定。
一般为鸡胚尿囊病毒液，进行中和实验前，需要进行病毒滴度（TCID50(2)血清样品包括待检血清和阳性以及阴性对照血清。
人血清实验前需要56℃ 30分钟灭活，动物血清需RDE处理。
－20℃储存，避免多次反复冻融。
(3)MDCK细胞和细胞培养试剂1)MDCK细胞（狗肾上皮细胞）2)MDCK细胞培养液：DMEM+5%牛血清+抗生素，过滤除菌500毫升 DMEM（修饰的Eagles培养基）5.5毫升 100×抗生素（100单位/毫升青霉素+100微克/毫升链霉素）5.5毫升 100×L－Glutamine（2毫摩尔）25.5毫升 56℃、30分钟加热灭活的牛血清3)胰酶 / EDTA(4)其它1)平底96孔微量培养板2)病毒稀释液：DMEM+1%牛血清白蛋白+抗生素，即配即用。
429毫升 DMEM66毫升 7.5%牛血清白蛋白（BSA）5毫升 100×抗生素3)TPCK－胰酶（使用浓度为2微克/毫升）4)固定液：80%的丙酮，即配即用，4℃保存400毫升丙酮100毫升 PBS，PH 7.22、ELISA实验材料(1)抗体1：鼠抗流感病毒甲型核蛋白克隆抗体(2)抗体2：辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(3)洗涤液：PBS+0.05%TWEEN－204升 PBS，PH 7.22毫升 TWEEN－20(4)封闭液：PBS+1%牛血清白蛋白+0.05％TWEEN－20867毫升PBS，PH 7.2132毫升牛血清白蛋白1毫升TWEEN－20(5)底物和底物溶液：常用的辣根过氧化物酶（HRP）所用底物为磷苯二胺（OPD）底物溶液为PH5.0磷酸盐－柠檬酸缓冲液（0.05M）底物和底物溶液：10毫克OPD20毫升柠檬酸缓冲液（含0.015%双氧水）即配即用磷酸盐－柠檬酸缓冲液，PH5.058.8克柠檬酸三钠1升蒸馏水用盐酸调节PH为5.0加0.015%双氧水，（临用前加入）* 如果使用磷酸盐－柠檬酸缓冲液胶囊（Sigma）1个胶囊加入100毫升蒸馏水，临用前配制(6)终止反应液：1N硫酸（28毫升浓硫酸+1升蒸馏水）3、其他细胞培养和酶联免役吸附实验的常用设备和仪器（参照英文讲义）备注：A.以上实验材料购自Gibco,，Hyclone，Dynatech，Kirkegaard&Perry和Sigma 公司，材料编号（CAT#）参照英文讲义。
病毒的鸡胚培养
实验九病毒的鸡胚培养
一、目的
掌握病毒鸡胚接种、收获、HA试验方法和原理
二、实验内容
1、种蛋选择、消毒与孵化：种蛋为健康未免疫ND疫苗、受精率为90﹪以上的新鮮种蛋。
15g高锰酸钾、30mL甲醛/m3熏蒸消毒30分钟，气室向上38.5-39℃孵化，相对湿度60-70%。
每2小时翻番一次。
2、画蛋与打孔：孵化9-11日龄鸡胚，暗室内画出气室边缘和胚头位置。
于胚头一侧气室边缘上方0.5cm处打孔。
3、接种与封孔：NDV Lasota种毒以灭菌生理盐水作一定倍数稀释,尿囊腔内接种0.1ml/胚，以融化的石蜡封孔，继续孵化，不翻蛋。
每日照蛋一次，弃去72h内死亡鸡胚。
至120h全部取出于4℃冰箱过夜。
4、收毒：无菌操作打开气室部位蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜,吸出尿囊液，观察鸡胚肉眼变化。
5、HA效价测定：原理。
1%鸡RBC制备：采取3只青年公鸡血液，抗凝，以生理盐水离心洗涤3次，制成1%RBC悬液。
血凝试验按下表操作。
1 2 3 11 12
稀释倍数212223 (211)
1
振荡混匀15秒，37C感作10-20分钟。
三、实验报告内容
1、病毒鸡胚培养的注意事项。
2、鸡胚尿囊液NDV HA效价结果，原理，并用原理说明HA效
价测定结果含义与意义。
2。
流感病毒的收集与纯化标准操作规
流感病毒的收集与纯化标准操作规程（编号：054）1、目的及适用范围该SOP用来规范流感病毒的收集和纯化标准操作。
2、主要仪器试剂超净工作台、冷冻立式超速离心机（BeckmanXL90）、冷冻台式高速离心机、天平、超速离心管、50mL离心管、0.01 mol/L PBS pH7.4、30%、40%、50%、60%蔗糖3、操作步骤3.1将病毒接种于SPF鸡胚，48 h收集尿囊液以5000 rpm（#3334）离心30 min，取上清液；或者将病毒接种于细胞，待细胞基本病变收取上清。
12000rpm（#3332），离心15min，去上清。
3.2 将上清液以100000g（Ti40）离心2 h，将沉淀物用1 mL 0.01 mol/L PBS pH7.4悬浮，振荡均匀；3.3 加至依次由30%、40%、50%、60%蔗糖制成的密度梯度上，以100000g（SW40）离心2h，取沉淀条带；3.4 取沉淀条带加10倍量PBS悬浮、振匀，再次以100000g （Ti80）离心2 h，取沉淀用200μL 0.01 mol/L PBS pH7.4或20 mM Hepes/20mM Mes/130mM NaCl, pH7.5悬浮、振匀，-80℃保存。
4、注意事项4.1 注意对称平衡。
