炭疽采样与检测

4、采样时产生的废弃物放在利器盒中带回实验室 消毒。其他穿过、用过的一次性衣服等所有用过物品 都放在耐高压医疗废物袋中带回实验室121 ℃1h高压 灭菌。
5、采焦痂样品要稍用力涂抹，病人不疼，因为感 染炭疽杆菌时末梢神经受损。平时病灶处偶尔有些痒 。
6、采样拭子用病毒采样拭子，一般棉签会影响核 酸检测结果。
实验室检测技术
• 直接镜检 • 病原菌分离 • 血清学实验 • 荧光定量PCR法
直接镜检
• 对疑似病例的皮肤病灶表面直接用载玻片 按压蘸取渗出液，革兰氏染色，观察镜下 是否有大量两端平齐呈串联状排列的革兰 氏阳性大杆菌。
• 可作为临床诊断支持性实验依据。
直接涂片镜检
• 自己实用操作： 在生物安全柜中，拧开装有病灶涂抹物
水疱较小时：用注射器先抽取无菌生理盐水，注射进 水疱，再把水疱内生理盐水抽出来，放无菌离心管， 再用无菌拭子沾取水疱处可能剩余液体，然后用碘酒 消毒处理以免细菌扩散。
采集方法 —— 病患标本
（2人一起合作采样）
疑似皮肤炭疽
水疱期已破损
用无菌拭子沾取渗出液，每2个拭子放在一个15ml无 菌离心管中，手持部分折去，盖盖，在管上标记编号 等信息。最后用碘酒消毒处理以免细菌扩散。
标本类型
• 病患标本
血液 急性期和恢复期双份留取血清，检测抗体 皮损渗出液 分离病原、检测毒力基因、细菌核
酸、玻片染色 痰液、鼻腔拭子、排泄物、脑脊液等
• 动物标本
腐烂尸体、动物产品、皮毛、骨头、脏器、干血 块等。
• 环境标本
可疑污染土壤、污水、食物，可疑邮件粉末等
实际操作：实验室人员接到要 去现场采集标本任务后
7、采样结束怎样消毒手？
因为采样时带着双层手套，结束后脱去手套，常规 洗手即可。
采集方法 ——密切接触者
• 采集血液：测抗体 • 若有皮肤破损（病灶），用拭子采样，同
上面方法。
采集方法 ——动物相关
肉类
怀疑罹患炭疽的家畜已被宰杀 对商品肉类进行常规检查
剪取小块肉类，特别应剪 取肝脏、脾脏等富含血液 以及含淋巴组织的标本
产酸不产气
不产生靛基质 和H2S
炭疽芽胞杆菌的鉴定（可行）
特异噬菌体裂解和青霉素敏感试验
血清学实验
• 胶体金法检测抗体（不分IgG和IgM ）
优点：快速，简便，可迅速获得结果，特异性较好。 缺点：敏感性一般，有漏检的可能。
• 酶联免疫吸附试验
优点：敏感性高，特异性好，可定量检测，是确诊的依据 之一。
标本采集和运输前应事先准备工作浓度的消毒液（1% 次氯酸钠溶液），以及时处理意外发生的标本洒落。
三、医疗废弃物Leabharlann Baidu处理
及时将隔离衣、手套等一次性和可重复使用的物 品分别放入分类的高压袋，及时高压处理。
尖锐的物品要放置于专用的锐器盒里，及时高压 处理。
压力0.12MPa，温度121℃，有可疑炭疽污染的物 品时，需高压1h，若无炭疽污染的物品时，需高 压30min。
采集方法 —— 病患标本
（2人一起合作采样）
疑似皮肤炭疽
水疱期未破损（易发现炭疽杆菌）
水疱较大时：无菌操作下（注射器）穿刺水疱，无菌 棉签沾取水疱液，放在一个15ml离心管中，手持部分 折去，每采2个拭子放在一个15ml离心管中，每个病 例至少采集3管以上样品。然后用碘酒消毒处理以免 细菌扩散
• 1） ELISA包被液（0.01M PBS，pH7.4）： • 2）0.1M PBS（10×PBS，pH7.4）： • 3） 血清稀释液（MP Diluent）： • 4） ELISA稀释液（ELISA Diluent）： • 5） 洗涤液：0.01M PBS溶液加0.5%的Tween-20。 • 6） 显色液：TMB，即用型。 • 7） 终止液：0.5M H2SO4。
取表层土壤（10cm内）5份以上，每份500g左右， 加水静置，经加热处理后用漂浮法培养。
二、污染水源
牲畜饮水处 污物浸洗液
注射器吸取水样约500ml，用抽滤法培养滤膜 。 三、空气采样：空气采样器采300L，抽滤后进行培养。 四、可疑粉末：无菌小勺取样于无菌管中，注意要在严 格防护下小心取样，以免产生气溶胶。
