Removed_小鼠精巢细胞减数分裂标本的制备与观察

小鼠细胞分裂标本的制备与观察

一、实验目的

a)掌握小鼠精巢染色体标本制作法。

b)观察减数分裂过程中不同时期的染色体。

c)观察腹水瘤细胞有丝分裂中不同时期的染色体形态。

二、实验原理

a)减数分裂（Meiosis）是发生于生殖细胞的一种特殊的细胞分裂方式，

DNA复制一次，而细胞连续分裂两次，形成单倍体的精子和卵子。减数

分裂远比有丝分裂复杂，经两次细胞分裂，分别称减数分裂Ⅰ、减数分

裂Ⅱ，两次分裂间又一个较短的间期，这个间期DNA不复制。

b)雄性动物精子发生于睾丸曲精细管的生精上皮细胞，由其中的精原细胞

经多次有丝分裂和生长，形成初级精母细胞，初级精母细胞经减数分裂

形成次级精母细胞，次级精母细胞有丝分裂成精细胞，再经一系列变化

成精子。

c)因此，通过分离曲细精管、剪碎并加入液体吹打，可使官腔各种细胞游

离出来，然后经过低渗、固定、染色等过程就可制成包含减数分裂各期

的标本。

三、实验试剂及仪器

a)材料：成年雄性小白鼠

b)用品：注射器、平皿、尖头镊子、剪刀（普通剪刀、眼科小剪刀）、吸

管、离心管、离心机、玻片等。

c)试剂：1、100μg/ml秋水仙素。

2 、2％柠檬酸钠溶液

3、 0.075M的KCI

4、3:1甲醇:冰醋酸及1:1甲醇:冰醋酸（应现配）

5、PH6.8，0.01M的PBS缓冲液

6、Gimesa原液

7、Gimesa工作液：1份Gimesa原液加9份PH6.8，0.01M的PBS

缓冲液，混匀。工作液应现用现稀释。

四、实验步骤

a)细胞收集

i.小鼠精巢细胞收集

1.注射秋水仙素，增加中期分裂相。 (试验前4－5小时，小鼠腹

腔注射秋水仙素0.5ml（100μg/ml）。

2.取睾丸并清洗。断颈处死小鼠，剖开腹部，取出肾形睾丸，

放入盛有4－5 ml2％柠檬酸钠溶液的平皿中，洗去污血，去掉

胞外脂肪等物。

3.挑出曲细精管并剪碎。弃污液，另加柠檬酸钠溶液1 ml，用尖

头镊尖将曲细精管拉出，并用眼科剪尽量将其剪碎。

4.游离并收集细胞。将剪碎的曲细精管及溶液移入离心管中，用

吸管反复吸打1－2min，使尽量多的细胞从管腔中游离出来；

静置5 min（或300rpm离心2 min），使大的膜管状杂质下沉；

吸含有游离细胞的上清液于另一管中，1000 rpm离心5 min，

沉淀即为不同发育阶段的细胞。

ii.小动物骨髓细胞收集

1.处死动物，取长骨。

2.用剪刀剔除骨上所附肌肉及其他组织。

3.用剪刀剪开骨头两端。

4.用带针头的注射器吸取生理盐水将骨髓腔中细胞冲到小烧杯或

小平皿中，在转入离心管中。

b)细胞染色体标本制备（包括上述两种及腹水瘤细胞）

i.低渗处理，使细胞胀大,加入5 ml 0.075M的KCI，轻轻吹打混匀，

静置10 min。

ii.预固定. 向离心管中加入1ml 3:1甲醇:冰醋酸，轻轻吹打混匀，静置2 min，1000 rpm离心8min，弃上清。

iii.固定. 向上述沉淀中加入5 ml 3:1甲醇:冰醋酸，吹打混匀，静置10－20 min，1000 rpm离心8min，弃上清。

iv.再固定加5 ml 1:1甲醇:冰醋酸，吹打混匀，静置5 min，1000 rpm离心8min，弃上清，加2-3滴1:1甲醇:冰醋酸固定液悬浮细胞。

(有残余液就直接滴片，不用另加固定液）

v.滴片。滴一滴细胞悬液于冰水中刚捞出的湿载波片上，自然干燥。

vi.染色。 Gimesa染液20-30 min,流水洗去多余染液，待干

五、实验结果

a)腹水瘤细胞湿片观察

上图当中，圆圈1内的为腹水瘤细胞分裂后期的染色体形态。此时的染

色体较中期细，切此时的染色体不规侧，如图所示染色体基本分为两个区域。

圆圈2内的为腹水瘤细胞为分裂前期的染色体形态。圆圈3内的腹水瘤细胞为分裂间期的染色体形态。分列前期与分裂间期的染色体形态的区别为：分裂间期的细胞核内的染色质分布均匀，颜色均匀；分列前期的时间比较长，所以染色体的形态也比较多种，有细胞核膜还存在的，但其中的颜色不均匀，还有细胞核膜已经解体的，但染色体比较凌乱，且比较紧密。

如图所示，圆圈1中所示的为腹水瘤细胞有丝分裂中期的染色体形态。此时，染色体排列的较有规律，而且染色体也比较粗。这个时期比较容易辨认，而且就观察所得，处于中期的细胞数量也比较多。

如图所示，圆圈1内的细胞可能为腹水瘤细胞有丝分裂末期的细胞。

（但是，观察的不是非常清楚，所以我也不能确认。）

b)腹水瘤细胞干片观察

如图所示，为腹水瘤细胞有丝分裂的干片观察。装片当中，细胞膜破裂的极少，只有少数细胞细胞膜破裂，可以看到里面的染色体，图中可以看到的染色体基本处于细胞分裂中期，因为细胞分裂中期也是最容易观察的。

c)精巢细胞的减数分裂观察（与a）中的形态基本相同的前期、中期等的

染色体形态就不再赘述，主要来看一下精巢细胞所特有的染色体及细胞形态）

如图所示，圆圈1当中的精巢细胞已经完成了减数分裂，但是细胞质的分裂还没有完成。下拨之分裂完成以后及形成精细胞，在经过形态变化即可形成精子。图中可见清晰的细胞膜、核膜以及染成深色的染色体。

圆圈2当中蝌蚪形的深色物质为细胞膜裂解后暴露在外面的精巢细胞的核。

图片拍的不是非常的清晰，但是可以看出上图所有完整的细胞但中都有

两个被染成了深色的核，触不可以判断该细胞正处于减数第一次分裂的

末期。

六、实验分析

a)实验中各种试剂的作用：100μg/ml秋水仙素，用于促进细胞分裂。2％

柠檬酸钠溶液，用于对细胞进行清洗。0.075M的KCI，用于细胞的膨大，且因为浓度控制的刚好，所以细胞又不会破裂。3:1甲醇:冰醋酸及1:1

甲醇:冰醋酸（应现配），用于固定细胞。Gimesa原液，用于染色。

b)试验中腹水瘤细胞的观察分为干片和湿片。湿片是将细胞悬液滴在已经

预先放在冰水当中湿润过的载玻片，使细胞破裂；而干片上的细胞基本

上不破裂。

七、注意事项

a)收集尽量多的细胞。

b)加入低渗液后一定要轻轻吹打，以免细胞核提前破裂，引起染色体外遗，

无规则排列。

c)染色要扣染，以免染液在玻片表面形成氧化膜，影响观察。