活性氧检测试验方案
植物中活性氧的检测方法
生物技术通报
ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＢＵＬＬＥＴＩＮ
２００７ 年第 ５ 期
植物中活性氧的检测方法
祁艳 王冬梅
（ 河 北 农 业 大 学 生 命 科 学 学 院 ， 保 定 ０７１００１）
摘 要： 主要对超氧阴离子自由基（ Ｏ ２－·） 、过氧化氢（ Ｈ２Ｏ ２） 等活性氧的检测方法， 包括化学发光法、分光光度法、荧 光染色法， ＥＰＲ 波谱学方法、ＤＡＢ 组织染色法和电子显微技术检测法等进行了综述， 并简单介绍了最近发展起来的一些新 技术。
１．３ 荧光染色法 运用荧光染色技术可进行活体和离体亚细胞水
平的 Ｈ２Ｏ２ 检测。常用的荧光染料有 ２＇ ， ７＇ －二氯氢化荧 光 素 二 乙 酯 （ ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ， ＤＣＦＨＤＡ） 、 ４－ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ、７－羟－６ 甲 基 香 豆 素 （ ｓｃｏｐｏｌｅｔｉｎ） 、 Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ（ Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－３， ７－ｄｉｈｙｄｒｏｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ） 及 高 香 草 醛 酸 （ ｈｏｍｏｖａｎｉｌｌｉｃ ａｃｉｄ） 等 。在 辣 根 过 氧 化 物 酶 的 催 化 下 ， Ｈ２Ｏ２ 可 氧 化 这 些 物 质 生 成 极 易 检 测 的 发 荧 光 的 物 质 ， 此 法 简 便 有 效 ， 应 用 广 泛 。有 研 究 者 用 荧 光染色法检测了豌豆（ Ｐｉｓｕｍｓａｔｉｖｕｍ） 叶片衰老过程中 线 粒 体 、过 氧 化 物 酶 体 中 的 Ｈ２Ｏ２［１０］及 萝 卜 （ Ｒａｐｈａｎｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ） 种 子 在 萌 发 过 程 中 经 光 照 、ＧＡ、ＡＢＡ 调 控 下 Ｈ２Ｏ２ 的 释 放 ［１１］。 Ｏｒｏｚｃｏ－Ｃａ′ｒｄｅｎａｓ 等 ［１２］曾 用 Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ 定 量 检 测 了 番 茄 （ Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ） 叶 片 提 取 液 中 的 Ｈ２Ｏ２。 本 研 究 室 陈 晓 波 ［１３］以 激 发 子－原 生质体简化实验系统模拟叶锈菌侵染小麦叶片的 互 作 体 系 ， 利 用 荧 光 探 针 ＤＣＨＦＤＡ 标 记 Ｈ２Ｏ２， 并 借 助 激 光 扫 描 共 聚 焦 显 微 镜 （ ＣＬＳＭ） 来 研 究 植 物 抗 病 过 程 中 微 丝 骨 架 与 ＲＯＳ 的 关 系 ， 取 得 了 良 好 效 果 ； 笔者用该法成功检测了受叶锈菌侵染的小麦叶片 中 ＲＯＳ 的 变 化 （ 待 发 表 ） 。
过氧化苯甲酰BPO活性氧含量测定
过氧化苯甲酰BPO活性氧含量测定1方法提要试样溶解于二氯甲烷和冰乙酸的混合溶液中,加入饱和碘化钾溶液,有机过氧化物与碘化钾溶液作用,生成碘,碘与定量的硫代硫酸钠标准溶液作用,重新被还原,根据消耗的硫代硫酸钠标准滴定溶液的体积,计算得到有机过氧化物的含量。
2适用范围碘化钾-室温检测方法适用的有机过氧化物包括:a) 二酰基过氧化物:过氧化苯甲酰、过氧化双-(2,4-二氯苯甲酰)、过氧化对氯苯甲酰、过氧化月桂酰、过氧化乙酰、过氧化葵酰;b) 二元酸过氧化物:过氧化丁二酸;c) 酮类过氧化物:过氧化环己酮、过氧化甲乙酮;3 仪器3.1 碘量瓶:250mL。
3.2 滴定管:50mL,最小刻度0.1mL。
3.3 分析天平:感量0.0001g。
4 试剂和材料4.1 冰乙酸。
4.2 二氯甲烷。
4.3 氮气,纯度不低于99.99%。
4.4 饱和碘化钾溶液:在脱氧水中制备碘化钾的饱和溶液。
该溶液应当在使用前的现场配制,并且制备后应将它存放在棕色玻璃瓶中。
4.5 硫代硫酸钠标准滴定溶液:c(Na2S2O3)=0.1mol/L。
4.6 淀粉指示液:50g/L。
4.7 脱氧水:在使用前,用氮气通入水中鼓泡5min。
5 分析步骤5.1 量取20mL冰乙酸注入250mL的碘量瓶中,快速通入氮气置换2min,塞紧瓶塞。
5.2 称量含有3mmol~4mmol的活性氧的试样(对于液态挥发性有机过氧化物,称量前可以预先用冰乙酸将试样稀释到一定的体积),精确至0.0001g,加入碘量瓶中。
分析中所用试样的大致重量可通过公式3.5M/(2N×1000)计算。
其中,M 为有机过氧化物的相对分子质量,N 为分子中过氧基团的数量。
5.3 加入10mL二氯甲烷,重新塞好瓶塞,振荡使试样完全溶解或分散。
