生物发光

。这一性质已经被应用于实时观察细胞内Ca2+离子的流动。
水母发光蛋白的发现推动了人们进一步研究海洋水母并发现 了绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）。绿色荧 光蛋白的多肽链中含有特殊的生色团结构，无需外加辅助因 子或进行任何特殊处理，便可以在紫外线的照射下发出稳定
•DNA探测：溴化乙啶 •DNA芯片：需要对基因组探针进行荧光标记，最后通过荧 光信号确定靶标序列。 •免疫学中的免疫荧光检查法：对抗体进行荧光标记，从而可 以根据荧光的分布和形态确定抗原的部位和性质。
水母发光蛋白最早是从海洋生物水母（Aequorea victoria） 中分离出来的。当它与Ca2+离子共存时，可以发出绿色的荧光
aequorin
经过对Aequorea victoria的研究发现，水母的发 光可由蛋白质aequorin产生，或是aequorin和另一蛋白 质GFP共同作用产生。
Aequorea victoria
aequorin
Aequorin共含196个胺基酸，结构可分为apoaequorin(一种
apoprotein)和coelenterazine(一种luciferin，同时亦为cofactor)。
发光菌简介
发光菌为什么要发光
为了修补DNA :紫外线使DNA 遭受损伤，细菌往往通
过光解酶来修复DNA，但光解酶必须在光照的条件下才能
工作。 这个理论同样可以解释细菌聚集在一起时发光量剧增 的现象。假使细菌聚集产生大量的代谢废物，这些代谢废 物对细菌的DNA 也是有损害的，团聚触发了DNA 的修复机 能。
丝胺酸(Ser)
酪胺酸(Tyr)
甘胺酸(Gly)
GFP的发光相关氨基酸序列Ser65-Tyr66-Gly67(丝氨酸-酪氨酸-甘
氨酸)，经过翻译作用后，发光基团会经由一连串自体催化：Ser65 和Gly67首先进行一个极为快速的环化作用，随后Tyr66的side chain 被O2氧化(耗时数小时)，形成p-hydroxybenzylidene-imidazolidone 共轭结构。
1994年Chalfie等首次在大肠杆菌细胞和线虫中表达了 GFP，开创了GFP应用研究的先河。 之后很快发现GFP能在多种异源细胞中表达，GFP在 细胞学、分子生物学和医学、病毒学等领域中迅速掀 起了一股热潮。



