生化实验四--果蔬中过氧化物酶分析

5、点样 将稀释10倍的电极缓冲液倒入两槽中，上槽
即加样槽（短板侧）缓冲液要求没过样品槽，下 槽（长板侧）缓冲液要求没过电极，备用。
用微量注射器（50μL）吸取少量样液，在浓 缩胶上层点样，点样量：
冬枣，柚子，梨：15、30、50μL 萝卜、盘菜：10、20、30μL 点样时须小心，防止样品液扩散。 向上槽液中滴加0.1%溴酚蓝2～3滴。
三、实验步骤
1、取上述样品提取液2.5mL，定容至50mL刻度，备 用（仅指萝卜与盘菜，冬枣，柚子与梨不稀释）。 2、取光径1cm比色皿2只，于1只中加入反应混合液 3mL和磷酸缓冲液1mL，作为对照，另1只中加入反 应混合液3mL和上述酶液1mL（如酶活性过高可稀释 之），立即开启秒表记录时间，于分光光度计上测量 波 长 470nm 下 吸 光 度 值 ， 每 隔 1min 读 数 一 次 （ 连 读 5min，取平均值）。
生物化学实验 第一部分
果蔬成分的生化分析
综合实验一：
果蔬成分的生化分析
实验一 果蔬中维生素C的定量测定（4学时） 实验二 果蔬中总糖及还原糖含量的测定（4学时） 实验三 果蔬中蛋白质含量的测定（4学时） 实验四 果蔬中过氧化物酶分析（12学时）
实验材料：
冬枣＋柚子——1～4组 梨（2个品种）——5～8组 盘菜＋萝卜 ——9～12组
膜具安装
膜具安装
装封胶条
将玻璃装进槽里
将楔子插进
灌胶
插梳子
胶凝后用夹子将玻璃夹出
用夹子夹紧玻璃将封胶条轻轻撕掉
旋转180度，凹玻璃向里
将玻璃放进槽内
加缓冲液
加样
剥胶
剥胶
切胶
将胶剥到染料中
电压的选择
两个电极之间距离 每厘米10伏电压，恒压
浓缩效应：样品通过浓缩胶时被浓缩成高浓 度的样品薄层，甚至能浓缩几百倍。其原因：
3、制胶（分离胶、光聚合、浓缩胶） 拔出梳子，倒入电极缓冲液，备用。
4、过氧化物酶的提取 按下列比例称取果蔬： 冬 枣 ， 柚 子 ， 梨 ： 1:2 ； 萝 卜 、 盘 菜 ： 1:10
（W:V），剪碎，放入研钵中，加适量石英砂及 样品提取液于冰浴上研磨成匀浆，置于离心管中， 研钵用少量提取液清洗，洗液并入离心管，以 14000r/min的转速离心15min，取上清液贮存于低 温冰箱备用。
实验四
果蔬中过氧化物酶分析
生命与环境科学学院 生化组
㈠、过氧化物酶同工酶的分离 ——（PAGE法）
一、目的
1、了解聚丙烯酰胺凝胶的制作过程及结构 特点。
2、掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理及分离 过氧化物酶同工酶的电泳过程。
二、原理
1、聚丙烯酰胺凝胶的形成、结构及特性
聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 是 由 丙 烯 酰 胺 （ Acr ） 和N，N- 甲叉双丙烯酰胺（Bis）聚合而成的 大分子。凝结过程：过硫酸铵溶于水产生大 量自由基，引发Acr与Bis也形成自由基，在 四甲基乙二胺（TEMED）催化下这些自由 基之间进行反应而聚合成凝胶。聚丙烯酰胺 凝胶是具有立体（三维）网状结构的大分子。
四、结果计算
以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即
以OD470/[min·g（鲜重）]表示之。也可以用每min
光密度（OD470）变化0.01为1个过氧化物酶活性单
位（u），即：
过氧化物酶活力 =
△OD470nm 0.01×t
×D
过氧化物酶比活力 =
△OD470nm 0.01×wt
×D
式中： ΔOD470——反应时间内吸光度的变化
电泳开始后，由于快离子的泳动率最大， 在快离子后面就形成一个离子浓度低的区域， 即低电导区。电导与电势梯度是成反比的，低 电导区就产生了较高的电势梯度，这种高电势 梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动， 因而在高电势梯度区和低电势梯度区之间形成 一个迅速移动的界面。由于样品蛋白质的有效 泳动率恰好介于快、慢离子之间，所以也就聚 集在这个移动的界面附近，被浓缩成一狭小的 样品薄层。
利用过氧化物酶能催化H2O2把联苯胺氧化成蓝 色或棕褐色产物的原理，将经过电泳后的凝胶置于 含有H2O2及联苯胺的溶液中染色，出现蓝色或棕褐 色部位即为过氧化物酶同工酶在凝胶中存在的位置， 多条有色带即构成过氧化物酶同工酶酶谱。
板栗
盘菜
三、器材
稳流稳压电泳仪； 冷冻离心机及离心管； 成套电泳槽； 微量进样器（50μL） 高速离心机（10 000r/min） 量筒：500mL，10mL，5mL（各×1） 烧杯：250mL×4 pH试纸； 其它常规用具（玻棒、大培养皿等）
1、实验材料 各种果蔬
2、仪器设备 分光光度计，研钵，恒温水浴锅，100mL容
量瓶，吸管，离心机等。
3、试剂 ⑴、0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH7.6） ⑵、反应混合液：
