多标记免疫荧光染色
免疫荧光双标操作方法及注意事项
在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。
双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。
(1)直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素的抗体(如抗A 和抗B)以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，即可对两种抗原进行定位和定量。
直接法简便可靠，但灵敏度较低。
(2)间接法双重免疫荧光标记：用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种抗原进行定位和定量。
使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属，且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。
免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下：1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。
2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。
3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。
4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS (1：1)。
条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。
5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。
6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。
二、注意事项1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。
2、每次试验均需设置以下三种对照：(1) 阳性对照：阳性血清+荧光标记物;(2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物;(3) 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。
三、免疫荧光双标的经验之谈1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。
免疫荧光双染
免疫荧光双染 Revised by Hanlin on 10 January 2021免疫荧光双染在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。
双重免疫荧光标记法(doubleimmunofluorescencelabelingmethod)也分为直接法和间接法。
冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤1、冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS?1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。
将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
4、加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1(TdT)和试剂2(dUTP)按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。
5、BSA封闭:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。
6、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。
（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。
8、DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。
去除PBS后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。
免疫荧光染色(多标)步骤
免疫荧光染色(多标)步骤一、免疫荧光染色的多标技术简介免疫荧光染色的多标技术是通过同时使用多个荧光染料，标记不同的抗体，从而实现对多个目标分子的检测。
该技术广泛应用于生物医学研究、免疫组化和细胞生物学等领域，可以提供更全面的信息和更准确的结果。
二、免疫荧光染色的多标步骤免疫荧光染色的多标步骤主要包括标本处理、抗原修复、非特异性结合阻断、一级抗体处理、荧光二抗处理和显微镜观察等。
1. 标本处理将待检样品制备成组织切片或细胞涂片，并固定在载玻片上。
可以使用多种组织固定剂，如乙醛、甲醛等。
固定后，需进行脱水、透明化处理，以便后续步骤的进行。
2. 抗原修复组织样本经过固定处理后，可能导致抗原的空间结构发生改变，影响后续的抗原-抗体结合。