GFP的发光特性

GFP吸收的光谱,最大峰值为395nm(紫外),并有一 个峰值为470nm的副峰(蓝光);发射光谱最大峰值 为509nm(绿光),并带有峰值为540nm的侧峰 (Shouder)。
apoaequorin欲发挥正常功能常须与cofactor结合， apoaequorin与 cofactor分开时称apoprotein，cofactor可为有机或无机物。 Apoaequorin含有189个胺基酸，位于aequorin外部周围，使 内部形成一体积600A3的核心；apoaequorin有三个区域能结合钙 离子。 Coelenterazine是一种常见于腔肠动物(coelenterate)的
Luciferin
在形形色色的生物世界中，有着一群会自行发光的生 物，他们的存在令人感到兴趣。从生理构造简单的微生物到复
杂的脊索动物，均有一些能自行发光的物种。经由学者们持续
的研究，终于发现生物体发光的秘密。这些物种体内常常含有 发光素(Luciferin)，而这类物质正是生物发光的关键所在。
Luciferase
coelenteramide 和一分子二氧化碳，coelenteramide的电子处于激发 态，降回基态后放出一波长469nm的蓝光。因为可与钙离子结合， aequorin被用于检测细胞钙离子浓度，其好处为aequorin不会影响
被植入细胞的正常生理作用，且观测方便，不须给予任何外加光源。
coelenterazine的反应变化机制
sheet彼此之间互为anti-parallel strands，能够形成
氢键，因此整个结构相当稳定，能够避免ligand如O-
破坏其中的发光基团。整体而言，GFP为一相当稳
定之蛋白质，在极端的环境中(如Ph>12或Ph<4)才会
发生变性。
GFP的发光基团序列为Ser65-Tyr66-Gly67(丝氨酸-酪 氨酸-甘氨酸)
包括细菌、植物、哺乳类动物、酵母菌……等等。
GFP由238个胺基酸组成。其外围是由11条-sheet构成的圆 筒状结构；发光基团位于圆筒的几何中心附近，受到保护；圆 筒顶端及底部的-helix片段具有支持发光基团的作用。此种特
Leabharlann Baidu
殊的蛋白质构型又被称为-can。两个GFP会形成dimer。
-can结构能够有效保护发光基团，因为11-
ATP 利用酵素分解，在加入酵素促使活微生物细胞中之ATP
释放出来，接着就可以加入荧光素，让它与ATP 作用产生荧 光，最后在以ATP 生物冷光仪读取相对吸光值来判断乳品的 品质.
4.生化和医药
荧光在生化和医药领域有着广泛的应用。人们可以通过化学 反应把具有荧光性的化学基团粘到生物大分子上，然后通过 观察示踪基团发出的荧光来灵敏地探测这些生物大分子。 •采用荧光标记的链终止剂的DNA测序
生物发光
2008年度诺贝尔化学奖
姓名：钱永健 英文：Roger Tsien，罗杰钱 性别：男 出生：1952年 生于：纽约 国籍：美国 祖籍：中国浙江杭州 堂叔：钱学森，中国导弹之父 16岁即以金属如何与硫氰酸盐结合为题 获西屋科学天才奖（The Westinghouse Science Talent）；20岁获哈佛大学学士（ 化学和物理，Witha National Merit Scholarship）；剑桥大学博士及博士后（ 生理学）曾获沃尔夫奖（Wolf Prize in Medicine，2004），全美化学学会，蛋白 质学会等多项大奖
Aequorin 与 水母发光
• 水母，属腔肠动物。身体形状 像伞，口在伞盖下面的中央， 口周围有４条口腕与胃腔相通 ，伞盖周围有许多触须，触须 上有丝状的刺，是用于进攻和 自卫的武器，也用来捕食。
水母种类很多，世界 上现有万余个品种， 如海月水母、桃花水 母、海蜇等。水母大 多生活在浅海中。
GFP(Green Fluorescent Protein)
在水母体内，GFP接收Aequorin的蓝光
(470nm)，发光基团电子激发，然后跃迁回到基态，
能量以荧光形式散发。该共轭结构的形成不需额外
的辅助因子或酵素参与，因此GFP相当适合作为
protein tag，且目前已证实在多种物种体内均能表达，
luciferin，分子中心的氮原子脱除氢离子，经电子对转移和一分
子氧气形成过氧化物(aequorin的chromophore)，位于aequorin的 核心。Chromophore为发光基团，是一个发光物质发光的关键区 块。
apoaequorin和三个钙离子结合，其构形会改变，成为一个核
心chromophore的氧化酶，催化不稳定的四边环脱除，生成
共轭结构
生物发光的应用 1.照明上的应用
生物发光的机制其实是一种非常具有经济效益
的发光发法。可以从萤火虫等生物体内提炼出荧光素， 但是，在生物体内荧光素的含量其实并不多，从数十 只萤火虫体内所提炼出的荧光素也仅仅只有数毫克而 已. 以这种存在量，要加以利用其实是非常困难且不 实际的. 也因此人们就开始研究人工制造合成荧光素
和荧光酶. 这样才能够真正将生物冷光好好的应用.
2. 发光菌的应用
发光菌的发光反应很容易观察，且其发光的生化反应 并不复杂，因此在生物科技上的应用有很大的潜力。例如， 发光菌可作为简便而快速的环境毒物或污染物指标；当环境
中含有生物毒素如重金属、石化污染物、氰化物、有毒气体，
甚至放射线时，均会影响发光菌的正常发光生化反应而使发 光亮度减低；毒物浓度愈高，亮度减弱的程度也愈大。因此 我们便可以利用发光细菌，开发出一种检测环境毒物的产品， 作为快速检验环境中是否含有生物毒素或排放污水是否含有

