微生物限度检查

、微生物限度检查1、供试液的制备：（1）固体供试品固体供试品包括片剂、丸剂、胶囊剂。

称取供试品10g放入灭菌好的匀浆杯中，加稀释剂100ml，启动匀浆仪,以每分钟3000转，旋转3分钟，使供试液均匀，制成1：10供试液。

（2）液体供试品取供试品10ml放入已灭菌锥形瓶中，加入90ml稀释剂，使均匀，制成1：10供试液。

（3）非水溶性供试液制备称供试品5g，加入装有已灭菌融化的温度约45℃的司盘-80 5g，单硬脂酸甘油3g和聚山梨酸10g混合物锥形瓶中,摇匀，加0.9%灭菌氯化钠溶液80ml使供试品充分乳化，制成1：20供试液。

2、细菌霉菌（酵母菌）计数：以固体供试液为例，供试液以10倍递增稀释，将匀浆杯中内容物摇匀，取2-3支灭菌中试管，分别加入9ml 灭菌稀释剂。

另取一支1ml灭菌吸管，吸取供试液1ml，加入第一支试管中，混匀，制成1：100的供试液，以此类推，作10倍递增稀释。

根据供试品污染的程度可稀释至10-3或10-4，一般取连续三级稀释液检验。

取吸管分别吸取1ml 10-1供试液加入4平皿中。

再取另一支吸管分别取第二级稀释液1ml加入4个平皿中，第三级稀释液同样操作。

将45℃左右的营养琼脂培养基按每一级稀释液倒入2个平皿，每个平皿15-20ml，立即摇匀。

再取玫瑰红钠琼脂培养基按每一级稀释液倒入2个平皿，同样操作。

细菌数和灭菌数的阴性对照试验：分别吸取稀释剂各1ml加入到4个平皿中，再分别加入营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基各制成2个平板。

检查细菌的平板倒置于30-35℃培养箱中，培养2天。

检查霉菌的平板倒置于25-28℃培养箱中，培养3天。

逐日观察并记录结果。

阴性对照的平板培养后均不得长菌。

3、大肠杆菌检查：取胆盐乳糖培养基3份，每份100ml，两份分别加入规定量的供试液，其中一份加对照菌50-100个作阳性对照。

第三份加入与供试液等量的稀释液作阴性对照，培养18-24小时。

阴性对照应无菌生长。

取上述三份培养物各0.2ml，分别接种至5mlMUG培养基管内培养，分别于5小时与24小时时取未接种的MUG培养基管作本底对照。

将各管置366nm紫外灯下5cm处观察有无蓝白荧光，然后，加靛基质试液4-5滴于上述MUG培养基管内，适当震摇后，观察液面颜色。

如供试液、MUG阳性有荧光，靛基质阳性呈红色，报告1g或1ml供试品检出大肠杆菌；MUG阴性无荧光，靛基质阴性为无色，报告1g或1ml供试品未检出大肠杆菌；如MUG阳性靛基质阴性或MUG阴性靛基质阳性时，将上述胆盐乳糖增菌液摇匀，取培养液划线于EMB或MCC琼脂平板。