使用天平，进行配平，保证离心对称平衡。
4.2 如离心管盖子密封性差液体就不能加满（针对高速离心且使用角度头），以防外溢。
外溢后果污染转头和离心腔，并失去平衡，影响感应器正常工作。
最高液面查离心机相应说明书。
4.3 SW40超速离心时，液体一定要加满离心管，只余留2mm空间，超离时需抽真空，只有加满才能避免离心管变形。
4.4 使用角度头时别忘盖转头盖，如未盖，离心腔内会产生很大的涡流阻力和摩擦升温，这等于给离心机的电机和制冷机增加了额外负担，影响离心机的使用寿命。
113。
病毒学实验一鸡胚接种培养
实验器材
• 鸡胚、孵化设备、检卵器、钻孔器、蛋托、 超净台、冰箱、酒精灯、碘酒、酒精棉球、 注射器、蜡烛
实验方法
鸡胚孵化 • 将鸡卵气室向上放于蛋托上，置孵化器内，温度
37.5℃，相对湿度（45%～60%）条件下孵育， 从第3天开始每隔4~6h翻蛋一次。 • 第7~8天集中用检卵器验蛋一次，受精卵可见有 鸡胚，发育良好的胚胎可见清晰的血管及活的胚 胎，血管及其主要的分枝均明显，呈鲜红色，鸡 胚可以活动。未受精和死胚胚体固定在一端不动， 看不到血管或血管消散。剔除未受精卵和死胚。
实验要求
• 出勤率 • 实验过程中安静、有序、认真、无污染 • 实验报告书写 • 值日生打扫卫生
实验一 鸡胚接种培养
鸡胚结构
• 2、接种方法
• 病毒的鸡胚培养法主要有四种接种途径，即尿囊 腔、绒毛尿囊膜、羊膜腔和卵黄囊，不同的病毒
应选择各自适宜的接种途径，并根据接种途径确 定鸡胚的孵育日龄。
• 例：
痘类病毒
绒毛尿囊膜
9～10
腮腺炎病毒 尿囊腔
9～11
嗜神经性病毒 卵黄囊
5～6
• 实验目的：掌握鸡胚的孵化和观察方法， 掌握尿囊腔接种与收获方法，了解鸡胚培 养的结果观察方式。
• 实验原理：尿囊腔接种法广泛应用于病毒 的适应和传代培养，病毒被注射到尿囊腔 后，可在内皮细胞中被复制，复制的病毒 被释放到尿囊液中，因此，在尿囊液中含 有大量的病毒。
鸡胚接种
1 选用9～11日龄发育良好的鸡胚。 2 在接种前用检卵器观察并标记出胚胎的气室及胚胎位置，
在气室下边的胚胎附近没有大血管区域标示出尿囊腔接种 部位。 3 把鸡胚气室向上放置于蛋托上，对接种的气室蛋壳表面 用酒精棉和碘酊消毒。 4 将钻孔器在酒精灯火焰下烧灼消毒后，在气室卵壳端打 孔，用1ml注射器吸取接种0.1ml病毒液，从气室下的蛋 壳侧面经气室将针头斜刺入要接种的尿囊腔部位约1.5cm， 注入接种液。 5 用熔化的蜡封闭卵壳上的孔，气室朝上置于温箱内孵育。 6 对已接种的鸡胚每天在检卵灯下检查胚卵，发现鸡胚死亡 立即放入冰箱，将24h内死亡的鸡胚剔除。 7 2～4天后，收获尿囊液。
《医学微生物学》动物接种实验与病毒培养技术实验
《医学微生物学》动物接种实验与病毒培养技术实验实验动物在病原微生物中的研究上占有重要地位。
利用实验动物可以进行病原菌的分离鉴定、毒力的检测、制备免疫血清等生物制品；进行各种皮肤试验；建立人工感染的动物模型；进行发病机制、疾病防治以及免疫机制的研究等。
一、实验动物的管理1．实验室常用的动物：家兔、豚鼠、小白鼠、大白鼠、地鼠、绵羊、鸡等，根据实验的目的选择最适宜的动物。
2．实验动物必须与正常动物分开饲养，动物室内要经常保持清洁和空气畅通，并应有防蚊、防蝇、防逃跑及保暖设备。
3．实验动物要精心饲养，喂以适当的饲料并给以充足的水，任何动物也不要断水。
4．实验动物要有详细的记录，包括性别、体重、体表特征(如毛色等)、接种材料、接种日期、接种途径、剂量、次数以及接种变化等。
5．实验动物应做好标记，对较大动物如家兔、豚鼠等可用金属号码牌固定于耳朵上，对较小动物如大白鼠、小白鼠等可用复红(或苦味酸等染料)涂于身体的不同部位，以资识别。
盛装动物的笼具等，也应付以标签。
6．接种后的动物应每天观察1～2次，注意动物的精神状态，活动能力、饮食和大小便情况，体温、注射部位的反应以及全身反应，如不安、耸毛、震颤、弓背、麻痹及死亡等，并应详细记录之。
7．感染动物死亡后，应立即剖检或暂时冻存。
动物的排泄物及使用的笼具等必须严格消毒。
任何用过的动物，不宜再做其他试验。
二、实验动物的选择选择实验动物应注意以下几点：1．易感性：是选择实验动物的首要条件。
2．动物健康：体质健康、发育正常、体重适宜；最好使用自己繁殖的动物，由市场购买的动物至少经过一周的隔离观察，证明无隐性感染方可使用；某些特殊实验应需选用专门喂养繁殖的无菌动物；实验动物应容易获得，便于喂养和管理。
3．动物大小：同一实验应选用大小一致的动物，通常以年龄或体重为标准。
4．性别：某些实验最好选用同一性别，特别是免疫的动物和需要观察较长时间的实验动物。
5．动物品系：某些实验要求使用纯系动物，纯系小鼠用于免疫学、杂交瘤及病毒感染等研究。
病毒接种鸡胚步骤
流感病毒鸡胚接种材料：9-11龄鸡胚、孵蛋箱、照蛋器、开卵钻、石蜡、注射器、碘酒、70%酒精、镊子、二级生物安全柜等。