缺点：耗时长，实验场所有设备要求。
胶体金法
按照说明书要求用生理盐 水稀释血清，直接滴加胶 体金试纸条，一定时间后 观察结果。
酶联免疫吸附试验操作程序
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)
原理（间接性ELISA）：
显色
酶联免疫吸附实验（ELISA）用液
炭疽杆菌的形态-培养
普通琼脂： 灰白色， 表面粗糙， 无光泽， 边缘不整 齐。
炭疽杆菌的形态-培养
普通琼脂： 灰白色， 表面粗糙， 无光泽， 边缘不整 齐。
炭疽杆菌的形态-培养
血琼脂： 灰白色， 表面粗糙， 无光泽， 边缘不整 齐， 不溶血。
ICDC, China CDC
炭疽杆菌的形态-培养
别放入高压袋或器皿中，及时高压处理；
炭疽常用消毒液：含氯消毒剂，1%次氯酸钠。
使用高压灭菌器处理，当压力达到0.12MPa，温度达到121℃时， 开始计时灭菌。有可疑炭疽污染的物品时，需高压1h。
炭疽菌株和样本的包装
卫生部《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或 样本运输管理规定》（卫生部第45号令）
双份血清。急性期和恢复期采集时间间隔应在7 天以上
急性期血清：发病7天内的血清（放宽条件14天内） 恢复期血清：发病14天后的血清
具体采集方法 —— 病患标本
1、采样人员到现场后，首先拿出一次性中单 铺在一处平整的桌面等地方，然后穿戴一次 性衣服、口罩、帽子、双层手套、防护眼镜 、鞋套等。 2、观察病灶部位。 3、打开出诊箱，拿出采样器材，按下述方法 采样。
毛皮或其他可疑污染物品
取小块，剪碎置无菌管内，加适量无菌生理盐水浸泡。
宰杀地土壤
在牲畜死亡或宰杀的地点，应取土壤标本或圈舍土。
采集方法 ——外环境标本
一、污染土壤监测
过去炭疽死畜和死亡病例埋葬地点 近年有人畜间炭疽发生或死亡的区域（如草场） 分离出炭疽杆菌的土壤地点，消毒效果监测及评价
（2人一起合作采样） 血液标本
用无菌手续采集病例静脉血5ml到无菌真空采血管 中。在管上标记编号等信息。最后用碘酒消毒处理 以免细菌扩散。
注：1、以上病患处标本每个病例至少采集3管， 最后管外用1%次氯酸钠消毒后放入采样箱。
2、血液标本采集后管外用1%次氯酸钠消毒后 放入采样箱。
3、样品采集后尽快送到实验室，除血液标本 外，其他带冰运送。
病患标本采集时，应穿防护服或隔离衣，戴双 层手套，必要时需要穿鞋套。
外层手套应按需要及时更换以免扩散污染。 采样后，标本管外及时消毒，采样部位应做好
碘酒消毒处理以免扩散感染。
二、标本储存与运输
可疑带菌的标本在储存和运送至实验室的过程中应特 别注意做好防护，应用 可加盖密封的双层容器包装（ 采过样的两个拭子放入无菌15ml尖底离心管，管外用 1%次氯酸钠溶液擦拭消毒然后再放入50ml尖底离心管 ，马上运回实验室）。
二、共同暴露着、密切接触者（一起生活、治疗、护理） 采集静脉血，测抗体。 若有皮肤症状（病灶），用拭子采样。
采样所需器具与耗材 (皮肤炭疽为例）
1、样品采集运送箱（出诊箱）2个
2、生物安全防护用品、消毒用品（足量、用出诊箱或黄袋子装）：
一次性防护服、乳胶手套、帽子、鞋套、防护眼镜、口罩、一次性中单 、多个耐高压医疗废物袋
炭疽
蜡样
炭疽杆菌的形态-培养
10×10显微镜下，卷发状，中央暗褐色，边缘有菌丝射出
炭疽杆菌G染色-繁殖体
显微镜下形态
革兰染色
ICDC, China CDC
孔雀绿沙黄芽胞染色
炭疽芽胞杆菌的生化特性 （不易鉴定，不典型）
葡 萄
麦 芽
蔗乳 糖糖
甘 露
水 杨
M
V 石蕊牛乳
糖糖
醇素 R P
产酸，液化迟 + + + __ _ _ _ 缓
一、疑似病例（尽可能在使用抗生素前采集） 1、皮肤病灶处样品（不放过散在瘀血点） 水疱渗出液：采样拭子蘸取或注射器抽取 焦痂表面：拭子稍用力反复涂抹 样品用途： A：玻片涂片(革兰氏染色查炭疽杆菌） B：涂血平板（炭疽杆菌分离培养） C：炭疽杆菌细菌DNA核酸检测
皮肤炭疽病例采集标本类型
