生化实验四--果蔬中过氧化物酶分析
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w——植物鲜重（g） t——反应时间（min） D——稀释倍数，即提取的总酶液为反应体 系内酶液的倍数
电泳槽系列DYCZ-24D
• 产品名称：迷你双垂直电泳槽 • 产品型号：DYCZ-24D • 产品售价: 1200元
产品说明： 高透明度聚碳酸脂注塑成型，品 质与进口产品相同。使用极其方便 可靠，绝不漏胶漏缓冲液。凝胶板 净面积82×82（mm），双板，可作 0.75、1、1.5（mm）胶（任选两 种），试样格10、15齿。 试样格（梳子） 1mm 10齿 2把 1mm 15齿 2把 1.5mm 10齿 2把 1.5mm 15齿 2把
1、实验材料 各种果蔬
2、仪器设备 分光光度计，研钵，恒温水浴锅，100mL容
量瓶，吸管，离心机等。
3、试剂 ⑴、0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH7.6） ⑵、反应混合液：
100mmol/L磷酸缓冲液（pH7.6）50mL于烧杯 中，加入愈创木酚28μL，于磁力搅拌器上加热搅拌， 直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧 化氢19μL，混合均匀，保存于冰箱中。
利用过氧化物酶能催化H2O2把联苯胺氧化成蓝 色或棕褐色产物的原理，将经过电泳后的凝胶置于 含有H2O2及联苯胺的溶液中染色，出现蓝色或棕褐 色部位即为过氧化物酶同工酶在凝胶中存在的位置， 多条有色带即构成过氧化物酶同工酶酶谱。
板栗
盘菜
三、器材
稳流稳压电泳仪； 冷冻离心机及离心管； 成套电泳槽； 微量进样器（50μL） 高速离心机（10 000r/min） 量筒：500mL，10mL，5mL（各×1） 烧杯：250mL×4 pH试纸； 其它常规用具（玻棒、大培养皿等）
膜具安装
膜具安装
装封胶条
将玻璃装进槽里
将楔子插进
灌胶
插梳子
胶凝后用夹子将玻璃夹出
用夹子夹紧玻璃将封胶条轻轻撕掉
旋转180度，凹玻璃向里
将玻璃放进槽内
加缓冲液
加样
剥胶
剥胶
切胶
将胶剥到染料中
电压的选择
两个电极之间距离 每厘米10伏电压，恒压
浓缩效应：样品通过浓缩胶时被浓缩成高浓 度的样品薄层，甚至能浓缩几百倍。其原因：
三、实验步骤
1、取上述样品提取液2.5mL，定容至50mL刻度，备 用（仅指萝卜与盘菜，冬枣，柚子与梨不稀释）。 2、取光径1cm比色皿2只，于1只中加入反应混合液 3mL和磷酸缓冲液1mL，作为对照，另1只中加入反 应混合液3mL和上述酶液1mL（如酶活性过高可稀释 之），立即开启秒表记录时间，于分光光度计上测量 波 长 470nm 下 吸 光 度 值 ， 每 隔 1min 读 数 一 次 （ 连 读 5min，取平均值）。
5、点样 将稀释10倍的电极缓冲液倒入两槽中，上槽
即加样槽（短板侧）缓冲液要求没过样品槽，下 槽（长板侧）缓冲液要求没过电极，备用。
用微量注射器（50μL）吸取少量样液，在浓 缩胶上层点样，点样量：
冬枣，柚子，梨：15、30、50μL 萝卜、盘菜：10、20、30μL 点样时须小心，防止样品液扩散。 向上槽液中滴加0.1%溴酚蓝2～3滴。
7、剥胶 取出胶板，去掉胶套，用微量注射器沿玻璃
内面注入一定量水后即可掀开玻璃，去掉浓缩胶 （注意先进行测量），将分离胶放入培养皿。
8、染色 将配制好的染色液倒入培养皿，室温下染色
1～10min后显示蓝色条带，后变红褐色。用去离 子水漂洗，并拍照记录。
