第七章_现代生物学

体展示系统依赖于细胞内基因的表 达，所以，一些对细胞有毒性的分子如生物 毒素分子，很难得到有效表达和展示。 (5) 从建库开始，密码子的选择与寡核苷酸的合 成，即编码肽的基因就带有一定的偏爱性， 这就从先天决定了肽库复杂度即多样性的局 限性。
(5)筛选酶抑制剂
• Norgren等利用该技术筛选到了7种酶系种 的6种抑制剂，Dennis从肽库中筛选到能非 竞争性地抑制丝氨酸蛋白因子VIIa活性的 肽段
3 噬菌体展示技术的局限性
(1)在噬菌体展示过程中必须经过细菌转化、噬 菌体包装，有的展示系统还要经过跨膜分泌 过程，这就大大限制了所建库的容量和分子 的多样性。 (2)不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的 表达，因为有些蛋白质功能的实现需要折叠、 转运、膜插入和络合。作为噬菌体的宿主， 大肠杆菌的生物合成系统有本身的表达限制， 不能进行氨基酸的修饰，蛋白质的糖基化或 不能合成D型氨基酸。
1 目的蛋白-α凝集素表面展示系统
• 此系统将目的蛋白作为 N 端，与α凝集素 C
端部分融合，目的蛋白经α凝集素展示于酵母
细胞表面。
• α凝集素共价连接到细胞壁的葡聚糖上，其锚
定能力由蛋白质 C 端 320 个氨基酸决定，富 含 Ser/Thr 残基。
• 迄今，已经有多个应用α凝集素的 C 端作为 融合蛋白的报道。第一个通过此系统表达的 异源蛋白是α-半乳糖苷酶（如图 ）。
• 将抗体分子片段与噬菌体外壳蛋白融合，使之
表达于噬菌体颗粒的表面，就形成了噬菌体抗
体。将全套的抗体可变区基因设计适当引物克
隆出来，组建到表达载体内，再表达到许多噬 菌体颗粒表面，则得到噬菌体抗体库（phage
antibody library）。
（3）生产高效低价疫苗 它能 方便地大量生产疫苗用抗原 表位，可以在同一噬菌体上 展示多个具有保护性作用的 抗原决定簇，构建多价疫苗。
与噬菌体肽库相比，细菌展示肽库还可用荧 光激活细胞分选技术（FACS）进行更多种细菌表面展示系统
• 细菌的外膜蛋白、脂蛋白、表面附属结构亚单位如 鞭毛、菌毛
• 晶核蛋白（Icenucleation protein，INP）、自体转
运蛋白（Autotrans-porter）、S2 层蛋白
• 枯草杆菌的芽胞外膜，L2 型大肠杆菌和变形 杆菌的细胞膜
Байду номын сангаас
四、酵母表面展示技术
• 酵母表面展示系统是继噬菌体展示技术创立后 发展起来的真核展示系统。酵母的蛋白质折叠 和分泌机制与哺乳动物细胞非常相似，对人的 蛋白质表达和展示更具优越性。酵母细胞颗粒 大，可用流式细胞仪进行筛选和分离。目前报 道的两种酵母展示系统分别以 α 或 a 凝集 素作为融合骨架。
• 1990年，George等证明噬菌体不会因外 源性DNA片段的插入而影响其本身的粘 附、侵入及整合。这种带有外源性基因 片段的噬菌体感染宿主菌表达出外源性 基因产物和PIII的融合体——融合壳蛋 白，由于PIII的特殊定位，外源性片段 得以在噬菌体表面表达，并同时保持了 本身的三维结构和功能，进而使噬菌体 成为一个理想的携带工具。
processing
2 应用
（1）噬菌体展示技术与蛋白质工程
将编码随机多肽的寡核苷酸克隆到 噬菌体筛选。同样，利用噬菌体展示 cDNA ，可筛选出特定的蛋白质或基因。