5.4 加入新鲜配制的饱和碘化钾溶液5 mL,再塞好瓶塞,摇匀后在室温下放置于暗处避光静置15min。
5.5 加入50mL脱氧水,用硫代硫酸钠标准滴定溶液滴定到溶液变成浅黄色,然后再加入1mL~2mL淀粉指示液,继续滴定到无色为终点,记录滴定所耗体积。
DCFHDA活性氧检测方法
DCFHDA活性氧检测方法DCFH-DA（2',7'-二氯荧光二乙酸）是一种常用于检测细胞内活性氧的荧光探针。
DCFH-DA最初作为一种检测脂质过氧化和活性氧产生的荧光探针而被引入。
在细胞内，DCFH-DA可以被酯酶水解成DCFH（2',7'-二氯荧光二酚），而DCFH与活性氧反应生成Dichlorofluorescein（DCF）产生强烈的绿色荧光。
DCFH-DA检测法被广泛应用于反应氧化应激和自由基生成的过程。
DCFH-DA检测法实际上是一种间接测定活性氧的方法。
原理基于DCFH-DA能够通过酯酶水解成DCFH，而DCFH可以直接或通过活性氧来氧化生成DCF。
因此，DCF的荧光强度与细胞内的活性氧水平成正相关。
DCFH-DA检测法常用于检测细胞或组织中的过氧化氢（H2O2）、羟自由基（•OH）、超氧阴离子（O2•-）等活性氧物种。
DCFH-DA检测法的步骤如下：1.细胞准备：将需要检测活性氧的细胞培养在合适的培养基中，保证细胞的活力和完整性。
2.DCFH-DA处理：将培养的细胞离心，去除培养基，并用含有适当浓度的DCFH-DA的PBS缓冲液重新悬浮细胞。
DCFH-DA可在一定浓度下直接添加到细胞培养基中，也可在细胞中预处理一段时间。
3.洗涤：DCFH-DA可渗透细胞膜进入细胞内，在细胞酯酶的作用下，水解成DCFH。
洗涤细胞是必要的，以去除外源DCFH-DA和水解后生成的DCFH。
4.活性氧诱导：将细胞暴露在产生活性氧的刺激剂中，如过氧化氢、辐射、药物等。
较为常用的是使用刺激物H2O2，细胞可暴露在适当浓度的H2O2中一段时间。
5.荧光显微镜观察：在刺激剂作用一定时间后，将细胞离心，取得细胞沉淀。
用PBS洗涤，使得测量时背景荧光最小。
6.荧光检测：将洗涤好的细胞沉淀悬浮于含PBS的离心管中，通过流式细胞术或荧光显微镜测量活性氧生成后的荧光信号。
DCFH-DA检测方法的优势在于具有响应迅速、敏感度高、操作简单等特点。
活性氧检测试验方案
活性氧检测试验方案活性氧检测试验方案一：实验原理活性氧检测试剂盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit)是一种利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。
DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。
而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。
细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。
检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。
本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂Rosup，以便于活性氧的检测。
Rosup是一种混合物(compound mixture),浓度为50mg/ml。
二：实验步骤⑴取20 ul DCFH-DA（试剂盒有100ul)按照1:1000用无血清培养液即20ml稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/ 升。
⑵吸取12ml细胞培养液（细胞浓度为一百万至二千万/毫升）加入24孔板中（设3个阳性对照，3个浓度梯度分别做3个重复，每孔加入1ml细胞培养液），放入细胞培养箱中培养。
⑶培养24小时后去除细胞培养液，每孔加入稀释好的DCFH-DA 1ml （加入的体积以能充分盖住细胞为宜）。
⑷ 37℃细胞培养箱内孵育20分钟。
⑸去除孵育后的DCFH-DA稀释液，每孔加入1ml无血清细胞培养液洗涤细胞（重复洗涤三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA）。
洗涤完后每孔加入1ml 细胞培养液。
⑹在酶标仪下使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前荧光的强弱即OD值。
⑺实验组中每孔加入已配制好的松茸多糖20ul(浓度分别为5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml),对照组中加入阳性对照物Rosup 20ul，放入细胞培养箱内继续培养。
⑻4小时后，在酶标仪下使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激后荧光的强弱即OD值。