GFP需要在氧化状态下产生荧光,强还原剂能使GFP
转变为非荧光形式,但一旦重新暴露在空气或氧气 中,GFP荧光便立即得到恢复。而一些弱还原剂并不 影响GFP荧光。中度氧化剂对GFP荧光影响也不大,
如生物材料的固定、脱水剂戊二酸或甲醛等。

GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧
光抗体高,抗光漂白能力强,因此更适用于定量测定
毒性等。
3.ATP 生物冷光反应技术应用在生乳中活菌数快 速检测
ATP 生物冷光反应技术最早是美国太空总署在１９６０
年代发展出来为了检测外层空间是否有生命存在的一种技术.
其原理是将luciferin 藉由ATP 及luciferase 的存在下，作用生 成oxi-luciferin 并且放出荧光，主要就是检测ATP的存在. 这 种技术可利用在生乳活菌数的检测，也可用在设备清洁度的 评估.在检测之前首先要制备试样，先将生乳终非微生物的
的绿色荧光，作为生物分子或基因探针具有很大的优越性，
所以绿色荧光蛋白及相关蛋白已经成为生物化学和细胞生物 学研究的重要工具。 荧光显微成像技术：全内反射荧光显微镜
绿色荧光蛋白 在抗肿瘤医药研究中的应用

1962年Shimomure等首先从维多利亚水母(Aequorea Victoria)中分离出了GFP (Green-Fluorescent Protein) 。 1992年Prasher等克隆了GFP基因的cDNA，并分析了 GFP的一级结构。
发光菌在其他生物体内的作用
发光菌与乌贼间的symbiotic relationship
有发光器之乌贼或其他发光生物不会产生影子，使得在其 下面的猎食者便会以为该亮光乃由于月光所致。 第二种推测是，成群的发光生物聚集所造成的巨大光团，
将有助于恐吓猎食者的进犯。
发光器仅充当与同种生物间的沟通媒体。 发光器具有吸引猎物上前以利于自身捕食之功能。 乌贼提供了发光细菌在贫瘠的茫茫大海中一个栖所与稳 定的营养来源，而由autoinducer所控制的发光亮度与细胞密
与分析。

但因为GFP不是酶,荧光信号没有酶学放大效果,因
此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白。

由于GFP荧光是生物细胞的自主功能,荧光的产生
不需要任何外源反应底物,因此GFP作为一种广泛
应用的活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告
蛋白无法比拟的。
GFP在生物医学中的应用

GFP作为新型报告基因用于转基因研究 GFP融合蛋白用于研究蛋白质定位、移 动及相互作用 研究活细胞分子变化过程 发育分子机理研究 示踪病原菌 临床检验 在肿瘤研究中的应用
发光生物可以利用体内的发光素，经由发 光酶(Luciferase)的催化，而将自身的化学能转 换成光能。
Firefly luciferin Coelenterazine
Bacterial luciferin
萤火虫的简介
萤火虫如何发光
•生理构造-发光器
firefly luciferin发光的化学机制：
度间的关系，可同时作为乌贼及细菌间之生理讯号。
发光菌的发光机制
发光细菌的发光反应是由发光酶(luciferase) 催化，进行氧
化长链脂肪酸产生的结果，其中需要氧气及FMNH2的参与，并
于反应后发出波长为490nm的黄绿色可见冷光。
发光菌对其自身发光机制的调控
发光细菌发光亮度与其细胞密度(cell density)有很大相关性 发光细菌所含之发光调节机制---lux antoinducer
GFP在肿瘤研究中的应用

GFP在肿瘤发病机制研究中的应用


GFP在肿瘤发生发展研究中的应用
GFP的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐(FITC)很相 似,因此为荧光素FITC设计的荧光显微镜滤光片 组合同样适用于GFP观察。


尽管450～490nm(蓝光)是GFP的副吸收峰,但由 于长波能量低,细胞忍受能力强,因此更适合于活 体检测。
GFP的性质

GFP荧光极其稳定,在激发光照射下,GFP抗光漂白 (Photobleaching)能力比荧光素(fluorescein)强，特别 在450～490nm蓝光波长下更稳定。