（2）噬菌体展示技术与抗体工程
噬菌体展示技术的出现使抗体工程进入 第三次革命。噬菌体展示技术的成功应 用之一就是噬菌体抗体库构建和单克隆 抗体的筛选，利用此项技术可筛选到亲 和力和特异性都令人满意的并且修饰过 的抗体。
（4）研究诊断用疫苗 （两 种情况）
1 在抗原决定簇已知的情况下，构建重组噬 菌体可以为血清学分析提供大量的抗原来源， 因为它不需要裂解宿主细胞而直接分泌到培 养基中；抗原制备纯化简单，成本低下；噬 菌体颗粒稳定，易于长期保存；能在同一个 噬菌体同时展示不同的病原体的抗原决定簇。
• 2 在预先不知道诊断用靶抗原的情 况下，使用患者血清从抗原决定簇 库中筛选出展示特异性抗原决定簇 的噬菌体，这种噬菌体只能与病人 血清抗体反应，而不能与正常人的 血清反应，从而建立起疾病的特异 性诊库作为流动相， 而将与欲选择的重组基因产物的特异性 的配体（或称靶分子）扩 增，并反复数轮淘选，即可将无用的基 因去掉而将有用的基因富集并分离出来。
Panning
2 a凝集素-目的蛋白表面展示系统
• 这是一种将目的蛋白作为 C 端与a 凝集 素 Aga2p 亚基的 N 端融合的表面展示 系统。a 凝集素通过与α 凝集素相似的 连接锚定在细胞壁上。与α凝集素不同， a 凝集素由两个亚单位的糖蛋白组成。
a-凝集素的组成
• a-凝集素由核心亚单位（Aga1p）和结合 亚单位（Aga2p）两个亚单位组成， Aga1p共 725 个氨基酸，合成后被分泌 到胞外，与酵母细胞壁的 β－葡聚糖共 价连接。Aga2p 共 69 个氨基酸，合成 后也被分泌到胞外，但其通过 2 个二硫 键与 Aga1p 结合，仍与酵母细胞相连。
• 目前，能用于蛋白质、多肽展示的噬菌体系 统有： 丝状噬菌体展示系统 λ 噬菌体展示系统 T4 噬菌体展示系统 T7 噬菌体展示系统 • 其中，T7 噬菌体系统可以高、中、低拷贝展 示不同分子量的蛋白，是目前最为理想的展 示系统。
单链丝状噬菌体展示系统 P III 展示系统，主要用于获得高 亲和力的克隆，形成单价表面展示体 系 P VIII 展示系统，主要用于筛选亲 和力较低的克隆，形成多价表面展示 体系 P VI 展示系统
Phage structure:
Fiber structure
1 原理
• 具体来讲噬菌体展示技术就是将待筛选 NotI 基因插入噬菌体信号肽序列与主要衣壳 E-tag Amber stop pCANTAB 5E-scFv Ap 蛋白基因（主要是基因Ⅷ或基因Ⅲ）之 5243 bp fd gene3 间，构成融合蛋白噬菌体库。表达的融 合蛋白可以呈现在噬菌体表面，但不影 M13 ori 响噬菌体的完整性和活性。
T4噬菌体展示系统 其病毒颗粒在宿主细胞内组装，不经 过分泌途径，因而其表面展示多肽的 范围更广，尤其适用于研究那些不能 被大肠杆菌分泌的复杂蛋白质
λ噬菌体展示系统 （同上）可展示有活性的大分子蛋白 （100kDa以上）以及对宿主细胞有毒性 的蛋白，在后基因组时代前景相当可 观
应用的基本原理—— （Panning)
核糖体展示技术的基本原理