三：数据处理实验组：癌细胞活性氧降低率=（刺激前OD值－刺激后OD值)/刺激前OD值×100%阳性对照组：癌细胞活性氧升高率=（刺激后OD值－刺激前OD 值)/刺激前OD值×100%四：注意事项⑴探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。
活性氧（ROS）测定试剂盒说明书
②、波长设置：最佳激发波长 500(50015nm)，最佳发射波长 525 (53020 nm)。也可按照 FITC 荧光检
测条件检测。 ③、结果以荧光度值表示。
四、细胞样本操作步骤：（可用激光共聚焦显微镜观察，也可用于流式细胞仪、荧光酶标仪、荧光分光度 计测定）
二、试剂组成及保存： 1、0.1ml 10mM DCFH-DA in DMSO，20℃保存。 2、1ml 活性氧供氢体，4-8℃保存。
三、组织样本操作步骤：（可用激光共聚焦显微镜观察，也可用于流式细胞仪、荧光酶标仪、荧光分光度 计测定）
1、单细胞悬液制备： 方法 1、采用单细胞悬液制备仪制备单细胞悬液。 方法 2、酶消化法： 方法 3、机械法（网搓法）：
本试剂盒仅用于科研实验
1、直接将探针加入培养液中： ①、直接将 DCFH-DA 探针加入无血清培养基中：一般按照 1 ：1000 用无血清培养液稀释 CFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜， 通常对于 6 孔板的一个孔加入稀释好的 DCFH-DA 不少于 1ml。 ②、取一份不加探针，只加入培养基的细胞设为阴性对照管。阳性对照管：取一份已加入探针的细胞，同 时加入活性氧供氢体诱导细胞，推荐该试剂的工作浓度为 20～100µM。 ③、37℃孵育细胞 30min～几小时，通常为 30～60min 即可，孵育时间长短与细胞类型、刺激条件、DCFH-DA 浓度有关。一般阳性对照在刺激细胞 30 分钟左右，即可观察到明显的绿色荧光。 ④、吸去培养液，利用无血清培养液或者 0.01MPBS 反复吹打，肉眼观察瓶底由半透明(细胞单层连接成 片)转为透明，细胞层几乎全部吹打到 PBS 中。 ⑤、将细胞悬液全部收集到 1.5ml 离心管中。用无血清培养液或者 PBS 洗涤 2 次，以充分去除未进入细 胞内的 DCFH-DA。1000rpm/min，5min，吸净上清后加入 PBS 重新悬浮细胞进行测定。
活性氧检测试验方案
活性氧检测试验方案活性氧（reactive oxygen species，ROS）是一个广泛存在于植物、动物和微生物细胞中的有害物质，在细胞内氧化还原反应中扮演重要角色。
活性氧包括超氧阴离子（O2-）、过氧化氢（H2O2）、羟基自由基（·OH）等，具有强氧化性。
活性氧在正常细胞代谢和维持细胞信号传导途径中发挥重要作用，但在细胞内过量生成会对细胞结构和功能造成损害，引发细胞衰老和死亡，促进炎症反应，以及导致一系列疾病的发生，包括心血管疾病、癌症、神经退行性疾病等。
活性氧检测是研究活性氧与细胞过程和疾病发生关系的重要手段。
常用的活性氧检测方法包括荧光探针染色法、电子自旋共振（electronspin resonance，ESR）法、流式细胞仪法、化学法等。
下面是一种基于荧光探针的活性氧检测实验方案，具体步骤如下：材料：1.细胞培养样本（如细胞系或原代细胞）2.活性氧检测荧光探针（如2',7'-二氯二羟苯基-4'-巯基吡啶，DCFH-DA）3.PBS（磷酸缓冲盐溶液）4.离心管5.无菌1.5mL离心管6.显微镜玻片7.荧光显微镜8.细胞培养基实验步骤：1.把细胞培养在合适的培养基中，保持在37°C的恒温培养箱中，条件合适时使其达到对照组的80%～90%接种度。
2.将细胞分装到离心管中，每支40mL细胞悬液。
3.加入DCFH-DA溶液，终浓度为10mM，使细胞充分吸收荧光探针。
将培养管放入37°C恒温培养箱中孵育30分钟以进行探针进入细胞。
4.将细胞洗涤剂去除，用PBS洗涤细胞3次以除去多余探针。
5.加入1mL的PBS溶液，留出0.5mL的悬液放入1.5mL离心管中，以进行离心。
去除上清液，避免细胞牵涉。
6.加入1.5mLPBS溶液，留出0.5mL的悬液放入1.5mL离心管中离心，去除上清液。
7.将取得的细胞悬液滴在显微镜玻片上，并加盖玻片。
在荧光显微镜下观察细胞活性氧的荧光信号强度。
DHE-ROS活性氧检测方法
本试剂盒可以用于各种真核培养细胞、培养或灌流组织及组织冰冻切片的检测。本试剂 盒提供了活性氧阳性对照试剂，以便于活性氧的检测。
产品特点： ● 使用方便：可用激光共聚焦显微镜直接观察、荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式
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产品简介： 活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 包括超氧自由基、过氧化氢、及其下游产物过氧
化物和羟化物等，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。 贝博 DHE 活性氧检测试剂盒是一种利用荧光探针 DHE(Dihydroethidium)进行活性氧检