培养观察结果：平板上无可疑菌生长，当阳性对照平板呈典型菌落生长时，可报告供试品未检出大肠I细菌。

平板上有可疑菌落生长，应取2-3个可疑菌落，接种营养琼脂斜面培养。

作革兰染色、镜检和IMVIC试验。

IMVIC试验取可疑菌落培养物接种于蛋白胨水培养基管1支，磷酸盐葡萄糖胨水培养基管2支，枸橼酸盐培养基的斜面1支，培养规定时间。

沿蛋白胨水培养基管壁加靛基质试液4-5滴，液面呈玫瑰红色为靛基质试验阳性，呈试剂本色为阴性。

在1支磷酸盐葡萄糖胨水培养基管内加入甲基红指示液数滴，立即观察，呈鲜红色或桔红色为甲基红实验阳性，呈黄色为阴性。

在另1支磷酸盐葡萄糖胨水培养基管内加入a-萘酚试液1ml，混匀，再加入40%氢氧化钾溶液0.4ml，充分震摇。

在4小时管内出现红色为乙酰甲基甲醇生成实验阳性，无红色反应为阴性。

枸橼酸盐培养基的斜面上，培养48-72小时，有菌落生长，培养基由绿色变为兰色时为枸橼酸盐利用实验阳性，培养基颜色无改变为阴性。

大肠杆菌、IMVIC试验大部分为阳性、阳性、阴性、阴性，少部分为阴性、阳性、阴性、阴性。

产气杆菌IMVIC实验为阴性、阴性、阳性、阳性。

结果判断：如上述MUG阳性、靛基质阳性，报告供试品检出大肠杆菌；MUG阴性、靛基质阴性，报告供试品未检出大肠杆菌。

如MUG阳性、靛基质阴性、EMB琼脂平板有菌生长、IMVIC实验为阴性、阳性、阴性、阴性，判检出大肠杆菌。

如MUG阴性、靛基质阳性、EMB琼脂平板有菌生长、IMVIC实验为阳性、阳性、阴性、阴性，判检出大肠杆菌。

否则，判未检出大肠杆菌。

4、沙门菌检查：取四硫磺酸盐培养基18-24小时增菌培养物划线于胆盐硫乳琼脂平板或MCC琼脂平板，培养18-24小时，当阳性对照的平板呈现阳性菌落时，供试品的平板无菌落生长或有菌落但不同于典型菌落形态特征时，可判为未检出沙门菌。

如供试品的胆盐硫乳琼脂平板上典型菌落形态为无色至浅橙色半透明，菌落中心带黑色或全部黑色或无黑色，在MCC琼脂平板上典型菌落为无色至淡红色、半透明或不透明，菌落中心有时带黑色或可疑者，均应挑选可疑菌落2-3个接种三糖铁琼脂片面上，阳性对照同时接种该培养基，培养18-24小时后，阳性对照斜面应为红色，底层为黄色。

硫化氢阳性而供试品的疑似菌斜面未见红色，底层未见黄色，可判为未检出沙门菌，否则，应继续作以下试验：靛基质实验：照大肠杆菌项下操作并判断结果。

脲酶试验：取可疑菌落培养物接种于脲琼脂培养基斜面上，培养24小时，斜面变为红色为阳性，培养基颜色无改变为阴性。

氰化钾试验：分别用白金耳蘸取可疑菌株的营养肉汤液一环接种至对照培养基及氰化钾培养基，立即用橡胶塞塞紧，培养24-48小时。

对照管应有菌生长，试验管有菌生长者为阳性，无菌生长者为阴性。

赖氨酸脱羧酶试验：取可疑菌落培养物分别接种于赖氨酸脱羧酶培养基及对照培养基培养24-48小时，对照管应为黄色，阴性，试验管呈紫色为阳性。

动力检查：取可疑菌培养物穿刺接种于半固体营养琼脂培养基中，培养24小时，细菌沿穿刺外周生长为动力阳性，否则为阴性。

阴性培养物应在室温保留2-3天后再判断。

血清凝集试验：在洁净载玻片一端取沙门菌属O多价1血清2-3环，再取培养物少许，与血清混合，将玻片前后侧动，如出现凝集现象，于0.9%氯化钠溶液和同株培养物作对照试验，无凝集现象时，判为血清凝集阳性，必要时应取斜面培养物制成浓菌悬液，在100℃水浴中保温30分钟，待冷，再作凝集试验，如出现凝集，应判为阳性，否则为阴性。

结果判断：如血清凝集试验阳性，生化试验符合硫化氢阳性，靛基质试验阴性，脲酶试验阴性，赖氨酸脱羧酶试验阳性，动力检查阳性，判检出沙门菌；血清凝集试验阴性，生化试验不符合，判未检出沙门菌。

上述各项试验任何一项不符合有可疑反应的培养物，均应进一步鉴定后作出结论。

5、铜绿假单孢菌检查：取供试液18-24小时的培养液划线接种于溴化十六烷基三甲胺琼脂培养基平板上，培养18-24小时。

当阳性对照的平板出现阳性菌落时供试品的平板无菌落生长或无可疑菌落生长，可判为未检出铜绿假单孢菌。

铜绿假单孢菌典型菌落呈扁平、无定形、周边扩散、表面湿润、灰白色，周围时有蓝绿色素扩散，如生长菌落具有上述特征或可疑者，应挑选2-3个菌落纯培养，取18-24小时的纯培养物，革兰染色，并作氧化酶试验。

氧化酶试验：取洁净滤纸片放在平皿内，用无菌玻璃棒取斜面培养物涂于滤纸片上，再滴加新鲜配制的1%二盐酸二甲基对苯二胺试液，在30秒内呈粉红色逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性，否则为阴性。