9、记录酶谱，并计算各同工酶的迁移率（Rf值）
样品分子在上层大孔径的浓缩胶中快 速移动到小孔径的下层分离胶时，由于凝 胶孔径突然变小而移动速度大大减慢，使 之在浓缩胶与分离胶的界面处被浓缩成一 狭窄的区带，一齐进入分离胶，然后再进 行与连续凝胶电泳类似的电泳分离。
3、过氧化物酶同工酶凝胶电泳 过氧化物酶是植物体内的常见氧化酶。植物体
内许多生理代谢过程常与其活性及其同工酶的种类 有关。利用特异性颜色反应使待测酶着色，便可在 凝胶中展现出酶谱。
实验四
果蔬中过氧化物酶分析
生命与环境科学学院 生化组
㈠、过氧化物酶同工酶的分离 ——（PAGE法）
一、目的
1、了解聚丙烯酰胺凝胶的制作过程及结构 特点。
2、掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理及分离 过氧化物酶同工酶的电泳过程。
二、原理
1、聚丙烯酰胺凝胶的形成、结构及特性
聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 是 由 丙 烯 酰 胺 （ Acr ） 和N，N- 甲叉双丙烯酰胺（Bis）聚合而成的 大分子。凝结过程：过硫酸铵溶于水产生大 量自由基，引发Acr与Bis也形成自由基，在 四甲基乙二胺（TEMED）催化下这些自由 基之间进行反应而聚合成凝胶。聚丙烯酰胺 凝胶是具有立体（三维）网状结构的大分子。
3、制胶（分离胶、光聚合、浓缩胶） 拔出梳子，倒入电极缓冲液，备用。
4、过氧化物酶的提取 按下列比例称取果蔬： 冬 枣 ， 柚 子 ， 梨 ： 1:2 ； 萝 卜 、 盘 菜 ： 1:10
（W:V），剪碎，放入研钵中，加适量石英砂及 样品提取液于冰浴上研磨成匀浆，置于离心管中， 研钵用少量提取液清洗，洗液并入离心管，以 14000r/min的转速离心15min，取上清液贮存于低 温冰箱备用。
10g
/100mL
亚甲基双丙烯酰胺 2.5g
pH 8.9 pH 6.7 pH 8.9 pH 6.7
E 核黄素/100mL
核黄素 4mg
F 蔗糖/100mL
蔗糖
40g
电极缓冲液/100mL （用时稀释10倍）
Tris 甘氨酸
6g 28.8g
封板胶 （加热煮沸）
琼脂粉 电极液
1g 100mL
样品提取液
电泳开始后，由于快离子的泳动率最大， 在快离子后面就形成一个离子浓度低的区域， 即低电导区。电导与电势梯度是成反比的，低 电导区就产生了较高的电势梯度，这种高电势 梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动， 因而在高电势梯度区和低电势梯度区之间形成 一个迅速移动的界面。由于样品蛋白质的有效 泳动率恰好介于快、慢离子之间，所以也就聚 集在这个移动的界面附近，被浓缩成一狭小的 样品薄层。
浓缩胶用pH6.7的Tris-HCl缓冲液制成。电泳 时，由于HCl解离度大，几乎全部释放出Cl-，而 电泳槽中的Tris-甘氨酸缓冲液pH=8.3，因为甘氨 酸的等电点为6.0，在电泳过程中，它只有极少数 分子（1%～0.1%）解离成H2N-CH2-COO-。
一 般 酸 性 蛋 白 质 在 此 pH 下 也 解 离 为 带负电荷的离子，但其解离度比HCl小， 比甘氨酸大。这3种离子带有同性电荷， 在一定的电场作用下，它们的泳动率不同， 根据有效泳动率的大小，最大的称为快离 子，最小的称为慢离子。电泳开始时3种 凝胶中都含有快离子，只有电泳槽中的缓 冲液含有慢离子。
四、结果计算
以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即