因此，需要进行抗原修复处理，如热解、酶解等方法，以恢复抗原的免疫原性。
3. 非特异性结合阻断为减少假阳性结果的产生，需要对标本进行非特异性结合阻断。
可使用一些蛋白质，如牛血清蛋白、鱼胶蛋白等，与标本中的非特异性结合位点结合，阻断后续试剂的非特异性结合。
4. 一级抗体处理将标本与一级抗体一起孵育，使一级抗体与目标抗原结合。
一级抗体通常是由小鼠、兔子等动物制备的，可以识别与特定抗原结合的抗体。
一级抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
5. 荧光二抗处理将与一级抗体不同动物来源的荧光标记的二级抗体与标本一起孵育。
荧光二抗能与一级抗体特异性结合，从而实现对目标抗原的荧光标记。
不同荧光染料的荧光二抗可以同时使用，以实现多标的目的。
6. 显微镜观察将处理好的标本放置在显微镜下观察，可使用荧光显微镜或共聚焦显微镜等设备进行观察。
通过不同的荧光染料，可以同时检测多个目标分子的位置和表达水平。
三、免疫荧光染色的多标技术应用免疫荧光染色的多标技术广泛应用于生物医学研究中，如疾病诊断、蛋白质定位和分析、细胞信号通路研究等。
通过同时检测多个目标分子，可以提供更全面的信息，有助于深入了解生物过程的机制。
双标记免疫荧光染色
双标记免疫荧光染色一、实验目的：1.检测MT, IGF-1/FGF5与两个目的基因所表达的蛋白的共表达。
2.检测目的基因所表达的蛋白定位。
3.检测褪黑激素或细胞因子对目的基因高表达的影响以及表达规律。
二、实验材料：1.试剂：多聚甲醛，目的基因一抗，自带荧光的二抗（地高辛－地高辛抗体，生物素－链霉亲和素）细胞核染料DAPI2. 器材：激光共聚焦显微镜显微镜专用玻片，共聚焦专用培养皿。
三、实验步骤：1.细胞培养：取对数期细胞于6孔板培养24小时，放入共聚焦专用玻片，贴壁细胞爬片需要24小时，细胞数目达到4×104个细胞，设置两个以上六孔板分别为对照组和实验组；2.实验组加药处理：加入MT或IGF-1或FGF5处理24小时或48小时，72小时。
3.上镜前处理：将玻片取出，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定15min；PBS洗多次，加0.1%Triton-X100透化10min；PBS洗3次，5%FBS室温封闭一到数小时；PBS洗3次，将MT、FGF-5、IGF-1抗体(1：200)和目的基因(工作液)两两组合，共六组，按体积比1：1混匀，一起加到切片上，4℃过夜；第二天，PBS洗3次，加入荧光二抗[加入TRITC(罗丹明)标记羊抗兔IgG(1：100)；37℃孵育30 min；加人FITC标记山羊抗鼠IgG(1：100)]，室温避光45min；（之后均为避光操作）PBS洗3次，加入核染料，n分钟；PBS洗3次，灭菌水洗2次；取处理好的载玻片，写好组别，在正中央滴约30ul防猝灭剂，小心将盖玻片夹起，缓慢放下，不要产生气泡，避光晾干。
以PBs代替一抗作为阴性对照，省略一抗作空白对照。
4.镜检四、结果预测：1.共表达：两个基因分别为阳性红色，绿色。
共表达出现红绿重叠而呈现黄色荧光，显示蛋白定位。
2.正负表达：看荧光强弱。
免疫荧光染色方法介绍
细胞免疫荧光-多重染色1. 原理介绍我们现在来考虑一下多重染色。
使用多个标签进行免疫染色的目的，是在同一细胞或组织切片里，同时对两个或多个抗原进行染色定位。
各个抗原分别使用不同的标签，以便区分。
抗原可以是共定位的，即它们的亚细胞定位一致，或者是分开的。
荧光的作用原理。
荧光分子能吸收特定波长的光，然后发射更长波长的光。
在发出荧光之前，荧光分子跟环境相互作用失去能量，从而达到这一目的，这一现象叫内转换。
电子可以是基态或静止态 S0，也可以是较高能量的激发态 S1 和 S2。
在每一个电子态，荧光染料存在的振动能级可以有多种，包括 0 级、1 级和 2 级。
室温下，能量不足以使电子激发到激发态 S1 和 S2 或基态的较高振动能级。
所以，只有当光存在时，吸收才发生在振动能态最低的分子上。
荧光染料在吸收光后，通常被激发至一个较高的振动能级 S1 或 S2，然后再回到S1的最低振动能级，从而完成内转换过程。
此过程与光子发射过程结合形成荧光。
荧光染料可多次重复这一激发发射循环，直至荧光消失，也就是光漂白。
相较而言，有些荧光素更容易发生光漂白。
例如，FITC 重复激发发射循环约 30000 次后发生光漂白。
而第二代荧光染料，如 Alexa Fluor® 系列的光漂白没有这么快，由于它们有较高的消光系数，比较明亮，更适合用于多标记实验，如本幻灯片图像所示常用到的一种传统染料的组合是：DAPI 蓝色染料、FITC 绿色染料、TRITC 黄色染料和 Cy5® 红色染料。
而相应的第二代染料组合是：DAPI 蓝色染料、Alexa Fluor® 488 绿色染料、Alexa Fluor® 555 黄色染料和 Alexa Fluor® 647 红色染料设计荧光多重标记实验时，可以采取以下几个步骤，以最大限度的减小或消除串色现象。
首先，分析待选荧光素的吸收光谱和发射光谱，结合显微镜滤光片组的特点，评估是否兼容。
免疫荧光双标原理
免疫荧光双标原理免疫荧光双标原理是一种生物分子标记技术，主要用于分析和检测细胞和组织中的蛋白质等分子。
该技术结合了免疫学和生物荧光学的原理，基于细胞或组织中特定分子与特异性抗体结合的反应，将其标记荧光染料，从而实现对细胞或组织中分子的探测和定位。
免疫荧光双标原理的基本步骤包括抗体标记、标本制备、光学检测和数据分析等几个方面，下面将逐一介绍。