2、静脉血 用途： A：抗体快速试剂检测 B：ELISA法测检测抗体
拭子的尖底管，用镊子夹住拭子杆，在玻 片上涂片，干后在酒精灯火焰外焰上通过3 次固定，进行革兰氏染色。
注：镊子随后高压消毒。
病原菌的分离
涂血平板： 在生物安全柜中，用镊子夹住病灶涂抹物拭子或 疱疹液拭子直接接种血平板（一般用血平板，也 可用营养琼脂平板），分3区或者4区划线，37℃ 培养16-18h，观察菌落形态。 挑取单个菌落于载玻片上进行革兰氏染色，镜下 观察结果。 （镊子随后高压消毒）
4、用于盛放废弃利器的锐器盒（可用带盖铝饭盒或硬质塑料盒）；
5、用于装一次性物品的感染性材料耐高压医疗废物袋
6、标签、水笔、记号笔、胶带、采样登记表；
7、洗手器具（手消毒液等）或脱去手套后洗手的洗手液和擦手纸。
采集方法 —— 病患标本
① 尽可能在使用抗生素前采集。 ② 皮肤病灶处标本采3份以上，尽可能多采。 ③ 病例均采集急性期和恢复期血液标本各1份，即
炭疽标本采集需注意的事项
• 注意个人防护，需戴口罩，戴手套，穿鞋套，必要时穿防护服或隔离衣，眼 罩等；
• 采集标本应在无菌操作下进行，标本管外及时消毒，应做好采样部位的消毒 处理以免扩散污染。
• 应事先准备工作浓度的消毒液，标本应用可加盖密封的双层容器包装，采样 后及时对容器外表面进行擦拭消毒；
• 标本运输中也应备有消毒液，以及时处理意外发生的标本洒落。 • 采样后及时将一次性的防护用品（防护服、手套等）和可重复使用的物品分
1、向流病科人员了解该病例基本情况： 病人流行病学史，初步怀疑什么病
去什么地点采样（医院、家？）
病人目前临床症状，是否使用抗生素，用 抗生素的时间和量，病人白细胞多少（细菌 感染升高，病毒感染不升高）
2、考虑： 去现场采集什么样品，并进行相应采样准
备工作。采样物品务必带全。
皮肤炭疽病例采集标本类型
结痂期（采黑色焦痂）
用无菌棉签蘸取生理盐水后稍用力反复涂抹焦痂表面 ，直到棉签头变成黑色。每2个拭子放在一个15ml无 菌离心管中，手持部分折去，盖盖，在管上标记编号 等信息。最后用碘酒消毒处理以免细菌扩散。
如果焦痂边缘有破损，也可用无菌棉签取焦痂下的组 织，其他同上。
采集方法 —— 病患标本
标本储存与运输
采集的标本应该放在可密封的采样管等容器中，并用双 层包装以免在运输过程中发生洒落。
采样后应在标本容器上标记好采样时间、地点、类型及 采样人员。
标本应尽早送检，若标本送达实验室的时间需超过1h， 应在2-8℃储存，血标本可室温直接运输至实验室。
运输炭疽菌株或样本时应当有专人护送，护送人员不得 少于两人。申请单位应当对护送人员进行相关的生物安 全知识培训，并在护送过程中采取相应的防护措施。
3、采样用品（放出诊箱里）：
无菌采样拭子、无菌生理盐水、剪刀、无菌15ml离心管、试管架、真空 采血管、注射器、一次性静脉采血针（蝶形）、75%酒精、镊子、络合碘、 1%次氯酸钠（临去采样现场前稀释好，用大瓶装）、50ml离心管（样品管外 层包装用）、无菌1.5mlEP管、显微镜载玻片和载玻片放置架、 血平板和接 种环（如果在当地能进行初步培养的话可带）、压舌板、无菌小匙；采集环 境标本时应使用宽口的容器；
炭疽采样与检测
了解炭疽病原
• 生物危害程度
国际：生物危险分类属于III类 中国：危害程度分类属于第二类
——卫生部《人间传染的病原微生物名录》
• 炭疽芽胞杆菌特点
在自然界易形成芽胞 芽胞对外环境有较强抵抗力 被芽胞污染的环境消毒困难，易传播扩散
实验室防护级别
• 从现场标本中直接进行细菌分离培养、初 步鉴定、药物敏感性试验、生化鉴定、免 疫学试验、PCR核酸提取、涂片、显微镜检 查等检测活动可在生物安全二级实验室中 进行。
• 大量活菌操作和动物感染实验应在生物安 全三级实验室中进行。
• 基层实验室一般仅做细菌检验分离，要求 具有实验室、无菌室和生物安全柜，一般 不做强毒菌动物感染和解剖，应有能用的 高压灭菌设备和安全的污水消毒设施。
• 炭疽杆菌对含碘和含氯消毒剂敏感，酒精 消毒效力差。
个人防护与环境保护
一、标本采集防护