以OD470/[min·g（鲜重）]表示之。也可以用每min
光密度（OD470）变化0.01为1个过氧化物酶活性单
位（u），即：
过氧化物酶活力 =
△OD470nm 0.01×t
×D
过氧化物酶比活力 =
△OD470nm 0.01×wt
×D
式中： ΔOD470——反应时间内吸光度的变化
点样点到酶带的距离 Rf = 点样点到溴酚蓝前沿的距离
＋
溴酚蓝前沿 酶带
－
×
点样点
㈡、过氧化物酶活性的测定
一、原理
在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创 木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在470nm处 有最大吸收，可用分光光度计测量470nm的吸光 度变化测定过氧化物酶活性。
二、实验材料、仪器设备与试剂
生物化学实验 第一部分
果蔬成分的生化分析
综合实验一：
果蔬成分的生化分析
实验一 果蔬中维生素C的定量测定（4学时） 实验二 果蔬中总糖及还原糖含量的测定（4学时） 实验三 果蔬中蛋白质含量的测定（4学时） 实验四 果蔬中过氧化物酶分析（12学时）
实验材料：
冬枣＋柚子——1～4组 梨（2个品种）——5～8组 盘菜＋萝卜 ——9～12组
2、聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 凝胶电泳具有一般电泳的电场效应，即
在一定pH的溶液中，样品分子由于解离或 吸附，使自身带一定的电量，在相同的电场 强度作用下，不同的样品分子因带不同的电 性和电量，电泳时具有不同的泳动速度，使 最终的迁移距离不同而分离。
凝胶电泳与其他电泳的重要区别是它除了有 电场效应外，还具分子筛效应：凝胶是一种立体 网状结构物质，样品分子在通过凝胶网孔时受到 摩擦力等的作用，其结果：体积小、且为圆球状 的样品分子受到的阻力较小，移动较快，而体积 大，形状不规则的样品分子受到的阻力较大，移 动较慢。因此，凝胶电泳不但从分子带电情况的 差别，而且还从分子大小、形状等方面的差别来 分离样品分子，具有很高的分辨力。
6、电泳 按上“－”下“＋”接好电源线（上槽即加
样槽为负极）。将电泳槽置于4℃冰箱（或接通 电泳槽水冷却系统）。打开电源开关，调节电流 到 10mA 左 右 ， 当 样 品 进 入 到 分 离 胶 后 加 大 到 30mA，维持恒流。待溴酚蓝指示剂下行到距胶 板末端1cm处，即可停止电泳。关闭电源，电泳 约3h。
蔗糖
（0.1mol/L磷酸盐缓冲液 pH7.6） 甘油
临用时，每100mL提取液中加： 溴酚蓝
25.32g 16.7mL 0.1g
染色液
2%联苯胺 10mL 抗坏血酸 35.2mg
0.6%H2O2 10mL
水
30mL
前沿指示剂
0.1%溴酚蓝
各种果蔬
pH 8.3
五、操作
1、贮液配制（已完成） 2、安装电泳槽（安装、封底）
聚丙烯酰胺凝胶常分为两大类，一类是 连续的凝胶，另一类为不连续的凝胶。前者 凝胶系统的pH值、凝胶孔径是均一的，电泳 过程中缓冲系统的离子强度及溶胶体系的各 部分电位梯度都是一致的。而后者则刚好相 反；前者电泳时只有电场和分子筛两种物理 效应，而后者除此外还有样品的浓缩效应， 故具更好的分离效果。
四、试剂与材料
A（分离胶缓冲液） 1mol/L HCL
Fra Baidu bibliotek
/100mL
Tris
48mL 36g
TEMED
24μL
B（浓缩胶缓冲液） 1mol/L HCL
/100mL
Tris
48mL 5.9g