1. 抗体标记抗体标记是免疫荧光双标技术中最关键的一个环节。
通常采用的方法是将荧光染料与抗体分子关联，制成荧光标记的免疫调控试剂盒。
这些试剂通常被称为“荧光标记抗体”，标记染料有多种不同的荧光颜色，以适应不同的检测需求。
标记抗体的荧光染料通常是有机染料或金属螯合剂，如罗丹明（Rodamine）、荧光素（Fluorescein）和荧光钴（Fluorescent Co）等。
2. 标本制备标本制备是免疫荧光双标技术中的一个关键步骤，它决定了标本质量的好坏。
通常先将标本切片或离心，然后用甲醛或其他交联剂固定细胞和组织样品，使其保持原来的形态，并同时固定荧光抗体标记。
之后，需要将细胞膜孔洞或核孔进行透射和渗透，以使标记分子能够穿过细胞膜，进入细胞内部或核内。
这样，形成的免疫荧光双标标本就可以被用于后续的检测和分析。
3. 光学检测光学检测是免疫荧光双标技术中的另一关键步骤。
它利用激光束或正常的光源激发标记染料产生荧光，从而实现对标本分子的检测和分析。
光学检测通常基于荧光显微镜、光谱仪或光电显微镜等设备，这些设备可以直接观察和记录样品中的荧光信号，获取图像信息和/或光谱数据。
4. 数据分析数据分析是免疫荧光双标技术中的最后一个步骤。
它涉及对荧光信号数据的处理和解释，以提取有用的生物学信息。
数据分析通常基于计算机软件，可以将荧光信号转化为图像、数字和/或图形表示，以实现对标本中分子数量、定位和相关性的计算和分析。
总之，免疫荧光双标技术是一种高灵敏度、高精度、高通量的生物分子探测和定位技术，已广泛应用于细胞和分子生物学研究、临床诊断和药物研发等领域。
免疫荧光单标记和双标记的方法
免疫荧光单标记和双标记的方法免疫荧光单标记和双标记的方法l免疫荧光单标记方法免疫荧光单标记是指只标记一种蛋白质分子，方法比较简单，只要按照染色步骤去做，通常不存在太多的问题。
但要注意固定液的选择，固定液选择的合适与否，可能会直接影响染色结果。
具体染色方法如下。
1)所需材料与试剂(1)培养在盖玻片或玻璃培养皿中融合程度达到60％一70％的细胞。
(2)一抗、FITC或TRITC标记的二抗。
(3)4％多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液(一20℃预冷20min)。
(4)封闭液。
(5)0．01mol／LPBS缓冲液。
2)染色方法(1)取出培养有细胞的盖玻片或glass—bottom培养皿，用0．01MPBS洗2—3遍。
(2)加入0．3％的TritonX—100，37℃，30rain。
(3)加入4％多聚甲醛室温固定30min或冷丙酮4℃固定10min。
(4)正常阻断血清1：20封闭室温20～30min，抑制IgG的非特异性结合。
阻断血清必须选择与二抗同一种属的正常血清。
(5)去掉正常血清，直接加入一抗，37C孵育1h或4℃过夜。
抗体以0．01mol／LPBS稀释(理想的抗体浓度需经试验而定)。
(6)0．3％TritonX—100洗5min，0．01mol／IPBS洗5min，0．3％TritonX 5min，0．01MPBS洗5rain。
(7)加入FITC—二抗或TRITC—二抗，37℃，孵育1h。
(8)0．3％TritonX—100洗5rain，0．01mol／LPBS洗5min，0．3％TritonX 5min，0．01mol／LPBS洗5mln，用滤纸吸干。
(9)90％甘油(PBS配制)封片。
(10)激光扫描共焦显微镜下观察，或于4℃避光保存。
2．免疫荧光双标记方法免疫荧光的双标记是指同时标记细胞内两种蛋白质分子，当怀疑某种配体与已知受体结合后可用此方法加以证明。
此方法稍微复杂一些，首先应注意所用的一抗必须是来自不同种属动物的两种特异性抗体(例如：A抗体为多克隆抗体，来自家兔；B抗体为单克隆抗体，来自小鼠)。
三重免疫荧光染色原理
三重免疫荧光染色原理
三重免疫荧光染色是一种用于检测细胞或组织中多种蛋白质表达的方法。
其原理是利用多种荧光标记的抗体同时与待检测的蛋白质结合，通过荧光显微镜观察不同荧光标记的抗体在细胞或组织中的分布情况，从而实现对多种蛋白质的定位和表达水平的检测。
在进行三重免疫荧光染色时，首先需要选择适当的一抗（primary antibody），这是针对待检测蛋白的特异性抗体，它将与待检测蛋白结合。
然后使用不同荧光标记的二抗（secondary antibody）结合到一抗上，这些二抗将分别与不同颜色的荧光染料结合。
最后，通过荧光显微镜观察样品，可以根据不同颜色的荧光信号来确定不同蛋白质的位置和表达水平。
三重免疫荧光染色的原理基于多种抗体和荧光标记的选择，以及对不同荧光信号的识别和分析。
通过合理设计实验方案和选择合适的抗体和荧光标记，可以同时检测多种蛋白质在细胞或组织中的表达情况，为细胞生物学和病理学研究提供重要的信息。
总的来说，三重免疫荧光染色原理是利用多种荧光标记的抗体同时与不同蛋白质结合，通过荧光显微镜观察不同荧光信号的位置
和强度，从而实现对多种蛋白质的定位和表达水平的检测。
这种方法在细胞生物学和病理学研究中具有重要的应用意义。
多重免疫荧光染色步骤
多重免疫荧光染色步骤引言：多重免疫荧光染色是一种常用的实验技术，可以同时检测多个目标分子在细胞或组织中的分布和表达情况。
本文将详细介绍多重免疫荧光染色的步骤和操作要点。
一、样品处理1. 固定样品：将细胞或组织样品固定在载玻片上，以保持其形态和结构的完整性。
常用的固定剂包括甲醛、乙酸乙酯和乙醇等。
