活性氧检测试验方案

活性氧检测试验方案

一：实验原理

活性氧检测试剂盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit)是一种利用荧光探针DCFH-DA 进行活性氧检测的试剂盒。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。

本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂Rosup，以便于活性氧的检测。Rosup是一种混合物(compound mixture),浓度为50mg/ml。

二：实验步骤

⑴取20 ul DCFH-DA（试剂盒有100ul)按照1:1000用无血清培养液即20ml稀释DCFH-DA，使

终浓度为10微摩尔/ 升。

⑵吸取12ml细胞培养液（细胞浓度为一百万至二千万/毫升）加入24孔板中（设3个阳性对照， 3个浓度梯度分别做3个重复，每孔加入1ml细胞培养液），放入细胞培养箱中培养。

⑶培养24小时后去除细胞培养液，每孔加入稀释好的DCFH-DA 1ml（加入的体积以能充分

盖住细胞为宜）。

⑷ 37℃细胞培养箱内孵育20分钟。

⑸去除孵育后的DCFH-DA稀释液，每孔加入1ml无血清细胞培养液洗涤细胞（重复洗涤三次，

以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA）。洗涤完后每孔加入1ml细胞培养液。

⑹在酶标仪下使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前荧光的强

弱即OD值。

⑺实验组中每孔加入已配制好的松茸多糖20ul(浓度分别为5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml),

对照组中加入阳性对照物Rosup 20ul，放入细胞培养箱内继续培养。

⑻4小时后，在酶标仪下使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激后

荧光的强弱即OD值。

三：数据处理

实验组：癌细胞活性氧降低率=（刺激前OD值－刺激后OD值)/刺激前OD值×100%

阳性对照组：癌细胞活性氧升高率=（刺激后OD值－刺激前OD值)/刺激前OD值×100% 四：注意事项

⑴探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。

⑵尽量缩短探针装载后到测定所用的时间(刺激时间除外)，以减少各种可能的误差。