TEMED
48μL
C（分离胶贮液） 丙烯酰胺
30g
/100mL
亚甲基双丙烯酰胺 0.8g
D（浓缩胶贮液） 丙烯酰胺
电泳槽系列DYCZ-24D
• 产品名称：迷你双垂直电泳槽 • 产品型号：DYCZ-24D • 产品售价: 1200元
产品说明： 高透明度聚碳酸脂注塑成型，品 质与进口产品相同。使用极其方便 可靠，绝不漏胶漏缓冲液。凝胶板 净面积82×82（mm），双板，可作 0.75、1、1.5（mm）胶（任选两 种），试样格10、15齿。 试样格（梳子） 1mm 10齿 2把 1mm 15齿 2把 1.5mm 10齿 2把 1.5mm 15齿 2把
1、实验材料 各种果蔬
2、仪器设备 分光光度计，研钵，恒温水浴锅，100mL容
量瓶，吸管，离心机等。
3、试剂 ⑴、0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH7.6） ⑵、反应混合液：
100mmol/L磷酸缓冲液（pH7.6）50mL于烧杯 中，加入愈创木酚28μL，于磁力搅拌器上加热搅拌， 直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧 化氢19μL，混合均匀，保存于冰箱中。
利用过氧化物酶能催化H2O2把联苯胺氧化成蓝 色或棕褐色产物的原理，将经过电泳后的凝胶置于 含有H2O2及联苯胺的溶液中染色，出现蓝色或棕褐 色部位即为过氧化物酶同工酶在凝胶中存在的位置， 多条有色带即构成过氧化物酶同工酶酶谱。
板栗
盘菜
三、器材
稳流稳压电泳仪； 冷冻离心机及离心管； 成套电泳槽； 微量进样器（50μL） 高速离心机（10 000r/min） 量筒：500mL，10mL，5mL（各×1） 烧杯：250mL×4 pH试纸； 其它常规用具（玻棒、大培养皿等）
膜具安装
膜具安装
装封胶条
将玻璃装进槽里
将楔子插进
灌胶
插梳子
胶凝后用夹子将玻璃夹出
用夹子夹紧玻璃将封胶条轻轻撕掉
旋转180度，凹玻璃向里
将玻璃放进槽内
加缓冲液
加样
剥胶
剥胶
切胶
将胶剥到染料中
电压的选择
两个电极之间距离 每厘米10伏电压，恒压
浓缩效应：样品通过浓缩胶时被浓缩成高浓 度的样品薄层，甚至能浓缩几百倍。其原因：
三、实验步骤
1、取上述样品提取液2.5mL，定容至50mL刻度，备 用（仅指萝卜与盘菜，冬枣，柚子与梨不稀释）。 2、取光径1cm比色皿2只，于1只中加入反应混合液 3mL和磷酸缓冲液1mL，作为对照，另1只中加入反 应混合液3mL和上述酶液1mL（如酶活性过高可稀释 之），立即开启秒表记录时间，于分光光度计上测量 波 长 470nm 下 吸 光 度 值 ， 每 隔 1min 读 数 一 次 （ 连 读 5min，取平均值）。
5、点样 将稀释10倍的电极缓冲液倒入两槽中，上槽
即加样槽（短板侧）缓冲液要求没过样品槽，下 槽（长板侧）缓冲液要求没过电极，备用。
用微量注射器（50μL）吸取少量样液，在浓 缩胶上层点样，点样量：
冬枣，柚子，梨：15、30、50μL 萝卜、盘菜：10、20、30μL 点样时须小心，防止样品液扩散。 向上槽液中滴加0.1%溴酚蓝2～3滴。
7、剥胶 取出胶板，去掉胶套，用微量注射器沿玻璃
内面注入一定量水后即可掀开玻璃，去掉浓缩胶 （注意先进行测量），将分离胶放入培养皿。
8、染色 将配制好的染色液倒入培养皿，室温下染色
1～10min后显示蓝色条带，后变红褐色。用去离 子水漂洗，并拍照记录。
9、记录酶谱，并计算各同工酶的迁移率（Rf值）