2. 渗透化处理：使用适当的渗透化剂，如Triton X-100或Tween-20，使抗体能够渗透到细胞或组织中。
二、抗体染色1. 阻断非特异性结合：在样品中加入非特异性抗体，如牛血清白蛋白（BSA）或羊血清蛋白（GFP），以阻断非特异性结合位点。
2. 加入第一抗体：将第一抗体加入样品中，与目标分子结合。
第一抗体可选择单克隆抗体或多克隆抗体。
3. 温育：将样品在适当的温度下孵育一段时间，以促进抗体与目标分子的结合。
4. 洗涤：用缓冲液洗涤样品，去除未结合的抗体。
5. 加入第二抗体：将与第一抗体来源不同的二抗加入样品中，与第一抗体结合。
第二抗体通常是标记有荧光染料的抗动物IgG。
6. 温育：将样品在适当的温度下孵育一段时间，以促进二抗与第一抗体的结合。
7. 洗涤：用缓冲液洗涤样品，去除未结合的二抗。
三、显微镜观察和图像分析1. 准备显微镜：调整显微镜的倍数和对焦，确保观察的图像清晰。
2. 拍摄图像：使用数码相机或显微镜系统，拍摄染色后的样品图像。
3. 图像分析：使用图像处理软件对图像进行分析，包括定量分析和定位分析。
可以通过计算荧光强度和位置来获取目标分子的表达水平和分布情况。
四、注意事项1. 抗体选择：选择适当的抗体对目标分子进行检测，确保其特异性和敏感性。
2. 温育条件：温育时间和温度需根据抗体和样品类型进行优化，以提高染色效果。
3. 洗涤条件：洗涤时需充分去除未结合的抗体和试剂，以减少背景信号。
4. 控制实验：进行相应的阴性对照实验，用于验证染色结果的特异性。
5. 图像分析方法：选择合适的图像处理软件和分析方法，确保准确、可靠地分析染色结果。
多标记免疫荧光染色
多标记免疫荧光染色+多光谱采集技术的优势
多重免疫组化技术优点多多：
1，有助于转化医学的研究；
2，最大限度的从样本中获取至关重要的信息，尤其是组织样本很少时；
3，相比于其它方法，能更好的分析组织样本中多重靶标的共表达及空间信息；
4，信号显著增强，从而可以检测低表达的靶标；
5，无需考虑一抗种属及isotype，实验灵活设计。
话不多说，直接给大家展示一张可以呈现7个靶标染色的mIF结果图：Opal是一套基于酪酰胺信号放大技术(TSA，TyramideSignal Amplification)的多标记免疫组化染色方案，为组织样品特别是FFPE(福尔马林固定石蜡包埋)样品进行染色，并且允许同一样本中使用同一种属来源的不同一抗进行多标记复合染色。
并且，配合多光谱成像分析系统，可以获得高信噪比(扣除背景自发荧光)的图像，甚至是多达7种标记的同步染色和共定位及定量分析。
免疫荧光双标染色法意义
免疫荧光双标染色法意义在生物医学研究领域，免疫荧光双标染色法是一项重要的实验技术。
该方法通过同时检测两种不同的标记物，帮助科研人员更深入地了解细胞或组织中的复杂生物过程。
本文将详细介绍免疫荧光双标染色法的意义及其在科研中的应用。
一、免疫荧光双标染色法简介免疫荧光双标染色法是一种基于荧光标记的免疫组化技术。
它通过特异性抗原与抗体结合，利用荧光染料标记的抗体来显示细胞或组织中的特定分子。
与传统的免疫组化染色方法相比，免疫荧光双标染色法具有更高的灵敏度和更广的适用范围。
二、免疫荧光双标染色法的意义1.同时检测两种不同的标记物免疫荧光双标染色法最大的优势在于可以同时检测两种不同的标记物。
这在研究细胞或组织中的复杂生物过程时具有重要意义。
例如，在研究肿瘤细胞与免疫细胞相互作用的过程中，可以同时检测肿瘤标志物和免疫细胞标志物，从而更深入地了解两者之间的关系。
2.精确定位细胞内分子免疫荧光双标染色法具有较高的空间分辨率，可以精确定位细胞内分子。
这有助于揭示细胞内分子之间的相互作用和信号传递路径，为疾病发病机制的研究提供有力支持。
3.提高实验效率免疫荧光双标染色法可以在同一实验中同时完成两种标记物的检测，大大提高了实验效率。
此外，该方法操作简便，实验周期较短，有利于科研人员快速获得实验结果。
4.适用于多种样本类型免疫荧光双标染色法适用于多种样本类型，如细胞爬片、组织切片、细胞悬液等。
这为科研人员提供了广泛的实验选择，有助于研究不同类型的生物样本。
5.可视化细胞动态过程通过免疫荧光双标染色法，可以实时观察细胞内分子的动态变化，如细胞迁移、细胞凋亡等。
这有助于揭示细胞在生理和病理过程中的重要作用。
三、免疫荧光双标染色法在科研中的应用免疫荧光双标染色法在生物医学研究中具有广泛的应用，如：1.肿瘤研究：通过检测肿瘤标志物和免疫细胞标志物，研究肿瘤微环境中的相互作用。
2.神经科学研究：揭示神经元之间的联系和信号传递机制。
免疫荧光双染完整版
免疫荧光双染集团标准化办公室：[VV986T-J682P28-JP266L8-68PNN]免疫荧光双染在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。
双重免疫荧光标记法(doubleimmunofluorescencelabelingmethod)也分为直接法和间接法。
冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤1、冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS?1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。
将玻片置于PBS （PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