方法：1 照蛋：⑴避开鸡胚及主动脉，找寻两血管间隙划线（最佳点）⑵划线在血管之间⑶标记蛋时不要太靠近气室处，因后面去壳时可能敲掉，导致标记不见2 开孔：⑴开孔前先用75%酒精擦一下，由下而上或由上至下一遍即可，不可反复擦⑵开孔勿太大（太大不易封住，且易染菌）3 注射：⑴针头45度斜插入孔中，至针头尾部到达蛋壳⑵注射后不要用力过大，抽出时不要过快⑶一针插入鸡胚，不要在里面搅拌注：⑴握病毒管时不要握底部，易使病毒失活，融化时最好冰上融化，或流水冲洗⑵吸取液体时先混匀尿囊腔接种：照检后画出气室边界和胎位，在胚胎面与气室交界处边缘约1mm处并避开血管做一标记，此即为注射点。
在点及周围用75%酒精消毒，并用钻蛋机钻开一个约2mm长小口，勿损伤壳膜。
用注射器注入流感病毒0.1-0.2ml，然后用石蜡溶化封口，置33-35度孵箱培养。
每日照检鸡胚一次，于接种后24h 内死亡者为非特异性死亡应弃去。
甲型流感一般培养44-48h收获，而乙型流感病毒培养72h后进行收获。
如病毒用冷冻干燥标本进行传代，无论甲型还是乙型均培养72h后才进行收获收获前鸡胚须置4度冰箱6h或过夜，但不能置时间过长，过长会引起散黄。
如急于收获亦可置-20度冰箱1h左右，但不能过长，过长会引起鸡胚结冰，再融化时卵黄膜就破碎，卵黄就流出。
预冷的目的是：将鸡胚冻死使血液凝固，避免收获时流出红细胞并同尿液或羊水里的病毒发生凝集，造成病毒滴度下降。
收获时，用75%酒精消毒气室部卵壳，用消毒镊子轻轻敲碎气室部卵壳并取走之，再用另一无菌镊子撕去气室部壳膜，然后用无菌吸管通过绒毛尿囊膜进入尿囊腔，吸取尿囊液，置试管内4度或低温保存待用。
P3规范：⑴做有毒物需穿两件衣，⑵物从物流走，人从人流过，⑶所有沾毒东西都装2层塑料袋，密封，灭菌。
组织培养半数感染量－TCID50滴定的具体步骤
组织培养半数感染量－TCID50滴定的具体步骤组织培养半数感染量－TCID50滴定的具体步骤：(1)流感病毒制备利⽤鸡胚尿囊腔接种法制备流感病毒，收获尿囊液，⾎凝实验测定病毒的存在，分装后－70℃冻存。
(2)病毒的稀释1)取1管冻存病毒尿囊液，1:100稀释（100微升病毒液+9.9毫升稀释液）2)第1排孔加⼊146微升1:100稀释过的病毒液，然后做系列半对数稀释，使之成10-2、10-2.5、10-3、10-3.5……10-7。
每孔含100微升病毒液，每个稀释度重复4孔，详细操作参见图1。
* ⼈流感病毒⼀般在胰酶存在的条件下才能感染MDCK细胞，因此病毒稀释液中需加⼊2微克/毫升的TPCK－胰酶。
某些毒性很⾼的禽流感病毒在⽆胰酶存在的条件下即可感染MDCK细胞，因此在测定新病毒滴度时，最好配制含有和不含有胰酶的两种稀释液，以获得最佳结果。
(3)MDCK细胞的准备1)使⽤前2天将MDCK细胞1:100传代，使之70~90%成⽚，处于对数⽣长期的细胞对病毒具有最⼤的敏感性，细胞过度⽣长以及代数太⾼（⼤于30代）将使细胞对病毒的敏感性降低。
2)弃去细胞培养液，⽤5毫升胰酶 / EDTA洗细胞⼀次，然后弃去。
3)加4到5毫升胰酶 / EDTA覆盖细胞（162cm2的细胞培养瓶）37℃ 5%CO2温箱中消化10~20分钟。
4)待细胞开始脱落时，加5~10毫升MDCK细胞培养液，吹打分散细胞，并将细胞转⼊离⼼管中，⽤PBS洗2次，以去除⽜⾎清。
5)将细胞悬浮于病毒稀释液中，⽤1毫升吸管充分吹打分散细胞，在细胞计数板上计数细胞数量。
6)⽤病毒稀释液将细胞稀释成1.5×105细胞/毫升。
7)加100微升细胞（1.5×104细胞/孔）于已稀释好病毒的微量细胞培养板中。
8)在37℃ 5%CO2温箱中培养18－22⼩时。
(4)测定组织细胞半数感染剂量（TCID50）1)弃去微量培养板中的细胞液，250微升PBS洗细胞⼀次。
实验报告病毒的鸡胚培养及梯度检测
实验报告病毒的鸡胚培养及梯度检测实验报告病毒的鸡胚培养及梯度检测实验报告病毒的鸡胚培养及梯度检测篇一:实验五十动物病毒的鸡胚培养实验五十一动物病毒的鸡胚培养三、器材1(病毒痘苗病毒(Vaccinia virus)，鸡新城疫病毒(Necastle distase virus)。
2.仪器或其他用具孵卵器，检卵灯，齿钻，磨壳器，钢针，蛋座木架，注射器，2.5,碘酒，70,乙醇，镊子，剪刀，封蜡(固体石蜡加1,4凡士林，溶化)，灭菌培养板，灭菌盖玻片等。
3.白壳受精卵 (自产出后不超过10d，以5d以内的卵为最好)。
四、操作步骤1(准备蛋胚孵育前的鸡卵先用清水以布洗净，再用干布擦干，放入孵卵器内进行孵育(37?，相对湿度是45%~60%)，孵育3d后，鸡卵每日翻动1~2次。
孵至第4d，用检卵灯观察鸡胚发育情况，未受精卵，只见模糊的卵黄黑影，不见鸡胚的形迹，这种鸡卵应淘汰。
活胚可看到清晰的血管和鸡胚的暗影，比较大一些的可以看见胚动，随后每日观察一次，将胚动呆滞的或没有运动的、血管昏暗模糊者，即可能是已死或将死的鸡胚，要随时加以淘汰。
生长良好的蛋胚一直孵育到接种前，具体胚龄视所拟培养的病毒种类和接种途径而定。
鸡卵孵化期间，箱内应保持新鲜空气流通，特别是孵化5~6d后，鸡胚发育加快，氧气需要量加大，空气供应不足，会导致鸡胚大量死亡。
2.接种(1)绒毛尿囊膜接种?将孵育10~12d的蛋胚放到检卵灯上，用铅笔勾出其实与胚胎略近气室端的绒毛尿囊膜发育的好的地方。