样品分子在上层大孔径的浓缩胶中快 速移动到小孔径的下层分离胶时，由于凝 胶孔径突然变小而移动速度大大减慢，使 之在浓缩胶与分离胶的界面处被浓缩成一 狭窄的区带，一齐进入分离胶，然后再进 行与连续凝胶电泳类似的电泳分离。
3、过氧化物酶同工酶凝胶电泳 过氧化物酶是植物体内的常见氧化酶。植物体
内许多生理代谢过程常与其活性及其同工酶的种类 有关。利用特异性颜色反应使待测酶着色，便可在 凝胶中展现出酶谱。
实验四
果蔬中过氧化物酶分析
生命与环境科学学院 生化组
㈠、过氧化物酶同工酶的分离 ——（PAGE法）
一、目的
1、了解聚丙烯酰胺凝胶的制作过程及结构 特点。
2、掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理及分离 过氧化物酶同工酶的电泳过程。
二、原理
1、聚丙烯酰胺凝胶的形成、结构及特性
聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 是 由 丙 烯 酰 胺 （ Acr ） 和N，N- 甲叉双丙烯酰胺（Bis）聚合而成的 大分子。凝结过程：过硫酸铵溶于水产生大 量自由基，引发Acr与Bis也形成自由基，在 四甲基乙二胺（TEMED）催化下这些自由 基之间进行反应而聚合成凝胶。聚丙烯酰胺 凝胶是具有立体（三维）网状结构的大分子。
3、制胶（分离胶、光聚合、浓缩胶） 拔出梳子，倒入电极缓冲液，备用。
4、过氧化物酶的提取 按下列比例称取果蔬： 冬 枣 ， 柚 子 ， 梨 ： 1:2 ； 萝 卜 、 盘 菜 ： 1:10
（W:V），剪碎，放入研钵中，加适量石英砂及 样品提取液于冰浴上研磨成匀浆，置于离心管中， 研钵用少量提取液清洗，洗液并入离心管，以 14000r/min的转速离心15min，取上清液贮存于低 温冰箱备用。
10g
/100mL
亚甲基双丙烯酰胺 2.5g
pH 8.9 pH 6.7 pH 8.9 pH 6.7
E 核黄素/100mL
核黄素 4mg
F 蔗糖/100mL
蔗糖
40g
电极缓冲液/100mL （用时稀释10倍）
Tris 甘氨酸
6g 28.8g
封板胶 （加热煮沸）
琼脂粉 电极液
1g 100mL
样品提取液
电泳开始后，由于快离子的泳动率最大， 在快离子后面就形成一个离子浓度低的区域， 即低电导区。电导与电势梯度是成反比的，低 电导区就产生了较高的电势梯度，这种高电势 梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动， 因而在高电势梯度区和低电势梯度区之间形成 一个迅速移动的界面。由于样品蛋白质的有效 泳动率恰好介于快、慢离子之间，所以也就聚 集在这个移动的界面附近，被浓缩成一狭小的 样品薄层。
浓缩胶用pH6.7的Tris-HCl缓冲液制成。电泳 时，由于HCl解离度大，几乎全部释放出Cl-，而 电泳槽中的Tris-甘氨酸缓冲液pH=8.3，因为甘氨 酸的等电点为6.0，在电泳过程中，它只有极少数 分子（1%～0.1%）解离成H2N-CH2-COO-。
一 般 酸 性 蛋 白 质 在 此 pH 下 也 解 离 为 带负电荷的离子，但其解离度比HCl小， 比甘氨酸大。这3种离子带有同性电荷， 在一定的电场作用下，它们的泳动率不同， 根据有效泳动率的大小，最大的称为快离 子，最小的称为慢离子。电泳开始时3种 凝胶中都含有快离子，只有电泳槽中的缓 冲液含有慢离子。
四、结果计算
以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即
以OD470/[min·g（鲜重）]表示之。也可以用每min
光密度（OD470）变化0.01为1个过氧化物酶活性单