4、加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1(TdT)和试剂2(dUTP)按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。
5、BSA封闭:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。
6、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。
（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。
8、DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。
去除PBS后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。
多重免疫荧光染色技术
多重免疫荧光染色技术多重免疫荧光染色技术是一种非常有用的实验方法，可以同时检测多个靶标分子的表达情况，从而深入了解细胞功能和疾病发生机制。
这种技术的应用范围非常广泛，包括生物医学研究、临床诊断以及新药开发等领域。
多重免疫荧光染色技术的原理很简单，利用不同荧光染料的发光特性，将不同的抗体与相应的荧光标记结合，然后将这些染色抗体同时添加到待测样本中。
这些抗体会与其特定的靶标分子发生特异性结合，形成荧光标记的复合物。
随后，通过荧光显微镜观察样本中的荧光信号，就可以得到多个荧光信号的叠加图像。
通过对不同荧光信号的强度和位置分析，可以准确地判断靶标分子的表达情况和定位信息。
多重免疫荧光染色技术有许多重要的应用。
在细胞生物学研究中，科学家们可以同时检测细胞中多个蛋白质的表达情况，以便更好地理解细胞内各种分子之间的关系和相互作用。
此外，通过对细胞表面的免疫分子进行染色，可以帮助研究人员识别和分类不同类型的细胞。
这对于研究免疫系统、肿瘤学以及器官发育等方面的科学家来说尤为重要。
在临床诊断中，多重免疫荧光染色技术也发挥着重要作用。
医生们可以使用该技术对患者的生物标本进行分析，以确定是否存在特定的疾病标记物。
例如，通过同时检测多个免疫细胞表面标志物，可以提供关于免疫系统功能状况的重要信息，有助于疾病的诊断和治疗。
此外，多重免疫荧光染色技术还在新药开发中发挥着关键的作用。
药物的研发中经常需要检测药物对分子靶点的影响，以评估药物的疗效和安全性。
多重免疫荧光染色技术可以提供对多个靶标分子的检测和定量，有助于研究人员对药物的作用机制进行全面分析。
在实施多重免疫荧光染色技术时，有一些关键的步骤需要特别注意。
首先，合理选择荧光标记和抗体的组合，确保它们能够同时工作并清晰地识别目标分子。
其次，正确的固定和处理样本，以保持细胞或组织的完整性和形态结构。
最后，合理设置荧光显微镜系统的参数，以获得高质量的图像和准确的分析结果。
总之，多重免疫荧光染色技术在生物医学研究、临床诊断和新药开发等领域具有广泛的应用前景。
免疫荧光染色(多标)步骤
免疫荧光染色(多标)步骤免疫荧光染色(多标)是一种常用的实验技术，用于检测和定位细胞或组织中的特定抗原。
该技术利用抗体的高度特异性与宿主细胞或组织中的抗原相结合，并通过荧光标记的二抗进行可视化。
本文将详细介绍免疫荧光染色(多标)的步骤。
一、制备标本需要从细胞培养物或动物组织中制备标本。
对于细胞培养物，可以使用离心将细胞沉淀，然后用PBS洗涤细胞沉淀。
对于动物组织，需要将组织切片并固定。
二、抗原解剖将标本进行抗原解剖，即使得细胞或组织中的抗原能够与抗体结合。
抗原解剖的方法包括共价交联、乙醛固定和冷冻解剖等。
三、非特异性结合抑制为了减少非特异性结合，需要对标本进行非特异性结合抑制。
可以使用一些蛋白质，如牛血清白蛋白(BSA)或胎牛血清(TBS)，将标本进行封闭。
四、第一次抗体孵育将具有特异性的原抗体（第一抗体）加入到标本中，使其与抗原结合。
第一抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
五、洗涤将标本进行洗涤，去除没有结合的第一抗体。
洗涤液可以使用PBS 或TBS缓冲液。
洗涤的次数取决于实验的要求，一般需要洗涤3-5次。
六、第二次抗体孵育加入与第一抗体来源不同物种的荧光标记的二抗（第二抗体），使其与第一抗体结合。
第二抗体可以选择不同的荧光染料，如荧光素或罗丹明。
七、洗涤将标本进行再次洗涤，去除没有结合的二抗。
同样使用PBS或TBS 缓冲液进行洗涤。
八、核染色为了观察细胞核的位置，可以使用荧光标记的DNA染料，如4',6-二硫化羟喜树碱(DAPI)进行核染色。
九、封片将标本封装在载玻片上，使用适当的封片剂固定标本。
同时，可以加入抗褪色剂以保持荧光的稳定性。
十、观察与分析使用荧光显微镜观察标本，并进行图像采集和分析。
可以使用图像处理软件对采集到的图像进行进一步的定量分析。
免疫荧光染色(多标)是一种重要的实验技术，在生物医学研究中有着广泛的应用。
通过该技术，可以对细胞或组织中的特定抗原进行定位和表达分析，为研究细胞功能和疾病机制提供关键信息。
多标记免疫荧光染色及多光谱成像技术在组织学研究中的应用