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DHE-ROS活性氧的检测
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荧光显微镜检测： 1、 对贴壁生长细胞或活组织，可直接在荧光显微镜下观察；对悬浮生长细胞，取 25-50 μl 细胞悬液滴到一张显微载玻片上，再盖上一张盖玻片。 2、 荧光显微镜下，用蓝光或绿光激发，观察和拍摄细胞红色发射图像，ROS 阳性细
-2-
咨询邮箱：bestbio@
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咨询邮箱：bestbio@
电话：021-33921235
本产品仅供科学研究使用！请勿用于临床、诊断、食品、化妆品检测等用途！
产品说明书
产品特点： ● 使用方便：可用激光共聚焦显微镜直接观察、荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式
细胞仪检测； ● 背景低，灵敏度高； ● 线性范围宽，使用方便。
电话：021-33921235
本产品仅供科学研究使用！请勿用于临床、诊断、食品、化妆品检测等用途！
产品说明书
胞在整个核区被染成红色；用紫外光激发时，胞浆中未氧化的二氢乙啶可发出 蓝色荧光。
流式细胞仪分析： 1、 对贴壁生长细胞，用胰酶消化制备成单细胞悬液；对悬浮生长细胞，直接收集细胞。 用 0.5~1 ml 冰冷 PBS 重悬细胞（5~10 万）。 2、 采用 480~535 nm 波长激发，测定 590 nm~610 nm 以上的发射，细胞应可分成两个 亚群：ROS 阴性细胞仅有很低的荧光强度，ROS 阳性细胞有较强的红色荧光。
活性氧的检测方法
展。直到 1969 年 McCord 和 Fridovich[ 1] 发现 了清 除 超氧 化物 自由 基的 超氧 物 岐化 酶 ( SOD) 并研究其生物学作用, 提出了氧毒性 的超氧化物自由基学说后 , 人们才开始逐步 认识到自由 基在生物 体内存在 的危害 , 同 时 , 由于分子生物学的迅猛发展, 研究短寿 命的自由基的方法有所突破, 带动自由基生 物学的发展 , 使自由基生物学这门学科渗透 到医学、 植物生理学、 病理学等许多学科中, 显示出其极大的发展前景。 生物学、 医学最先研究活性氧的方法, 有脉冲射解 、 快速停流 、 顺磁共振和自旋 搜集技术 [
[ 3] .
第2期
陈惠萍等:
活性氧的检测方法
15
SOD 作用的底物 , 故原则上许多检 测 SOD 的方 法, 如化 学 发光、 NBT ( 氮 蓝四 唑 ) 还 原、 细胞色素、 连苯三酚、 肾上腺素都可以用 来检测生物系统的 O2. , 但干扰因素很多, 实 际应 用时困难不 少[ 4~ 6] 。 1976 年 Elest ner 等 提出用羟胺氧化反应来检测生物材料 的 O 2. 。此法灵敏 度高, 专一性好 , 药 剂价 廉。能同时检测大量样品。但叶绿素等色 素含量严重影响比色测定。王爱国等 为 了消除这些干扰 , 对实验步骤进行了改进, 并在分离时以乙醚取代正丁醇 , 检测了四季 豆幼苗叶片 叶绿体在光 暗下衰老 过程 O2 产生速率, 其结果与 McRac 等
1
、 水稻
[ 17]
、 眉豆
[ 18]
等植物上观察到
的现象类似。 4
1
O2 的检测 早在 1930 年 , M ulliken 通过 分子轨道
的计算就已 预言单 线态氧的 存在, 但 直至 1963 年 Khan 和 Kasa 发现 可以 用 NaOCl 和 H 2 O2 反应来产 生单线态氧才 使该领域 研究 得以迅速发展。用于1 O 2 检测的 方法 有化学发光法、 猝灭剂抑制法、 在2 H 2 O 中延 长寿命法、 产物分析法等几种方法 。其 1 中最直接的检 测方法是观察 O2 的化学发 光, 这种方法需要聚集较大量的1 O2 才能检 测出来。使用1 O 2 猝灭剂抑制 1 O2 参与的反 应, 最常使用的是类胡萝卜素, 它以物理方 式或猝灭 1O 2 而自 身并不发生任 何化学反 应。此外还有叔胺、 维生素 E 、 氮化合物、 四 甲基 乙烯、 2, 5
活性氧的检测方法
甲基 呋喃、 9, 10 二 苯基
2
酮。O2 的寿命在 H 2 O 中比在 H 2 O 中长得 多, 故在 H 2 O 中寿命延长法可以确定某个 反应是否产生1 O 2 或有1 O2 的参与。产物分 析法也可以用于1 O2 的检测。有人认为1 O2 的检测比其它活性氧困难。在微粒体等完 整细 胞器中检测 1 O2 已 获得成功。但 在植 物方面, 尤其是完整叶绿体中 O2 的检测仍 然不完善。蒋 明义等 [ 20] 参照 Chakraborty 和 T ripat hy [ 21] 所采用的方法 , 以 H is( 组氨 酸) 作为1 O2 的分子捕获 剂, 用分 光光度法 检测 NDA( 对亚硝基二甲基苯胺) 的漂白反 应作 为1 O2 产生的指标。检测了水稻 叶绿 体中1 O 2 的产生 , 实验证实, 在- 0. 8MP a 渗 透胁迫及 250 mol. m