100mmol/L磷酸缓冲液（pH7.6）50mL于烧杯 中，加入愈创木酚28μL，于磁力搅拌器上加热搅拌， 直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧 化氢19μL，混合均匀，保存于冰箱中。
7、剥胶 取出胶板，去掉胶套，用微量注射器沿玻璃
内面注入一定量水后即可掀开玻璃，去掉浓缩胶 （注意先进行测量），将分离胶放入培养皿。
8、染色 将配制好的染色液倒入培养皿，室温下染色
1～10min后显示蓝色条带，后变红褐色。用去离 子水漂洗，并拍照记录。
9、记录酶谱，并计算各同工酶的迁移率（Rf值）
w——植物鲜重（g） t——反应时间（min） D——稀释倍数，即提取的总酶液为反应体 系内酶液的倍数
电泳槽系列DYCZ-24D
• 产品名称：迷你双垂直电泳槽 • 产品型号：DYCZ-24D • 产品售价: 1200元
产品说明： 高透明度聚碳酸脂注塑成型，品 质与进口产品相同。使用极其方便 可靠，绝不漏胶漏缓冲液。凝胶板 净面积82×82（mm），双板，可作 0.75、1、1.5（mm）胶（任选两 种），试样格10、15齿。 试样格（梳子） 1mm 10齿 2把 1mm 15齿 2把 1.5mm 10齿 2把 1.5mm 15齿 2把
点样点到酶带的距离 Rf = 点样点到溴酚蓝前沿的距离
＋
溴酚蓝前沿 酶带
－
×
点样点
㈡、过氧化物酶活性的测定
一、原理
在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创 木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在470nm处 有最大吸收，可用分光光度计测量470nm的吸光 度变化测定过氧化物酶活性。
二、实验材料、仪器设备与试剂
蔗糖
（0.1mol/L磷酸盐缓冲液 pH7.6） 甘油
临用时，每100mL提取液中加： 溴酚蓝
25.32g 16.7mL 0.1g
染色液
2%联苯胺 10mL 抗坏血酸 35.2mg
0.6%H2O2 10m酚蓝
各种果蔬
pH 8.3
五、操作
1、贮液配制（已完成） 2、安装电泳槽（安装、封底）
10g
/100mL
亚甲基双丙烯酰胺 2.5g
pH 8.9 pH 6.7 pH 8.9 pH 6.7
E 核黄素/100mL
核黄素 4mg
F 蔗糖/100mL
蔗糖
40g
电极缓冲液/100mL （用时稀释10倍）
Tris 甘氨酸
6g 28.8g
封板胶 （加热煮沸）
琼脂粉 电极液
1g 100mL
样品提取液
2、聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 凝胶电泳具有一般电泳的电场效应，即
在一定pH的溶液中，样品分子由于解离或 吸附，使自身带一定的电量，在相同的电场 强度作用下，不同的样品分子因带不同的电 性和电量，电泳时具有不同的泳动速度，使 最终的迁移距离不同而分离。
凝胶电泳与其他电泳的重要区别是它除了有 电场效应外，还具分子筛效应：凝胶是一种立体 网状结构物质，样品分子在通过凝胶网孔时受到 摩擦力等的作用，其结果：体积小、且为圆球状 的样品分子受到的阻力较小，移动较快，而体积 大，形状不规则的样品分子受到的阻力较大，移 动较慢。因此，凝胶电泳不但从分子带电情况的 差别，而且还从分子大小、形状等方面的差别来 分离样品分子，具有很高的分辨力。
聚丙烯酰胺凝胶常分为两大类，一类是 连续的凝胶，另一类为不连续的凝胶。前者 凝胶系统的pH值、凝胶孔径是均一的，电泳 过程中缓冲系统的离子强度及溶胶体系的各 部分电位梯度都是一致的。而后者则刚好相 反；前者电泳时只有电场和分子筛两种物理 效应，而后者除此外还有样品的浓缩效应， 故具更好的分离效果。
样品分子在上层大孔径的浓缩胶中快 速移动到小孔径的下层分离胶时，由于凝 胶孔径突然变小而移动速度大大减慢，使 之在浓缩胶与分离胶的界面处被浓缩成一 狭窄的区带，一齐进入分离胶，然后再进 行与连续凝胶电泳类似的电泳分离。
3、过氧化物酶同工酶凝胶电泳 过氧化物酶是植物体内的常见氧化酶。植物体
内许多生理代谢过程常与其活性及其同工酶的种类 有关。利用特异性颜色反应使待测酶着色，便可在 凝胶中展现出酶谱。
浓缩胶用pH6.7的Tris-HCl缓冲液制成。电泳 时，由于HCl解离度大，几乎全部释放出Cl-，而 电泳槽中的Tris-甘氨酸缓冲液pH=8.3，因为甘氨 酸的等电点为6.0，在电泳过程中，它只有极少数 分子（1%～0.1%）解离成H2N-CH2-COO-。
一 般 酸 性 蛋 白 质 在 此 pH 下 也 解 离 为 带负电荷的离子，但其解离度比HCl小， 比甘氨酸大。这3种离子带有同性电荷， 在一定的电场作用下，它们的泳动率不同， 根据有效泳动率的大小，最大的称为快离 子，最小的称为慢离子。电泳开始时3种 凝胶中都含有快离子，只有电泳槽中的缓 冲液含有慢离子。
6、电泳 按上“－”下“＋”接好电源线（上槽即加
样槽为负极）。将电泳槽置于4℃冰箱（或接通 电泳槽水冷却系统）。打开电源开关，调节电流 到 10mA 左 右 ， 当 样 品 进 入 到 分 离 胶 后 加 大 到 30mA，维持恒流。待溴酚蓝指示剂下行到距胶 板末端1cm处，即可停止电泳。关闭电源，电泳 约3h。