?用碘酒消毒气室顶端与绒毛尿囊膜记号处，并用磨壳器或齿钻在记号处的卵壳上磨开一三角形或正方形(每边约5~6mm)的小窗，不可弄破下面的壳膜。
在气室顶端钻一小孔。
?用小镊子轻轻揭去所开小窗处的卵壳，露出壳下的壳膜，在壳膜上滴一滴生理盐水，用针尖小心地划破壳膜，但注意切勿伤及紧贴在下面的绒毛尿囊膜，以利两膜分离。
?用针刺破其实小孔处的壳膜，再用橡皮乳头吸出气室内的空气，是绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室(图?—4)。
鸡胚接种实验报告
一、实验目的1. 掌握鸡胚接种病毒的方法和步骤。
2. 了解病毒在鸡胚中的生长和繁殖情况。
3. 学习病毒分离和培养的基本原理。
二、实验原理鸡胚接种是一种常用的病毒分离和培养方法。
病毒接种于鸡胚后，能够在鸡胚中繁殖，从而便于观察和分析病毒的生物学特性。
本实验主要采用尿囊腔接种法，将病毒接种于鸡胚尿囊腔内，观察病毒在鸡胚中的生长和繁殖情况。
三、实验材料1. 实验动物：9-11日龄的鸡胚。
2. 实验试剂：新城疫病毒悬液、生理盐水、碘酒、酒精、消毒棉球等。
3. 实验仪器：照蛋器、无菌手术刀、镊子、注射器、剪刀、平皿等。
四、实验方法1. 鸡胚准备：取9-11日龄的鸡胚，用碘酒和酒精消毒鸡胚蛋壳，用手术刀在鸡胚气室处划一小孔，用注射器吸取适量新城疫病毒悬液。
2. 尿囊腔接种：将鸡胚置于卵盘上，气室端向上，用注射器将病毒悬液注入鸡胚尿囊腔内，注入量约为0.1-0.2ml。
3. 孵育：将接种后的鸡胚放入37℃孵卵箱中孵育48-72小时。
4. 观察：定期观察鸡胚的生长发育情况，记录死亡、畸形等现象。
5. 病毒分离：取出死亡鸡胚，无菌操作下取出尿囊液，进行病毒分离和培养。
五、实验结果1. 接种后，部分鸡胚出现死亡现象，死亡时间集中在接种后24-48小时。
2. 死亡鸡胚的尿囊液中检测到新城疫病毒。
3. 成活鸡胚生长发育正常，未出现明显异常。
六、实验讨论1. 鸡胚接种是一种简单、有效的病毒分离和培养方法，适用于多种病毒的研究。
2. 尿囊腔接种法是一种常用的鸡胚接种方法，适用于新城疫病毒、流感病毒等多种病毒。
3. 本实验结果表明，新城疫病毒能够在鸡胚中繁殖，为新城疫病毒的研究提供了有力支持。
七、实验结论1. 鸡胚接种是一种简单、有效的病毒分离和培养方法。
2. 尿囊腔接种法适用于新城疫病毒等多种病毒的分离和培养。
3. 本实验成功分离和培养了新城疫病毒，为新城疫病毒的研究提供了有力支持。
八、实验心得1. 实验过程中，无菌操作至关重要，需严格按照无菌操作规程进行。
实验一 鸡新城疫疫苗(一)
尿囊膜贴在卵壳内壁上，用镊子夹住将其撕脱下来即
可。
胚胎：消毒、打开气室卵壳后，用镊子撕破卵壳膜和
绒毛尿囊膜，夹起胚胎，用剪刀剪断卵黄带，将胎儿
放灭菌容器内即可。
8.鸡胚接种注意事项
（1）接种材料一般都应按每毫升1000ＩＵ或μg加入 青、链霉素。
（2）接种位点应避开鸡胚、血管和胚头，以免针头 刺伤鸡胚而造成接种后的损伤性死亡。
实验一 鸡新城疫油乳剂灭活苗的制备技术（一）
新城疫病毒可以在鸡胚中大量增殖，收获的鸡胚
尿囊液中即含有新城疫活病毒，将收获的尿囊液经过
灭活，并加入佐剂，便制成了新城疫灭活疫苗。
目的和要求：
1.掌握鸡胚的孵化过程和鸡胚的接种途径、接 种方法； 2.掌握新城疫病毒在鸡胚尿囊腔的增殖过程， 掌握接毒和收毒的方法。
头约1cm左右。
4.病料接种：
若用鸡胚分离、培养病毒，则应选9～12日龄之
间的发育鸡胚。许多病毒，特别是大多数禽病毒都能
在鸡胚或鸭胚中生长繁殖。接种时应先在照蛋器下检 查鸡胚是否健康、活泼，并划出气室和接种部位。然 后严格消毒接种部位和气室（先用碘酊消毒，再用 70%酒精消毒），用打孔器打孔后，每胚接种处理好
水瓶中，使两种抗生素在生理盐水中的含量均
达到1000-2000 IU(μg)/ml。将注射用生理盐
水3-4ml注入一瓶新城疫Ⅳ系弱毒疫苗中，稀释。
3.照蛋定位 ： 接种前应在照蛋器下检查鸡胚，挑出死胚 和弱胚。对所有健康胚应先用红铅笔画出气室 位臵，再于胚胎侧画出接种位点（进针点）， 接种点应避开大血管，靠近气室边缘处，离胚
此法适用于马立克氏病毒、披膜病毒、衣
原体及立克次氏体的分离、培养。接种方法：
气室端蛋壳消毒后，在气室中央打一小孔，用
病毒的分离培养与动物接种、鸡胚接种法
小白鼠滴鼻感染法（示教）
• 【材料】 • 小白鼠、流盛病毒的鼠肺适应株悬液、无消 毛细吸管、无菌小试管、乙醚、棉球及动物 罐等。 • 【方法】 • 1 ．首先将小白鼠 1 只投于带盖的，内放有浸 蘸乙醚的棉球的容器内行全身麻醉。注意麻 醉的深度，一般不宜太深或太浅，太深时易 遭致麻痹死亡或吸人性肺炎，太浅则易在滴 注时打喷嚏。
二、标本的处理