[ 16] [ 15]
幼苗叶片叶绿体中由 1 O2 所介导的 NDA 漂 白作用明显加强, 这种漂白作用可为 1O 2 的 清除剂 Car 显著抑制, 而为促进 O 2 形成 的光敏化剂 RF( 核黄素 ) 和 NB( 亚甲基蓝 ) 所促进, NDA 的漂白与 Car 、 Chl 的 降解及 膜脂过氧化产物 MDA 的增加存在 极显著 的相关 关系。用以上 各种方法对 1 O2 进行 检测 的报 道尚 少, 也许是 1 O2 在体 内寿 命 短 , 难以检测的缘故。 5 脂类过氧化物( M DA) 的检测
展。直到 1969 年 McCord 和ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱFridovich[ 1] 发现 了清 除 超氧 化物 自由 基的 超氧 物 岐化 酶 ( SOD) 并研究其生物学作用, 提出了氧毒性 的超氧化物自由基学说后 , 人们才开始逐步 认识到自由 基在生物 体内存在 的危害 , 同 时 , 由于分子生物学的迅猛发展, 研究短寿 命的自由基的方法有所突破, 带动自由基生 物学的发展 , 使自由基生物学这门学科渗透 到医学、 植物生理学、 病理学等许多学科中, 显示出其极大的发展前景。 生物学、 医学最先研究活性氧的方法, 有脉冲射解 、 快速停流 、 顺磁共振和自旋 搜集技术 [
dcfh检测活性氧步骤
活性氧：活性氧(reactive oxygen species , ROS)是体内一类氧的单电子还原产物,，是电子在未能传递到末端氧化酶之前漏出呼吸链并消耗大约2 %的氧生成的，包括氧的一电子还原产物超氧阴离子(O2·-)、二电子还原产物过氧化氢(H2O2)、三电子还原产物羟基自由基(·OH)以及一氧化氮等。
ROS 的产生主要是线粒体由状态Ⅲ向状态Ⅳ转换中高氧的环境和高还原态的呼吸链使大量电子漏出并还原氧分子而形成。
基本信息：氧是生命运动过程中不可缺少的一种气体, 人们一旦处于缺氧或者供氧不足的环境中, 就会感到憋气的痛苦甚至死亡。
所以, 自从1770 年代初英国人Joseph Priestley 发现氧以来, 氧一直被人们认为是一种对人体百益而无一害的气体。
可是, 科学技术迅速发展起来的今天, 我们知道, 不管是空气中的氧还是水中的溶解氧都具有较高的氧化性, 与一般的金属铁一样, 处于空气中的人体各部位都在不断地受到氧的腐蚀而“生锈” , 当然这种腐蚀与铁不同, 它体现在人体的细胞水平上。
特别是人体各种器官随着年龄的增大不断地老化更是这种腐蚀“生锈”的直观表现。
1969 年McCord 与Fridovich 发现, 在生化反应过程中O2 获得一个电子还原生成超氧自由基(O-2 ), 进而经过红血球的分离精制后获得O-2 的清除灭活酶, 并命名为超氧化物歧化酶(superoxide dismultase , SOD)。
这一发现激发了大批的科学研究者致力于O-2 的生成过程、反应活性、毒性、生理和病理等等各方面的研究, 去探索解明SOD 在生理学上的意义。
同时由O-2 衍生出来的过氧化氢(H2O2)、羟自由基(·OH)、激发态氧(一重态氧或称单线态氧,O2)也受到了人们的重视。
所谓的活性氧, 概括地说, 是指机体内或者自然环境中由氧组成, 含氧并且性质活泼的物质的总称:主要有一种激发态的氧分子, 即一重态氧分子或称单线态氧分子(O2);3 种含氧的自由基, 即超氧阴离子自由基(O-2 )、羟自由基(·OH)和氢过氧自由基(HO2);2 种过氧化物, 即过氧化氢(H2O2)和过氧化脂质(ROOH)以及一种含氮的氧化物(NO)等。
活性氧检测试验方案
活性氧检测试验方案活性氧检测是一种用于评估物质或生物体中产生的活性氧（ROS）水平的方法。
ROS是一类极具活性的氧化物质，可在正常细胞代谢中产生，并参与多种生理过程。
然而，当ROS的产生超过细胞的抗氧化能力时，就会导致氧化应激，对细胞和组织造成损害，并与一系列疾病的发生和发展相关。
为了测量活性氧的水平，可以使用一系列的试剂和方法。
以下是一个可能的活性氧检测实验方案：实验材料：1.活体组织样本（例如细胞培养物、小鼠肝脏组织等）2.PBS缓冲液3.DCFDA（二氟荧光二乙酸盐）染料溶液4.活性氧产生剂（例如H2O2）5.抗氧化剂（例如维生素C）6.血红素（免疫染色用）实验步骤：1.准备工作：a.将DCFDA溶液按照说明书的要求稀释到适当的浓度。
b.用PBS缓冲液洗涤和预处理样本，去除可能影响实验结果的其他物质。
2.观察基础水平：a.取一小部分样本，不加任何试剂，放入显微镜观察台下。
b.使用适当的增强型荧光显微镜观察样本的荧光强度和分布。
3.活性氧产生实验：a.取适量的样本放入显微镜观察台下。
b.添加一定浓度的活性氧产生剂（例如H2O2），混匀。
c.立即在显微镜观察荧光信号的变化。
d.记录荧光信号的强度和分布。
4.抗氧化剂实验：a.取适量的样本放入显微镜观察台下。
b.添加一定浓度的抗氧化剂（例如维生素C），混匀。
c.立即在显微镜观察荧光信号的变化。
d.记录荧光信号的强度和分布。
5.数据分析：a.使用图像分析软件测量荧光信号的平均强度和荧光染色的面积。