多标记免疫荧光染色及多光谱成像技术在组织学研究中的应用钱帮国;焦磊【摘要】免疫组织化学染色及成像分析是研究组织形态和组织原位抗原表达不可或缺的检测技术,广泛应用于临床病理诊断和医学及生物学研究的各个领域.组织切片样本中蕴含着丰富的信息,但是受制于传统单标记免疫组织化学染色方法的限制,通常只能对组织中的一到两种抗原进行染色分析,而且定量结果的判读往往依赖于肉眼观测,缺乏客观标准.随着蛋白组学的发展,对现代组织学分析提出了更高的要求,例如不同的蛋白共表达和共定位分析、低丰度分子的检测、异质性分析、细胞表型统计乃至复杂组织微环境的描绘等,都需要在同一张组织切片样本上同时检测多种靶标分子.这对于理解组织微环境中各种细胞间的关系,推演信号通路上下游蛋白表达的关系,制定临床诊断和治疗方案都有着非常重要的意义.本文介绍一种基于酪胺信号放大(TSA)技术衍生而来的多标记免疫荧光染色方法,能够在同一组织切片样本上复染7种以上抗原并进行区别标记,配合光谱成像技术和定量分析软件,能够将组织中蕴含的丰富信息准确的呈现出来.这套流程化的分析方案为临床诊断和基础科研提供了更高精度和更可靠的组织学数据,将免疫组织化学分析的技术水平提升到一个新的高度.%Immunohistochemical staining and imaging analysis technology is indispensable for the study of tissue morphology and in situ antigen expression.It is widely used in various fields of clinical pathology diagnosis and biological research.The tissue slice sample contains a lot of information,but due to the restriction of traditional single-labeled immunohistochemical staining method,only one or two target antigens can be detected at same time.The quantitative interpretation of the results is often dependent on naked eye observation and lacks objectivecriteria.With the development of proteomics,there are increasing demands on more sophisticated modem histological analysis,such as different protein co-expression and co-localization analysis,low abundance molecular detection,heterogeneity analysis,cell phenotype statistics,and complex tissue microenvironment description.These features are essential in detecting a variety of target molecules in the same tissue slice simultaneously so that researchers can understand the relationship among various cells in tissue microenvironment,predict the relationship between upstream and downstream protein expression,and develop clinical diagnosis and treatment regimen.This review presents a multi-labeled immunofluorescence staining method based on tyramine signal amplification (TSA) technology.It allows more than seven different markers on the same tissue slice using different colored dyes combined with spectral imaging and quantitative analysis software,therefore the abundant in situ tissue information can be accurately presented.This set of process-oriented analysis can provide more accurate and reliable histological data for clinical diagnosis and scientific research,and bring the immunohistochemical analysis to a higher level.【期刊名称】《中国组织化学与细胞化学杂志》【年(卷),期】2017(026)004【总页数】10页(P373-382)【关键词】多色标记免疫组织化学;多光谱成像;酪胺信号放大;定量病理学【作者】钱帮国;焦磊【作者单位】珀金埃尔默企业管理(上海)有限公司,上海201203;珀金埃尔默企业管理(上海)有限公司,上海201203【正文语种】中文【中图分类】R329-3随着新型测序、基因和蛋白芯片以及流式分析技术的发展，已经可以从正常或疾病组织中获取越来越多的基因或细胞表型信息。
免疫荧光双标操作方法及注意事项