• （一）除菌处理 粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位 /毫升，置4℃过夜。 鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2000单位/ 毫升，置4℃作用4小时。 对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、 呼肠孤病毒、腺病毒、痘病毒等，则可加入 等量的乙醚4℃过夜除菌。
• （二）研磨和稀释 对脑、脊髓等组织标本首先应经研 磨器或乳钵中充分研磨后，加稀释液 （PH7.6肉汤或10％脱脂牛乳生理盐水 或0.5％水解乳蛋白Hanks液）制成组织 悬液，然后经2000转／分离心20分钟。 必要时可加抗生素处理（同上）。
尿囊腔接种
• 【材料】 • 新城鸡瘟病毒10毫升稀释液，10—12日 龄鸡胚，卵垫， 1 毫升无菌注射器及 14 号针头，小锉了刀，橡皮乳头、大头针， 眼科镊子及小镊子，无菌培养皿、无菌 生理盐水，碘酒，酒精棉球。
• 【方法】 选9—11日龄鸡胚，照检后划出气室和胎 位，在气室边缘上2—8毫米处避开血管 作一标记，将碘酒在此消毒后，用蛋钻 钻一小扎（勿损伤壳膜），用注射器注 入病毒0.1—0.2毫升，然后用溶化石蜡 封口，置33—35℃孵育（时间见表12— 6）。
二、病毒的鸡胚接种、培养与 收获
• （一）接种 实验室经常应用的接种途径有四种： 绒毛尿囊膜、尿囊腔、羊膜腔和卵黄囊 接种等。（见表12—6）
• 2．用左手取出小白鼠握在掌中，大拇指及食 指抓住耳部使其头部朝前并呈仰卧位 置，另 一手将吸有病毒悬液的滴管，慢慢滴于管口 而不使其自然掉落呈悬滴状，将悬滴 靠至动 物鼻尖，动物在呼吸时带人，一般滴入0.03— 0.05毫升，不宜过多，感染材料如被吸人肺内， 容易引起动物肺水肿，往往于接种后一天内 死亡。 • 3．动物慢慢苏醒，在罐中逐日观察，通常在 数日后开始发病，发病的症状常为耸毛，咳 嗽、不食、甚至死亡，解剖可观察到肺脏有 肺炎或出血性病灶。
病毒接种、收获尿囊液操作步骤
病毒接种1.选胚：首先，在照蛋间挑选出血管模糊，没有生命迹象的鸡胚。
2.标记注射点：接着用记号笔在气室上方约1mm处画线，在线的下方挑选注射点，在挑选注射点时应注意避开主血管，避开鸡头。
3.打孔：打孔前先用碘酊在气室部位消毒，用打孔器在气室线上方打孔。
注意：孔不宜过大，否则会导致封蜡不完全，甚至将蜡油流进鸡胚内部。
4.注射病毒：用注射枪向每个鸡蛋孔内注射0.2ml病毒稀释液，注射时针头朝向注射点方向，每次注射停留4~6s。
5.封蜡：注射完毕，用镊子夹取酒精棉沾上蜡油，进行鸡胚封蜡。
6.培养：将封蜡完成的鸡胚放入孵化箱中培养。
孵化箱温度设置33~35℃，湿度50%~70%，甲型流感病毒培养48~52小时，乙型流感病毒培养66~72小时。
需准备的仪器试剂：手电筒，记号笔，碘酊，棉签，量筒（稀释），酒精灯，废液瓶，打孔器，三脚架，蜡块，连续注射器，一次性注射器，移液枪，移液枪枪头，镊子，纱布，打火机，蓝盖瓶。
注意事项：（1）、前一天将病毒原液拿至4℃冷库；（2）、前一天准备好需要灭菌消毒的物品，高温高压灭菌，烘干；确定好参加实验人数，准备好无菌服；（3）、接种当天早上将接种所需生物安全柜开紫外杀菌；收获尿囊液1.鸡胚消毒:将培养好的鸡胚放入4℃冷库进行冷胚6h以上；首先，用0.1%的新洁而灭溶液将鸡胚进行消毒，每次消毒1~2分钟。
接着，在鸡胚的气室用碘酊消毒。
2.烙蛋：将经过消毒处理的鸡胚在烙蛋器上进行烙蛋。
3.收获：先用小镊子将壳膜撕破扒出气室，再用大镊子压住鸡头，同时用5ml移液枪吸取尿囊液。
收获的尿囊液应是澄清、微黄状。
4.保存：将收获的尿囊液放至6℃冷库保存。
需准备的仪器试剂：新洁而灭溶液，碘酊，棉签，烙蛋器，废液瓶，镊子，5ml移液枪，5ml移液枪枪头，蓝盖瓶（数量由病毒原液体积决定）。
注意事项：（1）、前一天准备好需要灭菌消毒的物品，高温高压灭菌，烘干；确定好参加实验人数，准备好无菌服；（2）、收获当天早上将收获所需生物安全柜开紫外杀菌；血凝滴度试验1.稀释病毒液：取一块洁净的“96”孔血凝板，横向摆放。
收集尿囊液的实训报告
一、实训目的1. 掌握尿囊液的采集方法。
2. 了解尿囊液在胚胎学研究中的应用。
3. 培养实验室操作技能和实验数据的记录与分析能力。
二、实训时间2023年X月X日三、实训地点XX大学动物实验中心四、实训器材1. 尿囊穿刺针2. 无菌试管3. 无菌手套4. 75%酒精5. 灭菌生理盐水6. 实验记录表五、实训步骤1. 实验前准备（1）将无菌试管、尿囊穿刺针、无菌手套等实验器材放置在实验台上，确保实验环境整洁。
（2）检查实验动物是否处于正常状态，确保实验动物无疾病。
2. 实验操作（1）穿戴无菌手套，对实验动物进行消毒。
（2）将实验动物放置在实验台上，固定四肢，使其处于安静状态。
（3）用尿囊穿刺针从实验动物腹壁刺入尿囊，进入尿囊腔。
（4）在穿刺过程中，观察尿囊液的流出情况，确保穿刺针位于尿囊腔内。
（5）收集尿囊液至无菌试管中，记录收集到的尿囊液量。
（6）用75%酒精对实验动物进行消毒，结束实验操作。
3. 实验数据记录将实验过程中收集到的尿囊液量、实验动物种类、实验时间等信息记录在实验记录表中。
