2014凋亡细胞诱导与检测--LX

（药物、紫外线等）
形态学特征
生物化学特征
（DNA含量及降解分析）
显微结构
超微结构
琼脂糖电泳法
流式细胞检测法
四、实验操作方法与步骤
1.凋亡诱导： 2. 光学显微镜观察 ❖ 观察细胞形态特征，如细胞缩小，核质固缩聚集，形成嗜酸小体及吞噬现象等。但一般只能
作为细胞凋亡的推测，不具有诊断价值，因为在光镜 下某些类型的细胞坏死（如凝固性坏死） 可与细胞凋亡的形态相似。
结果
（1）加MTT4小时后，倒置相差显微镜下观察可见黄色的MTT被还原成紫蓝色颗粒，加DMSO后紫 蓝色颗粒溶解。
（2）各组OD值取均值后，以下式计算存活细胞百分数∶
ຫໍສະໝຸດ Baidu
OD实验组
存活细胞%=
×100%
OD对照组
（以空白组OD值调零）
对照组
实验组
谢谢
2、凋亡小体形成
（1）凋亡起始 微绒毛消失，线粒体正常， ER膨胀与质膜融合，染色质固缩、边集
微绒毛消失
染色质固缩、边集
（2）凋亡小体形成
染色质片段化与细胞器一起被反折的膜包围， 出芽形成凋亡小体。
(3) 凋亡小体被吞噬、消化 Macrophage/Phagocyte
诱导细胞凋亡的因子
◆物理性因子：包括射线（紫外线， 射线等）， 较温和的温度刺激（如热激，冷激）等
4人分组、加药（每竖排按从前到后的顺序1—8组） 每组6个孔加药，其中2个对照（PBS）
1
2
3
4
5
6
1
A
2 3 B
4 C
D
理论知识
细胞凋亡是由基因控制的程序性的细胞主动死亡 细胞凋亡的形态结构改变过程 .
(apoptotic bodies) 细胞皱缩—— 染色质凝集 —— 凋亡小体形成 (cell shrinkage) (chromatin condensation)
倒置相差显微镜观察
正常肝癌HepG2细胞
形成凋亡小体
3. 吖啶橙（AO）荧光
标本制备： 漂洗
固定 染色 封片 观察 （95％乙醇）
吖啶橙（AO）荧光显示肝癌细胞凋亡小体
4. Giemsa染色
每3人一组，取出一飞片，放入小培养皿，PBS液冲洗，甲醇固定10min，取出飞片晾干， 置载玻片上， Giemsa染色5～10分钟，自来水冲洗，中性树胶封片，镜下观察细胞凋亡 情况。
PI（碘化丙啶）是双链核酸的标记物，可嵌入双链DNA或双链RNA中，PI不能穿过功能完整细 胞膜，只能进入膜有损伤的细胞。在紫外光或绿光激发后，坏死细胞呈现出很强的桔红色荧光。 正常细胞和凋亡细胞膜功能完好，PI不能进入细胞，故不发红色荧光。
荧光探针Ho.33342是一种特异性DNA标记物，主要结合于A-T碱基区，由于它的亲脂性，可以 进入活细胞中标记DNA（也可以进入死细胞），因此，对正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞都可以 进行标记。在紫外光激发下，正常细胞和凋亡细胞都发出明亮的蓝色荧光，坏死细胞因PI发出的 强桔红色荧光而被遮盖。所以从颜色上很容易将坏死细胞区分出来；再根据染色质凝集程度和凋 亡小体区分正常细胞与凋亡细胞。
油中，避免产生气泡，封固后荧光显微镜观察。 （6）荧光显微镜下观察：
在紫外光激发下，正常细胞和凋亡细胞都发出明亮的蓝色荧光，坏死细胞发桔红色荧光。正常肝 癌细胞核荧光均匀，而凋亡细胞核凝集的染色质发强蓝色荧光，周围可见带蓝色荧光的凋亡小 体。
正常细胞
凋亡细胞
6. MTT法检测细胞活力
琥珀酸脱氢酶显示 ❖ 琥珀酸脱氢酶(Succinate dehydiogenease)存在于线粒体内，在有酶存在的部位，酶可作用
3.激光共聚焦显微镜
4. 流式细胞仪（FCM）
◆凋亡检测技术的选择原则
一般选择2~3种检测方法,以相互印证,如形态学方法可选择荧光或电镜,再加TUNEL、 FCM、DNA片段或caspases等方法 根据凋亡发生的时间顺序,选择适当的检测试剂和技术 注意检测的时间
三、细胞凋亡研究方法
诱导细胞凋亡 检测
方法
设空白组、正常对照组、加药实验组（空白组除不加细胞外、正常对照组除不加药物外其余 均与加药实验组同样处理） （1）细胞传代∶将贴壁生长的肝癌细胞用0.25%胰酶消化终止后，调整细胞密度为5×104个/ml, 每孔100μl传于96孔板A、B、C、D四个排孔内，待细胞培养至指数生长期时加药。 （2）每孔加入不同剂量的大蒜素（3、10、25 ml），每种剂量加三孔，以药物溶剂作对照，将 培养板放回37℃继续培养0.5h；