b.对每个样本的数据进行统计分析，如平均值、标准误差等。
c.使用统计学方法（如t检验或方差分析）比较不同处理组之间的差异。
总结：通过以上步骤，可以获得活性氧的水平，评估其在不同条件（如活性氧产生剂和抗氧化剂的存在与否）下的变化。
这个实验方案可以用于研究活性氧在细胞和组织中的作用，以及评估抗氧化剂的功效。
活性氧的检测方法
活性氧的检测方法活性氧（reactive oxygen species，ROS）是指一类具有高度活性的氧气衍生物，包括超氧阴离子（superoxide anion，O2·-）、过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）、羟基自由基（hydroxyl radical，·OH）等。
它们在正常生物体内起到重要的信号传导和正常生理功能的调节作用，但当其产生过量或生物体的抗氧化防御系统受损时，可引发氧化应激反应，导致蛋白质、脂质、DNA等生物分子的氧化损伤，从而参与多种疾病的发生和发展过程。
由于活性氧的生成和清除速度都非常快，直接测量活性氧的浓度和活性是非常困难的，因此科学家们开发了多种间接检测方法。
以下是几种常见的活性氧检测方法。
1. 过氧化物酶法（oxidative enzyme assay）该方法通过利用特定的过氧化物酶（例如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶等）将活性氧转化为可测量的反应物质。
测量该反应物质的生成速率或浓度变化，可以间接反映出活性氧的产生量或含量。
2. 化学荧光探针法（chemical fluorescence probe）该方法使用特定的化学荧光探针，探针分子结构中含有特异性的活性氧敏感团或特异的活性氧响应元件。
当探针与活性氧反应时，荧光强度变化或荧光发射峰位移动，可以通过荧光光谱或荧光显微镜等技术手段来测定活性氧的产生量或含量。
3. 化学显色法（chemical colorimetric assay）该方法基于活性氧与一些特定的化学物质（如戊二醛、硫代巴比妥酸钠等）反应生成产物，这些产物具有特定的吸收光谱，可以通过比色法来测定活性氧的产生量或含量。
该方法简便易行，仪器设备要求低，适用于较低灵敏度的活性氧检测。
4. 高效液相色谱法（high-performance liquid chromatography该方法通过高效液相色谱技术将待测样品中的活性氧产生物（如羟基自由基产生物3,4-二羟基苯乙酮酸）分离和检测，根据活性氧产生物的峰面积或峰高变化来测定活性氧的产生量。
DCFHDA活性氧检测方法
DCFHDA活性氧检测方法DCFH-DA是2,7-二氯二氟荧光酮酰丙二酸对苯二酰肼的简称。
它是一种常用的活性氧检测分子，可用于检测细胞内和细胞外生成的活性氧物种，如超氧阴离子、过氧化氢和羟自由基等。
下面介绍DCFH-DA活性氧检测的原理、操作步骤和应用。
原理：DCFH-DA分子是无色的，能够穿过细胞膜进入细胞内。
一旦进入细胞内，DCFH-DA会被内源酯酶迅速水解成无色的2',7'-二氯荧光酮酮基（DCFH），该分子对氧自由基不敏感。
当细胞内有活性氧物种存在时，这些活性氧物种（如超氧阴离子、过氧化氢等）会氧化DCFH为高度荧光的2',7'-二氯荧光酮基（DCF）。
DCF的荧光强度与活性氧物种的浓度成正比，因此可以通过测量DCF的荧光强度来间接测量活性氧物种的生成。
操作步骤：1.将DCFH-DA溶解在适当的有机溶剂（如二甲基亚砜、乙酸乙酯等）中制备为一定浓度的工作溶液。
2.将细胞或组织样品均匀洒在培养皿或载玻片上。
3.向细胞或组织样品中加入适量的DCFH-DA工作溶液，使其浓度达到合适范围（通常在1-10μM之间）。
4.将细胞或组织样品置于37°C的孵化箱中培养一定时间，通常为30分钟。
5.随后，用PBS或其他缓冲液洗涤样品，以去除细胞外的游离DCFH-DA。
6.在荧光显微镜下观察细胞的荧光图像，并使用适当的激发波长和发射波长测量荧光强度。
应用：DCFH-DA活性氧检测方法可以广泛应用于生物医学研究中，如研究细胞氧化损伤、炎症反应、抗氧化剂活性等。
此外，DCFH-DA还可用于评估药物的抗氧化性能、测量环境中的活性氧物种水平等。
这种方法具有快速、灵敏和简便的优点，广泛应用于细胞和分子生物学研究领域。
总之，DCFH-DA活性氧检测方法通过测量DCF的荧光强度来间接测量细胞内和细胞外活性氧物种的生成水平。
它是一种简单而有效的方法，可以广泛用于活性氧相关的研究和分析。
活性氧测定的基本原理与方法
活性氧测定的基本原理与方法活性氧测定是指测定细胞或生物体中活性氧分子的浓度，活性氧是一类具有高度活性的氧分子，包括一氧化氮（NO）、超氧化物自由基（O2-）、羟基自由基（•OH）和过氧化物自由基（ROO•）等。
活性氧在生物体内的生成与清除是维持生物体正常代谢的重要环节，但过多的活性氧会对细胞结构和功能产生损害，甚至引发疾病。
1.超氧自由基（O2-）测定方法：超氧自由基的测定通常采用还原性品质荧光法。
超氧自由基与荧光染料2,7-二氨基苯基荧光素（DHE）反应生成有荧光属性的产物。
通过测定荧光强度来反映细胞或生物体中超氧自由基的浓度。