六、实验结果与分析1. 实验结果本次实验共收集到尿囊液X毫升，实验动物种类为XX。
2. 实验分析（1）尿囊液是胚胎发育过程中的重要液体，对胚胎的发育和营养供给具有重要作用。
（2）本次实验成功收集到了尿囊液，为后续胚胎学研究提供了实验材料。
（3）在实验过程中，严格按照操作规程进行，确保实验结果的准确性。
七、实训体会1. 通过本次实训，掌握了尿囊液的采集方法，提高了实验室操作技能。
2. 认识到了尿囊液在胚胎学研究中的重要性，为后续实验奠定了基础。
3. 培养了实验数据的记录与分析能力，为今后科研工作打下了基础。
八、实训总结本次实训圆满完成，达到了预期目标。
在实验过程中，我们严格遵守实验规程，确保实验结果的准确性。
通过本次实训，提高了自己的实验操作技能和科研素养，为今后从事相关领域的研究奠定了基础。
在今后的实验工作中，我们将继续努力，不断提高自己的实验技能和科研水平。
模块三、鸡胚蛋孵化、清洗消毒鸡胚、鸡胚接种病毒的操作
鸡胚蛋孵化、清洗消毒鸡胚、鸡胚接种病毒的操作(已读)任务1、SPF蛋的收集、清洗消毒、孵化学习目标了解SPF (Specific Pathogen Free,无特定病原) 蛋的收集、清洗消毒、孵化。
任务提出：病毒除了利用原代鸡胚细胞培养外，也可利用鸡胚直接培养，要利用鸡胚直接培养病毒，需采用SPF种蛋，就要进行SPF蛋的收集、清洗消毒、孵化。
按生产指令单向仓库领取相关材料并核对，填写收料记录，并按相关的SOP进行操作。
任务分析：要进行SPF蛋的收集、清洗消毒、孵化，首先要得到生产指令单，根据接种所需，向仓库领取所需要的各种材料，再按照SOP的要求，进行SPF蛋的收集、清洗消毒、孵化。
任务实施：一、准备工作领取各种材料，填写领料单。
二、材料和仪器SPF蛋、孵化器、蛋架、铅笔、照蛋器、甲醛三、操作方法1．SPF 蛋的收集、灭菌、保存每天用蛋盒从隔离器中收集蛋(1 次/ d) 后,用细砂纸和刀片清理干净蛋表面的脏物,在蛋的大头表面上用铅笔写隔离器号和收蛋日期。
随后,按隔离器号依次装在塑料蛋盘中,放进熏蒸柜里,用多聚甲醛硅油法进行灭菌,灭菌后的SPF 蛋按家系集中在一起放进12～15 ℃的贮藏柜里保存。
上述的工作过程中,严防用赤手直接触摸SPF蛋,一定要带一次性无菌手套进行操作,以防SPF 蛋的污染。
在贮藏柜中的保存时间不要过长,一般不要超过7 d ,以免降低SPF 蛋的利用率。
2．SPF 鸡胚的孵化2. 1 孵化前准备工作(1) 孵化前应彻底清理干净孵化室和出雏室及其内的孵化器等设备,放进孵化时所用的工具和记录用品。
(2) 用多聚甲醛硅油法熏蒸孵化室和出雏室,待检查灭菌结果合格时进入使用,如不合格重新熏蒸,达到合格为止。
(3) 在孵化室的缓冲间里放进孵化时工作人员所要用的灭菌的工作服,鞋帽、口罩和一次性手套,打开紫外线灯(24 hPd) 。
(4) 调试孵化器的温度和湿度, 温度设定在3718 ℃左右。
病毒学实验二病毒尿囊液的收获及血
血细胞凝集（HA）试验术式表
孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
病毒稀
释度
1： 2
1：4
1：8
1： 16
1： 32
1： 64
1： 1： 128 256
1： 512
1： 1024
将冻存的鸡胚置于蛋托上用碘酊和酒精棉消毒气室端用无菌镊子击破气室部卵壳并撕开壳膜用无菌吸管经绒毛膜进入尿囊腔吸取尿囊液置无菌容器中低温保存备用
实验二 病毒尿囊液的收获及血凝实验
病毒尿囊液的收获
• 实验器材：镊子、无菌眼科镊子和剪刀、青霉素 瓶、灭菌吸头、移液器、小三角瓶、灭菌高压锅
• 已接种鸡胚收获尿囊液前置于4℃冰箱4h 或过夜。 • 将冻存的鸡胚置于蛋托上，用碘酊和酒精棉消毒
• 于左侧第1孔加25ul病毒收取液，混合均匀后，吸25ul至 第2孔，混合均匀后，吸25ul至第3孔，依次倍比稀释，至 第11孔，吸弃50ul，稀释后病毒稀释度为第1孔1：2，依 次1：4，1：8……。最后一孔为对照。
• 自左至右依次向各孔加1%鸡红细胞25ul，轻微振荡混匀， 使血球与病毒充分混合，在37℃温箱中作用15～30min后， 待对照红细胞已沉淀可观察结果。
饮水或气雾免疫。
肉仔鸡
• 一免： 一日龄半头份油苗+弱毒苗滴鼻、点眼 • 二免：10-20日龄饮水
血清学诊断
• HA+HI
• 鸡群血清学测定： • 临界值/阈值（保护性抗体） • 免疫前后无变化 • 不同疫苗的免疫结果 • 免疫监测
血凝实验
• 实验目的：掌握血细胞凝集试验的原理，熟悉血 凝试验的方法和结果分析。
鸡胚1、尿囊腔接种2、绒毛尿囊膜接种 3、卵黄囊等接种方式
接种途径 1、尿囊腔接种 2、绒毛尿囊膜接种 3、卵黄囊接种 4、眼球接种 5、羊膜腔接种 6、脑内接种 7、静脉接种 正粘病毒和副粘病毒 狂犬病毒 蓝舌病毒
（一）卵黄囊接种法 主要用于虫媒披膜病毒以及鹦鹉热衣原体和立克 次氏体等的分离和增殖。 方法一： 1）取6-8日龄鸡胚，用检卵灯照视画出气室和胚胎位 置后，垂直放置在卵座上(大头向上) 2）用碘酊和酒精消毒气
7、用透明胶纸封住卵窗，或用玻璃纸盖于卵窗 中，周围涂上熔化的石蜡密封，气室中央的小