如证实非革兰阴性，芽孢杆菌或氧化酶试验阴性，均可判为未检出铜绿假单孢菌，否则应进行绿脓菌素试验。

绿脓菌素试验：取上述纯培养物接种于绿脓菌素测定用培养基斜面上，培养24小时后，在试管内先加氯仿3-5ml，搅碎培养基并充分震摇，静置片刻，加氯仿移至另一试管中，加入1mol盐酸试液约1ml，震摇后静置片刻。

如在盐酸溶液层内出现粉红色，即为绿脓菌素阳性。

试验同时应作阴性对照。

当阴性对照试验呈阴性时，并为革兰阴性杆菌，氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阳性，可判检出铜绿假单孢菌。

绿脓菌素试验阴性的培养物应继续作以下试验：硝酸盐还原产气试验：取可疑菌培养物接种于硝酸盐胨水培养基中，培养24小时。

如在培养基的肚试管中有气体产生，即为阳性。

42℃生长试验：取可疑菌的菌悬液接种于营养琼脂培养基斜面，立即置41±1℃的水浴中培养24-48小时，有菌苔生长者为阳性，否则为阴性。

明胶液化试验：以接种针蘸取同上培养物穿刺于明胶培养基内，培养24小时，取出置冰箱内10-30分钟，如果培养基仍呈溶液状，为阳性。

铜绿假单孢菌硝酸盐还原产气试验、42℃生长试验、明胶液化试验均为阳性。

6、金黄色葡萄球菌检查：取供试液的亚锑酸钠肉汤18-24小时的培养液划线接种于卵黄氯化钠琼脂平板或甘露醇氯化钠琼脂培养基平板培养24-72小时，当阳性对照的平板呈现阳性菌落时，供试品的平板如无菌落生长或有菌落但不典型，可判为未检出金黄色葡萄球菌；如卵黄氯化钠琼脂平板上有金黄色圆形突起、边缘整齐、外围有卵磷脂分解的乳浊圈，甘露醇氯化钠琼脂平板上有金黄色圆形突起、边缘整齐、外围有黄色环，应挑选2-3个菌落纯培养。

取18-24小时纯培养物革兰染色，镜检并作血浆凝固酶试验。

血浆凝固酶试验：取灭菌小试管3支，各加入血浆、无菌水0.5ml，一支加入被检菌株的营养肉汤培养液0.5ml，一支加入金黄色葡萄球菌的营养肉汤培养液或菌悬液0.5ml，另一支加入营养肉汤或0.9%无菌氯化钠溶液0.5ml 作阴性对照。

将3管同时培养，3小时后开始检查，观察至24小时。

阴性对照管的血浆流动自如，阳性对照管的血浆凝固。

试验完血浆凝固者为阳性。

阳性对照管和阴性对照管任何一管不符合要求时，应另制备血浆，重新试验。

结果判断：当阴性对照和阳性对照符合要求，供试品的菌株为革兰阳性球菌、血浆凝固试验阳性时，判为检出金黄色葡萄球菌。

7、破伤风梭菌检查：增菌产毒培养：称取供试品0.5g共3份，分别加至0.1%葡萄糖胞肉培养基40ml管中，其中一管约加0.05ml 新鲜的对照用菌液为阳性对照管；另取一支0.1%葡萄糖胞肉培养基加等量稀释液作阴性对照管。

以上各管均置于75-80℃水浴保温20分钟，然后，置厌氧培养箱、罐在36±1℃培养72-96小时。

观察结果，阴性对照管应无菌生长；阳性对照管应为培养基浑浊，倒管内有气产生，碎肉有被消化变色并有恶臭等现象。

取增菌产毒培养液涂片，作革兰染色，镜检。

幼龄菌革兰染色为阳性，菌体如骨棰状。

阳性对照应有上述典型特征。

当供试品培养管均不产气，无消化碎肉及臭气等现象，染色镜检未见疑似菌者，可报告供试品未检出破伤风梭菌；若供试品培养管两管产气，消化碎肉并有臭气，染色镜检不论发现或未发现可疑细菌，均应进行毒力试验。

毒力试验：包括作产毒试验和保护试验。

由破伤风败毒素引起的症状为小白鼠强直性痉挛、抽搐，呈现弓背反胀、腿部强直、尾巴竖立等，最后死亡。

保护组小白鼠无上述症状，即为毒力试验阳性。

试验组和保护组均未出现上述症状，即为毒力试验阴性。