位（u），即：
过氧化物酶活力 =
△OD470nm 0.01×t
×D
过氧化物酶比活力 =
△OD470nm 0.01×wt
×D
式中： ΔOD470——反应时间内吸光度的变化
点样点到酶带的距离 Rf = 点样点到溴酚蓝前沿的距离
＋
溴酚蓝前沿 酶带
－
×
点样点
㈡、过氧化物酶活性的测定
一、原理
在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创 木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在470nm处 有最大吸收，可用分光光度计测量470nm的吸光 度变化测定过氧化物酶活性。
二、实验材料、仪器设备与试剂
生物化学实验 第一部分
果蔬成分的生化分析
综合实验一：
果蔬成分的生化分析
实验一 果蔬中维生素C的定量测定（4学时） 实验二 果蔬中总糖及还原糖含量的测定（4学时） 实验三 果蔬中蛋白质含量的测定（4学时） 实验四 果蔬中过氧化物酶分析（12学时）
实验材料：
冬枣＋柚子——1～4组 梨（2个品种）——5～8组 盘菜＋萝卜 ——9～12组
2、聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 凝胶电泳具有一般电泳的电场效应，即
在一定pH的溶液中，样品分子由于解离或 吸附，使自身带一定的电量，在相同的电场 强度作用下，不同的样品分子因带不同的电 性和电量，电泳时具有不同的泳动速度，使 最终的迁移距离不同而分离。
凝胶电泳与其他电泳的重要区别是它除了有 电场效应外，还具分子筛效应：凝胶是一种立体 网状结构物质，样品分子在通过凝胶网孔时受到 摩擦力等的作用，其结果：体积小、且为圆球状 的样品分子受到的阻力较小，移动较快，而体积 大，形状不规则的样品分子受到的阻力较大，移 动较慢。因此，凝胶电泳不但从分子带电情况的 差别，而且还从分子大小、形状等方面的差别来 分离样品分子，具有很高的分辨力。
6、电泳 按上“－”下“＋”接好电源线（上槽即加
样槽为负极）。将电泳槽置于4℃冰箱（或接通 电泳槽水冷却系统）。打开电源开关，调节电流 到 10mA 左 右 ， 当 样 品 进 入 到 分 离 胶 后 加 大 到 30mA，维持恒流。待溴酚蓝指示剂下行到距胶 板末端1cm处，即可停止电泳。关闭电源，电泳 约3h。
蔗糖
（0.1mol/L磷酸盐缓冲液 pH7.6） 甘油
临用时，每100mL提取液中加： 溴酚蓝
25.32g 16.7mL 0.1g
染色液
2%联苯胺 10mL 抗坏血酸 35.2mg
0.6%H2O2 10mL
水
30mL
前沿指示剂
0.1%溴酚蓝
各种果蔬
pH 8.3
五、操作
1、贮液配制（已完成） 2、安装电泳槽（安装、封底）
聚丙烯酰胺凝胶常分为两大类，一类是 连续的凝胶，另一类为不连续的凝胶。前者 凝胶系统的pH值、凝胶孔径是均一的，电泳 过程中缓冲系统的离子强度及溶胶体系的各 部分电位梯度都是一致的。而后者则刚好相 反；前者电泳时只有电场和分子筛两种物理 效应，而后者除此外还有样品的浓缩效应， 故具更好的分离效果。
四、试剂与材料
A（分离胶缓冲液） 1mol/L HCL
Fra Baidu bibliotek
/100mL
Tris
48mL 36g
TEMED
24μL
B（浓缩胶缓冲液） 1mol/L HCL
/100mL
Tris
48mL 5.9g
TEMED
48μL
C（分离胶贮液） 丙烯酰胺
30g
/100mL
亚甲基双丙烯酰胺 0.8g
D（浓缩胶贮液） 丙烯酰胺