滋养层细胞的制备

1．器材

眼科镊子；眼科剪；平皿；200目筛；小烧杯；细胞计数板；离心管2．试剂

双抗；DMEM(DMEM/F12)；FBS；胰蛋白酶(0.25%)；Ⅰ-胶原酶(0.1%)；PBS；75%酒精；0.4%台盼蓝；

3．方法步骤

3.1．滋养层的分离

(1)将剥离下的组织放入75%酒精中10s，用含双抗的PBS冲洗2次，取出组织放入含有双抗的PBS缓冲液中，4℃保存，6-8 小时内带回实验室。

(2)将采集的胎盘样品用75%的酒精表面消毒后迅速的移入到新鲜的含双抗的PBS缓冲液中冲洗2-3次，移入无菌间内的超净工作台内。无菌双抗PBS缓冲液冲洗3 次，用眼科剪小心剥离胎膜、尿囊膜、毛细血管等与绒毛膜紧密相连组织，无菌双抗PBS缓冲液冲洗3次。

(3)用眼科剪剪成1-3mm3的组织小块，含双抗的PBS悬浮沉淀漂洗3 次，每次3 min。加入等体积于组织样品的0. 25 %胰蛋白酶消化液，37℃恒温震荡箱消化10 min，弃上清。再加入等样品20-30 倍的0.25%胰蛋白酶和0. 1 %胶原酶1:1 复合消化液，37℃消化30 min，收集上清液。将剩余组织再次加入复合消化液 5 min，直至大部分组织被消化成细胞悬液，收集每次消化后的上清液加入等体积含10%血清的培养基终止消化。

(4)将所得到的细胞悬液通过200 目的不锈钢筛网。

(5) 1200 r/min,离心5 min,用完全培养基重悬离心沉淀的细胞,将细胞悬液浓度调整至5~6X105个/mL。

(6)置于37℃5% CO2培养箱中培养；隔日更换培养基一次以去除血细胞和其它无法贴壁的成分，待细胞贴壁后更换培养液，此后每3d 更换培养液1 次。直至首次传代。

3.2．滋养层的纯化与传代

纯化过程与传代培养同时进行。当原代培养的滋养层细胞贴壁生长到90%以上汇合度时应进行传代。首次传代前24 小时更换培养液。

(1)反复贴壁法

将原代培养的细胞用0. 25%胰蛋白酶消化后，制成不含血清的细胞悬液，接种到培养瓶内，静止20 min；镜下观察部分细胞贴壁（稍加摇荡也不浮起），由于在无血清培养液内成纤维细胞比上皮细胞贴壁快，此时的贴壁细胞主要为成纤维细胞，上皮细胞大多数悬浮在培养液内，然后将培养液（含未贴壁细胞）吸到另一培养瓶内，加入含血清的培养液继续培养；再次制备不含血清的细胞悬液，重复以上操作传代培养3 次，可获得较高浓度的胎盘滋养层细胞。

(2)消化排除法

将原代培养的细胞用0. 25%胰蛋白酶消化液（含0. 02% EDTA）加入培养的细胞中，镜下见纤维样细胞缩短变圆，部分细胞脱壁，立即加入含有血清的培养液终止消化。轻轻振摇培养瓶后，倒掉液体，用含血清的培养液清洗瓶内贴壁的细胞，最后向瓶内加入含血清的培养液后继续培养，等下次传代时重复以上操作。这样重复传代 5 次即可

得到纯度较高的胎盘滋养层细胞。（因成纤维细胞比上皮来的滋养层细胞先脱落，将先消化下的成纤维细胞弃掉，这样经过几次反复传代处理，可把成纤维细胞除净）。用胰蛋白酶消化细胞要严格控制消化时间，此过程始终保持在倒置显微镜下观察，当滋养层细胞生长区域内有细胞发生细胞质回缩现象时终止消化。弃掉消化液，在室温下静置1 min 左右，加入适量的培养液，用移液枪轻轻吹打成细胞

悬液，调整细胞密度为1X106个细胞/mL，按1：3 的比例进行传代培养。

3.3．细胞活力检测(台盼蓝排斥试验)

通过消化法分离组织，制备成单细胞悬液，做适当稀释（106/ml）)后取9滴细胞悬液移入小试管中，加1 滴0.4%台盼蓝溶液，混匀，镜下观察，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染，在 3 分钟内用血球计数板分别计数活细胞和死细胞数，并计算细胞活率，重复 6 次取平均值。根据下列公式计算细胞活力：

活细胞率(%)=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100%

3.4．细胞冻存试验

(1)培养的细胞汇合达80%左右时,可进行细胞冻存,倾斜培养瓶,吸去陈旧培养基,37°C预热的PBS洗3次。

(2)使用37°C预热的浓度为0.25%胰蛋白酶,使液体覆盖整个瓶底面,尽快移至37 °C培养箱内,大部分细胞消化脱离瓶壁即可。

(3)使用等量的含有血清的高糖DMEM完全培养基,使胰蛋白酶停止消化作用,防止对细胞的过度消化,轻轻吹打使细胞,使细胞以单个形式

存在。

(4)移液器将消化得到细胞悬液,置于准备好的15 mL离心管,细胞保持混匀状态,微量移液器吸取少量细胞悬液进行细胞计数试验,其余细胞液体则用来进行细胞冻存。

(5)细胞悬液离心,1500 r/min,10 min,尽可能去除上清液体,保持细胞团块的完整性。

(6)现用现配细胞冻存液(DMEM:FBS : DMSO = 7: 2: 1),加入一定量

的细胞冻存液重新悬浮细胞,调整细胞密度。

(7) -80℃过夜保存,投入液氮,进行长期保存。

3.5．滋养层细胞的复苏试验

(1)把标记好的细胞冻存管,立即放入37℃的水浴锅内解冻,期间不停地温和摇动,使冻存液快速融化。

(2)冻存管使用75%的酒精消毒后,在超净台内,细胞悬液转入15 mL的离心管。

(3)再加入15 mL的高糖DMEM完全培养基,移液器轻轻吹打细胞悬液混合均匀,离心,1200 r/min,10 min,倒掉细胞上清液,剰余的是细胞团块。

(4)使用3 mL的高糖DMEM重新悬浮细胞,混合均匀,去少量的细胞做细胞计数。

(5)剩余的细胞则转到细胞培养瓶中,于37°C, 5% C02培养箱内培养。

(6)隔日除去未贴壁的细胞,更换新的培养基,以后每2d换一次液,观察细胞的生长状况和形态变化。