• 核糖体展示技术的基本原，并置于具有偶联转录-翻译的无细胞翻译系统中 孵育，使目的基因的翻译产物展示在核糖体表面。去 掉3′端的终止密码子,从而成功地使核糖体停留在 mRNA3′末端,将蛋白质和mRNA连接在一起。并形成 “mRNA-蛋白质-核糖体”三元复合体，最后利用常 规的免疫学检测技术，通过固相化的靶分子直接从三 元复合体中筛选出感兴趣的核糖体复合体，再利用 RT-PCR 扩增，进行下一循环的富集和选择，最终筛 核糖体展示原理示意图 选出高亲和力的目标分子（如图所示）。
面的酶反应产物，因而展示在细菌表面的蛋白 很容易通过荧光探针显示出来，荧光产物和细 胞表面酶反应产物之间的物理连接是筛选蛋白 质库的一个非常有价值的特性，同时也是定量
检测单细胞酶催化活力的关键。这种技术是当
前惟一能够定量检测单细胞水平和大量突变体 酶催化活性的方法。
• 流式细胞仪结合细菌表面展示技术具有以下 几个明显的优点： 能够定量分析酶活性、同时测定多个参数并 且对每个观察到的克隆进行记录。
二、核糖体展示技术与 mRNA 展示技术
• 核糖体展示（Ribosome display）技术与 mRNA 展示技术由于在体外无细胞翻译体系 中进行，用 mRNA 的可复制性，使靶基因 （蛋白）得到有效富集而且能够增加表达的蛋白质 溶解度。
概念
• 表面展示技术是利用基因工程手段将外 源基因或一组一定长度的随机寡核苷酸 片段克隆到特定的表达载体中，使其表 达产物与外膜蛋白或噬菌体外壳蛋白以 融合蛋白的形式呈现在细胞表面或噬菌 体表面。
一、噬菌体展示技术
• 噬菌体展示技术（phage display techniques，PDT） 是将外源肽或蛋白质与特 定噬菌体衣壳蛋白融合并 展示于噬菌体表面的技术 （如右图所示）。1985 年 Smith 等首次应用了该 技术。大型突变（含1012~1013 个独立序列）。
mRNA 展示技术原理示意图
• 嘌呤霉素是一种分子质量小、化学性质为稳定 的氨酰tRNA类似物。当3‘端带有嘌呤霉素连 接子的mRNA在体外翻译系统中完成翻译时， 嘌呤霉素模拟tRNA末端的氨酰基结构，进入 核糖体的A位点，抑制了蛋白质的翻译，在新 生肽链和嘌呤霉素的O-甲基酪氨酸之间形成 稳定的酰胺键，使mRNA 的3’端与多肽的羧基 端共价结合起来。
I.
II. 利用固定于固相支持物的靶分子，采用适 当的筛选方法，洗去非特异结合的噬菌体， 筛选出目的噬菌体； III. 外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面， 而其编码基因作为病毒基因组中的一部分 可通过分泌型噬菌体噬菌体的PIII蛋白定位特殊， 定位于噬菌体的尾部，其氨基末端为噬 菌体结合F纤毛 噬菌体的衣壳蛋白有很大的可塑性 大部分的蛋白质都可在其表面表达
噬菌体展示载体 pCANTAB5E示意图
g3 signal sfiI scFv
•
噬菌体展示技术是第一个真正用于体外高 通量筛选的方法。其建立基于三个原则：
在衣壳蛋白基因（主要是基因Ⅷ或基因Ⅲ） 的 N 端插入外源基因，形成的融合蛋白表 达在噬菌体颗粒的表面，不影响也不干扰 噬菌体的生活周期，同时保持了外源蛋白 的天然构象，并能被相应的抗体或受体所 识别 。
1988年Parmley和Smith将B-Gal表达于噬 菌体的表面，并证实该蛋白有生物活性， 可以被相应的抗体识别。随后，许多有功 能的蛋白都被表达于噬菌体的表面，包括 分泌性蛋白(如抗体、生长激素)、细胞内蛋 白和酶类，为这些蛋白的基因工程改造奠 定了基础。 从理论上讲，任何蛋白只要能够分泌到细 菌周质腔均可被表达于噬菌体的表面。