在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。
双重免疫荧光标记法（double immunofluorescence labeling method）也分为直接法和间接法。
(1）直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素的抗体(如抗A 和抗B)以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，即可对两种抗原进行定位和定量。
直接法简便可靠，但灵敏度较低。
(2)间接法双重免疫荧光标记：用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察,从而对两种抗原进行定位和定量。
使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属，且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。
免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下:1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同.2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。
3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。
4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0。
01M PBS （1：1)。
条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。
5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。
6、荧光抗体染色假阳性可能会多,需要分别设定阳性和阴性对照。
二、注意事项1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长,可能会使荧光提前衰退。
2、每次试验均需设置以下三种对照:(1) 阳性对照：阳性血清+荧光标记物;(2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物;(3）荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。
三、免疫荧光双标的经验之谈1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit—FITC（绿)和donkey anti—rat—Tex-Red(红)。
多重免疫荧光染色技术检测意义
多重免疫荧光染色技术检测意义多重免疫荧光染色技术，顾名思义是将多种抗体与荧光染料结合，用于同时检测多种特定分子的表达情况。
这项技术在生物医学研究和临床诊断中具有非常重要的意义。
首先，多重免疫荧光染色技术可以用于确定细胞中多种分子的定位和相互作用。
通过使用不同标记的抗体，我们可以同时检测多种感兴趣的分子在细胞内的位置和相互关系。
例如，研究人员可以使用特定的抗体来检测细胞核内特定蛋白质的表达情况，并使用另一种抗体来检测其在细胞质中的分布情况。
这有助于我们理解细胞内分子定位与功能之间的关系，进一步揭示细胞的作用机制。
其次，多重免疫荧光染色技术可用于检测细胞中复杂的信号转导网络。
在细胞中，多种信号分子通过复杂的信号转导途径相互作用，调控细胞的生理功能。
通过同时检测多种信号分子的表达情况，我们可以了解它们在信号转导网络中的位置和相互作用关系。
这有助于我们揭示信号转导通路的复杂性，寻找新的药物靶点，并为药物研发提供重要参考。
再次，多重免疫荧光染色技术在肿瘤诊断和治疗中具有重要意义。
通过检测肿瘤组织中多种标志性分子的表达情况，我们可以确定肿瘤的类型、恶性程度和预后。
同时，该技术也可以用于检测肿瘤组织中的特定蛋白质或细胞表面标记物的表达情况，为精确治疗提供依据。
通过多重免疫荧光染色技术，我们可以更好地了解肿瘤的生物学特征，帮助医生制定个体化的治疗策略。
此外，多重免疫荧光染色技术还在药物研发、疾病机制研究和免疫学等领域得到广泛应用。
通过同时检测多种分子标志物的表达情况，我们可以更准确地判断药物疗效和副作用，加快药物研发进程。
在疾病机制研究中，该技术可以揭示疾病的发生和发展机制，为疾病诊断和治疗提供新的线索。
而在免疫学领域，多重免疫荧光染色技术可以帮助鉴定和定量不同类型的免疫细胞，并研究其功能和相互作用。
总之，多重免疫荧光染色技术在生物医学研究和临床诊断中发挥着重要作用。
它可以同时检测多种分子的表达情况，实现对细胞功能和疾病机制的深入研究。
细胞爬片 多重免疫荧光染色
细胞爬片多重免疫荧光染色
细胞爬片多重免疫荧光染色是一种常用的细胞学实验技术，用于研究细胞内蛋白质的定位、表达水平和相互作用等。
在这种技术中，细胞首先被固定在载玻片上，然后通过特定的抗体和荧光染料来标记感兴趣的蛋白质。
这种方法可以同时检测多种蛋白质的表达情况，并观察它们在细胞内的分布和相互作用关系。
在进行细胞爬片多重免疫荧光染色实验时，首先需要选择合适的细胞系或组织样本，并将其均匀地涂在载玻片上。
接下来，使用适当的方法对细胞进行固定，通常使用乙醇或甲醛等化学试剂进行固定。