孔用石蜡密封。
8、胚横卧于卵箱中，不许翻动，保持卵窗向上。
（三） 尿囊腔接种
主要用于正粘病毒和副粘病毒，如流感
病毒、新城疫病毒的分离和增殖。 1、选用10-11日龄的鸡胚，画出气室和胚位 2、在气室接近胚体处用碘酊和酒精进行消毒 3、用钢锥穿一小孔
保存一个月的受精卵，孵化率将近于零。
孵育
孵卵箱内的温度应保持在37.5-38.5℃ 相对湿度：50%-60%
必须保证有充分的新鲜空气流通，特别是在孵
化5-6天以后
从孵育后第3天开始，每天翻卵一次。
检卵
自孵育后的第4天开始检卵，每天一次。
孵育4-5日于检卵灯上检查鸡胚受精与否及发育
情况。
4、将注射器沿小孔插入0.5-1.0cm，注入0.10.2ml接种物
5、用石蜡封口，并置孵卵箱中孵育，每天翻
卵并检卵一次，24h内死亡者废弃。
十一、NDV接种鸡胚后对鸡胚的影响
NDV以尿囊腔接种于9-10日龄鸡胚，强毒株 在30-60h死亡，弱毒株3-6d死亡。死亡的鸡胚以 尿囊液含毒量最高，胚胎全身出血，以头部、足 趾、翅膀出血尤为明显。
未受精卵：只见模糊的卵黄阴影，不见血管和
鸡胚痕迹 活胚：具有清晰的血管和鸡胚暗影，较大鸡胚 还可见到胚动，但孵育14、15天以后胚动不明 显，甚至无胚动。 死胚：血管昏暗模糊，没有胚动。
病毒测序整个过程
病毒测序整个过程病毒测序整个过程1接种鸡胚；224小时以后回收尿囊液；3抽取RNA;4RT--PCR;5PCR;6检测；7胶回收；8连接；9转化；10铺板；11挑菌；12菌液PCR；13阳性测序。
1接种鸡胚1.1照胚，画出气室范围，标记胚血管少的位置；1.2蛋壳要酒精消毒，在标记处打孔（用尖头镊子、剪刀等）；1.3吸取适量毒液注入尿囊腔，针只要感觉到穿破了尿囊膜便稍深入便可注射，做好标记；1.4用蜡封闭所打的孔。
以上操作在酒精灯旁操作，注意无菌。
224小时以后回收尿囊液2.1消毒鸡胚，打开气室部蛋壳，撕破尿囊膜，用一千的抢吸取尿囊液。
注意不要弄破血管，吸取到血液。
吸取的液体放于1.5毫升的离心管中，做好标记。
注意，在此操作时操作台不通风。
3抽取RNA1 750微升trizol+250微升样品，剧烈振荡30秒，静置5分钟；2.加氯仿200微升，振荡5秒，静置1分钟，4°c离心12000rmp/min 离心6--10min；3吸取上清液于新的1.5微升的离心管，加等体积异丙醇（一般600微升）加完后上下颠倒混匀，于-40摄氏度作用30分钟以上。
再4摄氏度离心12000rmp/min离心15min;4舍弃上清，用1ml75%的酒精洗一次，4摄氏度离心5分钟，舍弃上清，室温风干5--10分钟，（可用镊子夹持小枪头利用毛细现象吸取残留液体）4RT--PCRRT--PCR25体系缓冲液（M-MLV 5xbuffer）5ul核苷酸（dNTP）5ulRNA酶抑制剂（RRI）0.5uLM-MLV(反转酶) 1反转引物（Cu） 1目的片段 3DEPC水13混合体系于42摄氏度反应1小时。
5PCR50体系10xExbuffer 5uldNTP 5ul引物上游 1下游 1模板 3ExTaq 0.25dd水36反应程序1 94摄氏度3分钟；2 94摄氏度30秒；3 52.5摄氏度30秒；4 72摄氏度1分50秒，从第2部开始循环，循环30次；5 72摄氏度10分钟。
鸡胚尿囊腔接种(单孔接种)记录
鸡胚尿囊腔接种（单孔接种）操作记录考生姓名：准考证号：鸡胚接种物品准备物品名称数量是否齐全物品名称数量是否齐全签字笔1支含冰容器1个记录表1张打孔器1把10日龄鸡胚15枚1mL一次性注射器3个标签纸1卷止血钳1把封孔胶1瓶75%酒精棉1瓶4%碘酒1瓶危废缸1个毛笔1支不锈钢托盘1个接种液1瓶利器桶1个操作步骤及记录1 准备工作1.1 确认物品。
1.2 确认胚蛋全部照检画好气室标记线，气室朝上摆放，检查胚蛋外观完整无破损。
1.3 消毒：用75%酒精棉擦拭操作台面、手部，注意更换酒精棉，用过的酒精棉扔危废缸。
是否完成□2 鸡胚消毒2.1 碘酒消毒：用毛笔蘸取4%碘酒并沥干，对胚蛋气室标记处上0.2-0.3cm接种部位逐一消毒，消毒面积为大拇指盖大小，消毒顺序从左到右、从上到下。
2.2 脱碘：用止血钳夹取75%酒精棉脱碘，脱碘顺序从左到右、从上到下，用过的酒精棉扔危废缸。
是否完成□3 打孔：从不锈钢灭菌盒中取出打孔器，去掉锡箔纸，在蛋胚气室消毒处轻轻打一小孔，注意打孔力度，防止打破，打孔顺序从左到右、从上到下。
是否完成□4 接种4.1 操作前摇匀种毒液，将种毒液放入含冰容器中。
4.2 用75%酒精棉消毒种毒瓶塞，用过的酒精棉扔危废缸。
4.3 取1mL一次性注射器，抽取病毒液1.2mL，用75%酒精棉包住针头慢慢排尽气泡，确保病毒液保持在刻度线上，注意不要将种毒液溅到桌面或蛋胚上，用过的酒精棉扔危废缸。
4.4 沿打孔处垂直进针，注入种毒液，每胚0.1mL接种量，接种顺序从左到右、从上到下，注意注毒时应缓慢推进，避免种毒接后溢出。
是否完成□5 封孔：按从下到上、从右到左的顺序将封孔胶滴到打孔处。
如发现产生气泡应重新封孔。