2.羟基自由基（•OH）测定方法：羟基自由基的测定通常使用t-Butanol为指示剂，通过和羟基自由基发生反应形成酚类产物，并通过分光光度计测定反应后酚类产物的吸光度来测定羟基自由基的浓度。
3.过氧化氢（H2O2）测定方法：过氧化氢是常见的活性氧物种之一，可以通过酶法或化学法进行测定。
其中酶法常采用过氧化酶（catalase）催化过氧化氢与4-氨基安替比林（4-AAP）反应生成有色产物，并通过分光光度计测定反应后产物的吸光度来测定过氧化氢的浓度。
4.一氧化氮（NO）测定方法：一氧化氮是一种重要的信号分子，在体内具有多种生理功能。
目前常用的一氧化氮测定方法是Griess法。
该方法将一氧化氮转化为一种比较稳定的化合物（例如亚硝酸盐），再通过与N-(1-Naphthyl)ethylenediamine反应生成有色产物，通过分光光度计测定反应后产物的吸光度来测定一氧化氮的浓度。
除了上述方法外，还有许多其他常用的活性氧测定方法，如电子自旋共振（ESR）法、化学发光法、荧光法等。
总之，活性氧测定方法可以根据具体的活性氧物种的特性和试剂的选择进行优化，通过测定与活性氧反应后的产物或信号来反映活性氧的浓度。
这些方法在生物医学研究和临床实践中具有重要的应用价值，可用于研究活性氧在生物体内的生成与清除机制，为研究相关疾病的发生机制和寻找相关的治疗方法提供参考。
dhe探针检测ros步骤
dhe探针检测ros步骤
使用DHE（二氢乙啶）探针检测ROS（活性氧）的步骤如下：
1.溶解DHE成为stock溶液。
2.将DHE加到需要检测的样品中，如分离后的线粒体样品。
一般所用DHE浓度为5~20
μM。
将加有DHE的样品在适宜温度（如37°C）下孵育一定时间（如30分钟），让DHE能进入细胞内。
3.用荧光分光光度计检测该样品的荧光强度。
DHE在与ROS发生反应后，能被氧化成为
红色荧光的二氢乙烯八酮(DHEO)。
因此检测荧光强度即可反映ROS的含量。
激发波长一般选择为485nm，发射波长选择580nm。
4.根据标准曲线，计算出样品中的ROS浓度。
制作DHE标准曲线时，需要使用已知浓度
的H2O2或其他ROS作为标准品。
5.在不同时间点重复检测，以观察ROS浓度的变化。
请注意，使用DHE检测ROS的主要限制在于DHE自身也可能产生背景荧光，有部分DHE可能还原成未氧化的形式。
但总的来说，DHE仍是一种敏感、有效的ROS检测方法，它能很好地反映线粒体样品中ROS的变化情况。
流式细胞术检测活性氧
流式细胞术检测活性氧一，摘要活性氧（ROS）是包含羟基自由基或具有不成对电子的过氧化物的分子。
在健康的需氧细胞中，ROS是作为氧化磷酸化，氧化还原酶或金属催化的氧化产物以受控速率自然生成的。
但是，在某些应激条件下，尤其是暴露于环境氧化剂和某些导致氧化应激的药物中，可能会诱导产生ROS。
过量的ROS可能会破坏包括DNA，蛋白质和脂质在内的细胞构件，最终导致细胞死亡。
细胞渗透性2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（H2DCFDA）是广泛使用的ROS指示剂。
还原的非荧光素H2DCFDA可被细胞内ROS氧化并转化为荧光2'，7'-二氯荧光素（DCF）。
本文应用H2DCFDA标记细胞内ROS，并通过流式细胞仪检测DCF强度。
二，材料和试剂1.需要分析的细胞(本方案在A549, CL1-0, 和IMR-90 细胞上成功实践过)2.Dulbecco's Phosphate-buffered saline (DPBS)3.2’,7’-dichlorofluorescein diacetate (H2DCFDA) (Life Technologies, InvitrogenTM, catalog number: D-399 )4.Anhydrous DMF (N,N-dimethylformamide) (Sigma-Aldrich, catalog number: 227056 )5.N-acetyl-L-cysteine (NAC) (Sigma-Aldrich, catalog number: A7250 )6.Hydrogen peroxide (H2O2) (Sigma-Aldrich, catalog number: 349887 )7.5 ml polystyrene BD falcon round-bottom tube with cell strainer cap (BD Biosciences, catalog number: 352235 )8.Sodium Chloride (NaCl)9.Potassium Chloride (KCl)10.Potassium Phosphate, monobasic (KH2PO4)11.Sodium Phosphate, dibasic (Na2HPO4)12.DPBS (参见配方)13.H2DCFDA stock (10 mM) (参见配方)14.NAC stock (1 M) (参见配方)15.H2O2 stock (1 M) (参见配方)三，设备1.流式细胞仪2.水浴锅3.离心机四，过程1.将细胞用完全培养基在37 °C和5% CO2的6cm皿中培养。