于底物进行脱氢，脱下的氢与四唑盐（如：硝基蓝四唑Nitro-BT、四甲基偶氮唑盐MTT等）作 用，将氧化型的四唑还原成有色的甲臜。
本实验中培养细胞内琥珀酸脱氢酶，使MTT还原成紫蓝色甲臜，二甲基亚砜可将甲臜溶解， 酶联仪测其光密度得到OD值。通过OD值可计算不同条件下细胞的存活比率。此法常用来测 试细胞毒作用、癌细胞对体外放射及化学药物的敏感性、或体外细胞系筛选有效化疗药物及放 射增敏剂等。
考评内容与时间：
第一部分
培养细胞凋亡的诱导 凋亡细胞形态学观察 细胞增殖活力检查
◆凋亡诱导： 肝癌细胞HepG2
（1）培养液：10%小牛血清 高糖DMEM; ❖ 培养条件：37℃ 5%二氧化碳饱和湿度培养箱 （2）传代：以5×104细胞密度于含有盖玻片的24孔板， 37℃培养过夜； （3）每孔加入5ml的大蒜素（终浓度为60µg/ml），以药物溶剂（PBS）作对照，37 ℃培养1h；
正常细胞
凋亡细胞
一、细胞凋亡的形态学特征
apoptosis
necrosis
细胞变圆、微绒毛消失、膜皱缩胞质浓缩， ER扩张与质膜融合，核浓缩，染色质边集 形成凋亡小体
细胞膨胀、ER、Mi、核肿胀 溶酶体膜破坏 细胞溶解
细胞坏死与程序性细胞死亡比较
细胞凋亡在形态学上可分为三个阶段：
1、凋亡起始
3、凋亡小体被吞噬、消化
操作步骤： （1）取出24孔培养板中的飞片置于培养皿上； （2）0.01M的PBS轻轻洗细胞3次，平均每次5min； （3）加入50ml荧光染料Heochst 33342/PI混合液， 室温避光放置30min（纸盒、封口膜）； （PI使用浓度为50ug/ml，Ho.33342使用浓度为10ug/ml） （4）0.01M的PBS轻轻洗细胞3次，平均每次5min； （5）用吸水纸吸取爬片上的液体，滴加5ml碱性甘油于载玻片上，将爬片上的细胞面向下盖于碱性甘
5.碘化丙啶（PI）/Ho.33342荧光双染检测
【实验原理】 正常细胞和凋亡细胞的膜都保持了膜的完整性，但凋亡细胞核染色质发生高度凝集 和缘化，并形成大小不同被膜包围的凋亡小体，而正常细胞核染色质均匀分布；坏死细胞膜损伤， 染色质凝集程度远底于凋亡细胞。根据细胞膜功能完整性和核内染色质发生凝集的特点，用荧光 探针碘化丙啶（PI）和Ho.33342双染方法可以区别凋亡细胞、坏死细胞和正常细胞。
2014凋亡细胞诱导与检测--LX
课程安排
本次融合试验共32学时，在“细胞与分子医学教学平台”实施教学； 细胞生物学、分子生物学、遗传学三个研究所共同承担授课，每个研究所各分配8学时，总
结考评8学时； 分组：每实验台双面6位同学为一大组，单面3位同学为一小组。此次划定后一直到实验结束。
考评以大组为单位进行，成绩共享。 考评安排：每大组由一名同学主讲，负责分工和答辩材料准备。地点在实验室进行。
凋亡小体
普通光学显微镜观察
染色质新月形边集（HE染色）
凋亡小体（HE染色）
2.荧光显微镜 用荧光染料直接对细胞DNA进行染色，或用荧光标记的特异性探针对细胞进行标记。常用的直
接用于细胞染色的荧光染料有：DAPI、Hoechst33258和 Hoechst33342、PI、EB等。 细胞染色后色彩表现清晰，浓缩部分的荧光亮度明显增强。
第1组
2
3
4
大蒜素 剂量 3ul 10ul
25ul 对照组
方法
（3）把各孔中培养基弃去，加入DMEM培养基100μl，于各孔加入10ml 5mg/ml MTT， 37℃培养4h； （细胞在SDH作用下把黄色MTT还原成紫兰色结晶）。
（4）吸弃培养液，各孔加入100μl DMSO，将培养板振荡10～20分钟，37℃培养10min 。 （5）用酶联仪测定光密度值（以空白调零），通过与对照组比较得到实验组的存活率。
◆化学及生物因子：包括活性氧基团和分子，DNA 和蛋白质合成的抑制剂，激素，细胞生长因子，肿 瘤坏死因子（TNF），抗Fas/Apo-1/CD95抗体等
二、细胞凋亡的形态学检测方法
1. 倒置相差显微镜观察 ➢ 观察细胞形态特征，如细胞缩小，核质固缩聚集，形成嗜酸小体及吞噬现象等。但一 般只能作为细胞凋亡的推测，不具有诊断价值，因为在光镜下某些类型的细胞坏死（如 凝固性坏死）可与细胞凋亡的形态相似。