然后，通过孔径较小的抗体，对感兴趣的蛋白质进行特异性的标记，常用的标记颜色包括荧光染料的绿色、红色和蓝色等。
在染色完成后，可以通过荧光显微镜观察细胞内不同蛋白质的分布情况，通过不同波长的荧光信号来识别和定量感兴趣的蛋白质。
细胞爬片多重免疫荧光染色技术具有高灵敏度和高分辨率的优点，能够在单个细胞水平上对多种蛋白质进行定量和定位分析。
这种技术在细胞生物学、免疫学和病理学等领域具有广泛的应用，可以帮助研究人员深入了解细胞内蛋白质的功能和相互作用机制，对于疾病诊断和药物研发具有重要意义。
总的来说，细胞爬片多重免疫荧光染色技术是一种强大的细胞学研究工具，可以帮助科研人员全面了解细胞内蛋白质的表达和分布情况，为细胞功能和疾病机制研究提供重要的信息。
细胞爬片多重免疫荧光染色
细胞爬片多重免疫荧光染色
细胞爬片多重免疫荧光染色是一种常用的技术，用于研究细胞的形态和分子表达。
这种染色方法结合了多种抗体标记的技术，可以同时观察多个分子在细胞中的分布和相互作用。
在细胞爬片多重免疫荧光染色中，首先需要将细胞固定在载玻片上，并穿透性固定细胞膜，使得抗体可以进入细胞内部。
接下来，使用特异性的抗体来识别和结合目标分子，这些抗体会被标记上荧光染料。
不同的抗体可以使用不同颜色的荧光染料进行标记，从而使得在显微镜下观察时可以区分不同的分子。
通过细胞爬片多重免疫荧光染色，研究人员可以同时观察多个分子在细胞中的定位和相互作用。
例如，可以观察细胞核中染色体的分布和蛋白质的定位，或者观察细胞膜上不同受体的分布和相互作用。
这种技术可以帮助科学家更好地理解细胞的功能和调控机制。
细胞爬片多重免疫荧光染色的优势在于可以同时观察多个分子，并且可以使用不同颜色的荧光染料进行标记，从而使得观察结果更加清晰和准确。
此外，这种技术还可以应用于临床诊断，例如观察肿瘤细胞中关键蛋白的表达和定位，从而帮助医生制定更精准的治疗方案。
细胞爬片多重免疫荧光染色是一种重要的技术手段，可以帮助科学家更好地理解细胞的结构和功能。
通过这种方法，研究人员可以同
时观察多个分子在细胞中的定位和相互作用，从而揭示细胞内部复杂的生物过程和调控机制。
这种技术在生命科学研究和临床诊断中具有广泛的应用前景。
免疫荧光 双标
免疫荧光步骤（双标）1.冰冻切片制备将脱水后的脊髓标本放于冰冻托盘上，加OCT使组织被完全包埋，置于冰冻切片机中，调节箱体温度为-22℃，冷冻头温度为-23℃。
观察OCT冻成白色固态状时，将其放置于冷冻头，准备切片。
设置切片厚度为8µm，必要时用刷子辅助将切好的OCT薄片贴附于载玻片上。
室温下晾干载玻片后保存于-20℃冰箱。
2.免疫荧光染色（1）室温下晾干切片15min，待完全晾干后放置于湿盒内，PBS冲洗浸泡5min/次，3次（以除去OGT）。
（2）抗原修复液(1X)（双蒸水稀释），95-100℃加热约20分钟(加热时间可以控制在10-30分钟内)。
20-30分钟内冷却至室温。
PBS冲洗5min/次，3次。
（3）用滤纸吸干玻片上残余PBS，用免疫组化笔在标本周围画一适当大小圆圈，避免接触标本，将配置好的封闭液（5%驴血清=920ulPBS+50ul驴血清+30ul 10%trition）加入圆圈内，室温下封闭1h。
（4）用滤纸吸去封闭液，向标本加入相应一抗：（1%BSA）兔源一标：兔抗IL-33（1：50）小鼠源二标：小鼠抗NeuN（1：500，神经元）小鼠抗GFAP（1：300，星形胶质细胞）小鼠抗OX42（1：100，小胶质细胞）小鼠抗OLIG2（1: 25，少突胶质细胞）一抗于4℃静置过夜孵育。
（5）次日，PBS洗去一抗，10min/次，3次，用滤纸吸干PBS，之后操作均需避光，向标本加入相应二抗：Dylight 488标记驴抗兔IgG（1：300），Dylight 594标记驴抗小鼠IgG（1：300），二抗室温静置避光孵育2h。
（6）PBS清洗二抗，10min/次，3次，清洗后晾干后滴加DAPI封片，加盖玻片后于荧光显微镜下拍摄图片并保存。
计划：1.IL-33组：1）IL-33/NeuN X2个配比浓度2）IL-33/GFAP X23）IL-33/Iba-1 X24）只孵二抗X22.Sham组：1）IL-33/NeuN X12）IL-33/GFAP X13）IL-33/Iba-1 X14）只孵二抗需要购买：Triton-100，驴血清，一抗：小鼠抗RBFOX3/ NeuN、小鼠抗GFAP、小鼠抗OX42，二抗：Dylight 488标记驴抗兔IgG，BSA(牛血清白蛋白)注意：1、细胞固定和通透为达到最佳的检测效果，细胞需要经过固定和通透。
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多标记免疫荧光染色+多光谱采集技术的优势
多重免疫组化技术优点多多：
1，有助于转化医学的研究；
2，最大限度的从样本中获取至关重要的信息，尤其是组织样本很少时；
3，相比于其它方法，能更好的分析组织样本中多重靶标的共表达及空间信息；
4，信号显著增强，从而可以检测低表达的靶标；
5，无需考虑一抗种属及isotype，实验灵活设计。
话不多说，直接给大家展示一张可以呈现7个靶标染色的mIF结果图：Opal是一套基于酪酰胺信号放大技术(TSA，TyramideSignal Amplification)的多标记免疫组化染色方案，为组织样品特别是FFPE(福尔马林固定石蜡包埋)样品进行染色，并且允许同一样本中使用同一种属来源的不同一抗进行多标记复合染色。
并且，配合多光谱成像分析系统，可以获得高信噪比(扣除背景自发荧光)的图像，甚至是多达7种标记的同步染色和共定位及定量分析。