光反应性活性氧(ROS)测定试验方法
光反应性活性氧（ROS）测定试验方法Reactive Oxygen Species(ROS)Assay for Photoreactivity1范围本方法规定了化妆品用化学原料光反应性活性氧（ROS）测定试验的基本要求和方法。
本方法适用于预测化妆品用化学原料的潜在光毒性。
2试验目的预测化妆品用化学原料是否具有潜在光毒性。
3定义下列术语和定义适用于本方法。
3.1光反应性Photoreactivity化学物质由于吸收光子而与另一个分子发生反应的性质。
3.2光毒性Phototoxicity皮肤一次接触化学物质后，继而暴露于紫外线照射下所引发的一种皮肤毒性反应，或者全身应用化学物质后，暴露于紫外线照射下发生的类似反应。
本方法所述光毒性包括光刺激性、光过敏性和光遗传毒性。
3.3辐照度Irradiance照射到某一表面的紫外线或可见光的强度，单位为瓦每平方米（W/m2）或毫瓦每平方厘米（mW/cm2）。
3.4光照剂量Dose of light照射到某一表面的紫外线或可见光的量[=强度×时间（秒）]，单位为焦耳每平方米（J/m2）或焦耳每平方厘米（J/cm2）。
3.5活性氧种类Reactive Oxygen Species，ROS活性氧种类，包括单线态氧和超氧阴离子。
3.6单线态氧Singlet Oxygen，SO由光辐照化学物质通过Ⅱ型光化学反应产生的一种自由基。
3.7超氧阴离子Superoxide Anion，SA由光辐照化学物质通过I型光化学反应产生的一种自由基。
4试验原理一些具有光反应性的化学物质暴露于紫外线时，吸收某一波长光子，诱导发色团激发，激发能量转移到氧分子上，发生光化学反应，产生活性氧（包括单线态氧SO和超氧阴离子SA），活性氧是光毒性反应中的重要中间物质。
单线态氧和咪唑反应生成的过氧化物中间体对N,N-二甲基-4-亚硝基苯胺（RNO）具有漂白作用，使其在440nm下的吸光度降低。
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活性氧检测试验方案
一：实验原理
活性氧检测试剂盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit)是一种利用荧光探针DCFH-DA 进行活性氧检测的试剂盒。
DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。
而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。
细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。
检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。
本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂Rosup，以便于活性氧的检测。
Rosup是一种混合物(compound mixture),浓度为50mg/ml。
二：实验步骤
⑴取20 ul DCFH-DA（试剂盒有100ul)按照1:1000用无血清培养液即20ml稀释DCFH-DA，使
终浓度为10微摩尔/ 升。
⑵吸取12ml细胞培养液（细胞浓度为一百万至二千万/毫升）加入24孔板中（设3个阳性对照， 3个浓度梯度分别做3个重复，每孔加入1ml细胞培养液），放入细胞培养箱中培养。
⑶培养24小时后去除细胞培养液，每孔加入稀释好的DCFH-DA 1ml（加入的体积以能充分
盖住细胞为宜）。
⑷ 37℃细胞培养箱内孵育20分钟。
⑸去除孵育后的DCFH-DA稀释液，每孔加入1ml无血清细胞培养液洗涤细胞（重复洗涤三次，
以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA）。
洗涤完后每孔加入1ml细胞培养液。
⑹在酶标仪下使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前荧光的强
弱即OD值。
⑺实验组中每孔加入已配制好的松茸多糖20ul(浓度分别为5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml),
对照组中加入阳性对照物Rosup 20ul，放入细胞培养箱内继续培养。
⑻4小时后，在酶标仪下使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激后
荧光的强弱即OD值。
三：数据处理
实验组：癌细胞活性氧降低率=（刺激前OD值－刺激后OD值)/刺激前OD值×100%
阳性对照组：癌细胞活性氧升高率=（刺激后OD值－刺激前OD值)/刺激前OD值×100% 四：注意事项
⑴探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。
⑵尽量缩短探针装载后到测定所用的时间(刺激时间除外)，以减少各种可能的误差。