是否完成□6 标记：在已标记接毒名称、批号的标签上填写接种日期、接种数量、接种人，贴在蛋盘明显处。
是否完成□7 记录：按操作顺序填写记录。
是否完成□8 清场：将含毒用具放入不锈钢托盘中，清洁、消毒台面，将危废缸内的垃圾放入危废垃圾桶。
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病毒接种
1.选胚：首先，在照蛋间挑选出血管模糊，没有生命迹象的鸡胚。
2.标记注射点：接着用记号笔在气室上方约1mm处画线，在线的下方挑选
注射点，在挑选注射点时应注意避开主血管，避开鸡头。
3.打孔：打孔前先用碘酊在气室部位消毒，用打孔器在气室线上方打孔。
注意：
孔不宜过大，否则会导致封蜡不完全，甚至将蜡油流进鸡胚内部。
4.注射病毒：用注射枪向每个鸡蛋孔内注射0.2ml病毒稀释液，注射时针头朝
向注射点方向，每次注射停留4~6s。
5.封蜡：注射完毕，用镊子夹取酒精棉沾上蜡油，进行鸡胚封蜡。
6.培养：将封蜡完成的鸡胚放入孵化箱中培养。
孵化箱温度设置33~35℃，湿
度50%~70%，甲型流感病毒培养48~52小时，乙型流感病毒培养66~72
小时。
需准备的仪器试剂：
手电筒，记号笔，碘酊，棉签，量筒（稀释），酒精灯，废液瓶，打孔器，三脚架，蜡块，连续注射器，一次性注射器，移液枪，移液枪枪头，镊子，纱布，打火机，蓝盖瓶。
注意事项：
（1）、前一天将病毒原液拿至4℃冷库；
（2）、前一天准备好需要灭菌消毒的物品，高温高压灭菌，烘干；确定好参加实验人数，准备好无菌服；
（3）、接种当天早上将接种所需生物安全柜开紫外杀菌；
收获尿囊液
1.鸡胚消毒:将培养好的鸡胚放入4℃冷库进行冷胚6h以上；首先，用0.1%
的新洁而灭溶液将鸡胚进行消毒，每次消毒1~2分钟。
接着，在鸡胚的气室用碘酊消毒。
2.烙蛋：将经过消毒处理的鸡胚在烙蛋器上进行烙蛋。
3.收获：先用小镊子将壳膜撕破扒出气室，再用大镊子压住鸡头，同时用5ml
移液枪吸取尿囊液。
收获的尿囊液应是澄清、微黄状。
4.保存：将收获的尿囊液放至6℃冷库保存。
需准备的仪器试剂：
新洁而灭溶液，碘酊，棉签，烙蛋器，废液瓶，镊子，5ml移液枪，5ml移液枪枪头，蓝盖瓶（数量由病毒原液体积决定）。
注意事项：
（1）、前一天准备好需要灭菌消毒的物品，高温高压灭菌，烘干；确定好参加实验人数，准备好无菌服；
（2）、收获当天早上将收获所需生物安全柜开紫外杀菌；
血凝滴度试验
1.稀释病毒液：取一块洁净的“96”孔血凝板，横向摆放。
用微量移液器
（20—200ul）加入磷酸盐缓冲液100ul至第一孔，横向从第二孔开始，每孔均用微量移液器（5—50ul）加入磷酸盐缓冲液25ul直至第十二孔。
2.倍比稀释：在“U”型96孔血凝板的左侧标记样品名称，用微量移液器
（5—50ul）从第一孔内加入25ul病毒悬浮液吹打混匀，将病毒液稀释五倍。
取出25ul放到第二孔中，从第二孔开始倍比稀释，每孔吹打混匀，稀释到最后一孔弃掉25ul，此时的稀释倍数为1:10240。
3.阴性对照：在同一块“U”型96孔血凝板的最后一排，后三孔用25ul的磷
酸盐缓冲液替代供试品，作为阴性对照。
4.加鸡血：将1%鸡红细胞悬液倒入加样槽吹打混匀，开始从第十二列至第一
列每孔均用微量移液器（5-50μl）加入25μl的1%鸡红细胞悬液，振荡均匀后置室温40分钟后观察结果。
5.结果计算：观察阴性对照，若红细胞于孔底形成一个小团，边缘光滑并有立体感，将板倾斜片刻，可见红细胞滑动呈泪滴状为“－”，则阴性对照成立。
按照《流感病毒血凝滴度检测标准操作规程》观察每孔凝集状态，结果以“++”（++以数字2代之）为终点，以红细胞形成一个环状，四周有小凝集块者为“++”亦即一个凝集单位，也就是说最高稀释度病毒能引起“++”号的红细胞凝集为终点，此稀释度的倒数为红细胞凝集滴度简称血凝滴度。
影响血凝抑制实验的因素
1 .红细胞悬液浓度：来源于不同个体鸡的红细胞，对抗原的敏感性不尽相同。
因此实验时最好用3-4只未免疫鸡。
配制红细胞时，红细胞浓度低，HI滴度就会下降；红细胞浓度高，HI滴度就会上升。
有实验表明，红细胞浓度增加一倍，HI滴度就会上升20.7-0.9，因此，红细胞浓度以1％为宜。
2 .抗原的稀释倍数：配制抗原时，浓度必须准确。
当抗原浓度高时，(HI)抗体效价就下降；当抗原浓度抵时，(HI)抗体效价就上升。
3 .实验用的稀释液（PB S）：稀释液的pH值对实验有影响。
稀释液的pH值5.8以下，红细胞容易产生自凝现象；pH值在7.8以上凝集图形易消失，也会造成实验误差。
而pH值为7.0时，红细胞沉降最充分，图形最清晰，HI效价也最高，因此实验时用ph7.0-7.2的稀释液。
4 .实验时的温度：实验时的温度，从4-37℃，随着温度上升，HA与HI滴度提高，但在37℃时，凝集的红细胞易洗脱；4℃以下红细胞易产生自凝，故操作常用18-22℃。
（以上所阐述的是实验室操作过程中存在的几点因素，在实际工作中，也存在着其他诸多原因，如采样的时间、采样的数量、以及由疫苗产生的影响等。
)
流感病毒裂解疫苗生产工艺流程相关参数。